云南省特色水果中多酚化合物含量和抗氧化性的比較

羅恒國，楊士花，李晴，羅瑜，黃勇樺，初雅潔，李淳，李永強*

1(云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明，650201) 2(云南農業大學 外語學院，云南 昆明，650201) 3(大理農林職業技術學院，云南 大理白族自治州，671003) 4(永平縣食品藥品檢驗檢測局，云南 永平，672660)

云南省特色水果中多酚化合物含量和抗氧化性的比較

羅恒國1，楊士花2，李晴1，羅瑜1，黃勇樺1，初雅潔3，李淳4，李永強1*

1(云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明，650201) 2(云南農業大學 外語學院，云南 昆明，650201) 3(大理農林職業技術學院，云南 大理白族自治州，671003) 4(永平縣食品藥品檢驗檢測局，云南 永平，672660)

選用6種云南特色水果，利用Folin-Ciocalteau法測定可溶性和鍵合多酚含量，通過DPPH自由基清除能力、過氧化氫清除能力、總抗氧化能力、鐵離子還原/抗氧化能力和還原能力測定其體外抗氧化活性，并對多酚含量和抗氧化活性進行比較。結果表明,香椿果中總多酚和鍵合多酚含量最高，分別達到(91.85±7.48)和(35.69±1.29) μmol FAE/g，與其他5種水果呈差異顯著(p<0.05)，雞嗉子果中可溶性多酚含量最高，達(60.28±7.98) μmol FAE/g，與其他水果呈差異顯著(p<0.05)。香椿果中鍵合多酚的還原能力、總抗氧化能力和過氧化氫清除能力最高，多依果中可溶性多酚的總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力最強，說明多酚化合物的抗氧化能力與水果品種、多酚含量和多酚種類存在一定關系。

云南??；特色水果；多酚；含量；抗氧化活性

云南植物資源豐富，具有植物王國的美稱[1-2]。由于其特殊的地理環境和氣候條件，野生水果種類繁多，產量較高。雞嗉子果(Dendrobenthamiacapitata)、青刺果(PrinsepiautilisRoyle)、蛇皮果(Salaccazalacca)、粗梗稠李(Padusnapaulensis)、香椿(Toonasinensis)、多依果(Docyniadelavayi)是云南省常見的野生特色水果[3-7]，不但含有碳水化合物、微量元素、維生素、有機酸等營養物質，而且富含膳食纖維、黃酮和多酚等功能成分，具有抗氧化、抗衰老、預防心血管疾病、糖尿病、增強機體免疫力等功能[8]。

植物多酚(plant polyphenols)是廣泛存在于植物體內的一類次生代謝物，具有較強的抗氧化以及清除自由基的能力[9-11]。多酚與纖維素、細胞壁多糖結合在一起形成鍵合多酚[12-15]。國內外大多數研究者主要研究了可溶性多酚，忽略了對鍵合多酚的研究。本研究通過提取分離可溶性和鍵合多酚，通過測定多酚含量和抗氧化能力，對青刺果、多依果、蛇皮果、粗梗稠李、雞嗉子果和香椿果進行較為系統的研究。

1 材料與方法

1.1實驗原料

云南省的特色水果：多依果購自云南省瀾滄本地農貿市場，粗梗稠李購買于云南臨滄本地農貿市場，雞嗉子果購買于云南省富源縣，青刺果購買于云南省曲靖市，蛇皮果、香椿果購買于玉溪市。

1.2實驗試劑

1,1二苯基-2-苦基肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)、Folin-Ciocalteu試劑、Trolox，sigam公司；三吡啶基三嗪(2,4，6-tris(2-pyridy1)-S-triazine, TPTZ)、2,2-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2-azinobis(3-ethylbenzothia-zoline)-6-sulfonate, ABTS)、三氯乙酸(TCA)、FeCl3、H2O2、FeSO4、抗壞血酸，上海晶純生化科技股份有限公司；阿魏酸、兒茶素，北京北納創聯生物技術研究院；其他試劑均為分析純。

1.3實驗器材

UV-1800CP紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；FA2004電子分析天平，沈陽龍騰電子有限公司；TDL-5-A離心機，上海安亭科學儀器廠；PHS-3E數字型pH計，上海精密科學儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1原料的預處理

新鮮雞嗉子果、多依果、香椿果、粗梗稠李、青刺果和蛇皮果洗凈，保鮮袋密封，放入-24 ℃冷藏備用。

2.2可溶性多酚和鍵合多酚的提取分離[16-18]

分別將上述6種水果研磨后，準確稱取1.0 g，用體積分數70%丙酮提取，離心得上清，為可溶性多酚化合物，殘渣加入4 mol/L NaOH溶液水解，用濃HCl調節pH值為2，離心后取上清液，用V(上清液)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙醚)=1∶1∶1萃取3次，合并有機相，真空旋轉蒸干，甲醇定容得到鍵合多酚化合物粗提液。

2.3多酚含量測定[16-18]

多酚含量采用Folin-Ciocalteau法測定，具體方法如下：吸取多酚化合物粗提液0.5 mL，加入0.5 mL Folin-Ciocalteau試劑，充分振蕩，加入飽和NaCO3溶液，補加蒸餾水至總體積至10 mL，充分混勻，室溫下避光反應35 min，于4 000 g離心10 min，取藍色上清液于725 nm下測定吸光度，用甲醇代替多酚粗提液作為空白。以阿魏酸為標準品建立回歸方程為：

y= 1.289x-0.003(R2=0.998 8)

(1)

式中：y為吸光度，x為阿魏酸濃度(μmol/L)，多酚含量以阿魏酸計，即每g樣品所含總多酚相當于阿魏酸的當量(μmol ferulic acid equivalents(FAE)/g)。

2.4抗氧化活性的研究

2.4.1 DPPH自由基清除能力測定[19-21]

分別取1 mL待測樣品，添加4 mL DPPH甲醇溶液，充分振搖后，在暗處反應10 min，然后在517 nm下進行比色測定，并根據標準曲線計算DPPH自由基的清除能力。利用阿魏酸繪制標準曲線，標準方程為：

y=451.75x+32.31(R2=0.998 7)

(2)

式中：y為DPPH自由基清除能力，x為阿魏酸濃度(μmol)，自由基清除能力表示為1 g樣品中阿魏酸的當量(μmol ferulic acid equivalents(FAE)/g)。

(3)

式中：s為0.5 mL 樣品粗提液加2 mL DPPH甲醇溶液；sb為0.5 mL 樣品粗提液加2 mL甲醇溶液；c為2.5 mL DPPH甲醇溶液；cb為2.5 mL甲醇溶液。

2.4.2 鐵離子還原/抗氧化能力測定(FRAP)[19-21]

FRAP溶液制備：準確吸取10 mL乙酸溶液(300 mmoL/L，pH 3.6)、l mL FeC13·6 H20(20 mmoL/L)和l mL TPTZ溶液(10 mmoL/L)，充分混勻，制備成FRAP溶液。

分別將樣品加入3 mL FRAP溶液充分混合，混勻后于37 ℃下放置，4 min后在593 nm測定吸光度。并根據標準曲線計算FRAP還原氧化能力。利用硫酸亞鐵繪制標準曲線，標準方程為：

y=6 240x+0.000 5(R2=0.998 4)

(4)

式中：y為吸光度，x為FeSO4的濃度(mmol/L)，還原力為每g樣品中Fe2+濃度當量(mmol Fe2+equivalents(FE)/g)。

2.4.3 總抗氧化能力測定(TEAC)[19-21]

ABTS+·工作液制備：將ABTS(17 mmoL/L)與過硫酸鉀(2.45 mmoL/L)2種溶液等體積混合，得到ABTS+·工作液。

分別取100 μL多酚粗提液加入3.8 mL ABTS+·工作液，室溫下放置6 min 后于734 nm測定吸光度，并根據標準曲線計算ABTS+·清除能力。利用Trolox繪制標注曲線，標準方程為：

y=103.95x+1.566 3(R2=0.998 4)

(5)

式中：y為ABTS+·清除率，x為Trolox的濃度(mmol/L)，自由基清除能力表示1 g樣品中Trolox的當量(μmol Trolox equivalents(TE)/g)。

(6)

式中：s為100 μL Trolox溶液+稀釋后的3.8 mL ABTS+·工作液；sb為100 μL Trolox溶液加 3.8 mL乙醇；c為稀釋后的3.8 mL ABTS+·工作液；cb為3.8 mL乙醇。

2.4.4 還原能力測定(RP)[19-21]

分別吸取1 mL多酚粗提液加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 6.6)，2.5 mL K3Fe(CN)6(10 g/L)溶液，充分混合后于50 ℃下反應20 min；加入10% TCA溶液，于4 000 g 離心10 min；取上清，加入2.5 mL去離子水和1 g/L FeCl3溶液，于700 nm測定吸光度，并根據標準曲線計算還原力。利用抗壞血酸繪制標準方程為：

y=0.080 1x+0.157 9(R2=0.991 6)

(7)

式中：y為吸光度、x為抗壞血酸濃度(μmol/L)。還原能力表示每g樣品中抗壞血酸的當量(μmol ascorbic acid equivalents(AAE)/g)。

2.4.5 過氧化氫(H2O2)清除能力測定[19-21]

分別取待測液0.6 mL，加入H2O2，然后加入45 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.4)，然后置于暗處在30 ℃下反應40 min，于230 nm測定吸光度，并根據標準曲線計算過氧化氫清除能力。利用阿魏酸繪制標準曲線，標準方程：

y=47.338x+32.772(R2=0.998 4)

(8)

式中：y為H2O2清除能力，x為阿魏酸濃度(μmol/L)，自由基清除能力表示為1 g樣品中阿魏酸當量(μmol ferulic acid equivalents(FAE)/g)。

(9)

式中：s為樣品中加入H2O2的磷酸緩沖溶液吸光度；sb為阿魏酸溶液中加入磷酸緩沖溶液的吸光度；c為含有H2O2的磷酸緩沖溶液的吸光度；cb為磷酸緩沖溶液的吸光度(調零)。

2.5統計分析

所有數據重復3次，采用SPSS 22.0軟件通過Tukey方法進行ANOVA統計分析。測量數據均以(平均值±標準偏差)表示。

3 結果與分析

3.1多酚含量的測定

由表1可以看出，6種水果中，總多酚含量最高的是香椿果，達到(91.85±7.48) μmol FAE/g，總多酚含量最低的是粗梗稠李，達到(0.49±0.016) μmol FAE/g。雞嗉子果中可溶性多酚含量達(60.28±7.98) μmol FAE/g，與青刺果、多依果、蛇皮果和粗梗稠李均存在差異顯著(p<0.05)；香椿果中鍵合多酚含量達(35.69±1.29) μmol FAE/g，與其他5種水果均存在差異顯著(p<0.05)。

除多依果外，其他5種水果中可溶性多酚和鍵合多酚均呈現差異顯著(p<0.05)，其中青刺果、雞嗉子果和香椿果中可溶性多酚含量大于鍵合多酚，蛇皮果和粗梗稠李中可溶性多酚含量小于鍵合多酚。

表1 6種水果中的多酚含量 單位：μmol FAE/g

注：表1中每行不同字母表示差異顯著(p<0.05)，每列不同數字表示差異顯著(p<0.05)。表2同。

3.2DPPH自由基清除能力

由表2可見，在6種水果中，多依果中可溶性多酚對DPPH自由基清除能力最強，達到(39.65±2.49) μmol FAE/g，與其他5種水果均存在差異顯著(p<0.05)，蛇皮果中鍵合多酚對DPPH自由基清除能力最強，達到(31.92±2.44) μmol FAE/g，與其他水果均存在差異顯著(p<0.05)。除香椿果外，其他5種水果中可溶性多酚和鍵合多酚對DPPH自由基清除能力均呈現差異顯著(p<0.05)，其中多依果、粗梗稠李和雞嗉子果中可溶性多酚對DPPH自由基清除能力大于鍵合多酚，青刺果和蛇皮果中可溶性多酚對DPPH自由基清除能力小于鍵合多酚。

表2 6種水果中多酚抗氧化能力

3.3鐵離子還原/抗氧化能力

6種水果中，青刺果中可溶性多酚對Fe3+還原能力最強(表2)，達到(135.51±16.10) mmol Fe2+/g，與其他5種水果均存在顯著差異(p<0.05)，多依果中鍵合多酚對Fe3+還原能力最強，達到(28.09±1.84) mmol FE/g，與其他水果均呈現顯著差異(p<0.05)。除粗梗稠李外，5種水果中可溶性和鍵合多酚對Fe3+還原能力均呈現顯著差異(p<0.05)，其中青刺果、多依果、蛇皮果和雞嗉子果中可溶性多酚對Fe3+還原能力大于鍵合多酚，香椿果可溶性多酚對Fe3+還原能力小于鍵合多酚。

3.4總抗氧化能力

6種水果中，多依果中可溶性多酚的總抗氧化能力最強(表2)，達(1 054.64±85.76) μmol TE/g，與其他5種水果均存在差異顯著(p<0.05)；香椿果中鍵合多酚的總抗氧化能力最強，可達(171.41±6.41) μmol TE/g。6種水果中可溶性和鍵合多酚均呈現差異顯著，且可溶性多酚的總抗氧化能力顯著大于鍵合多酚(p<0.05)。

3.5還原能力

6種水果中，雞嗉子果的可溶性多酚的還原能力最強(表2)，達(147.20±9.93) μmol AAE/g，與其他5種水果均存在差異顯著(p<0.05)；香椿果中鍵合多酚對RP還原能力最強，可達(122.50±9.45) μmol AAE/g，與其他5種水果均存在顯差異著(p<0.05)。除青刺果外，水果中可溶性和鍵合多酚的RP均有顯差異著，其中多依果、粗梗稠李和雞嗉子果中可溶性多酚的RP顯著高于鍵合多酚，蛇皮果和香椿果的RP顯著小于鍵合多酚。

3.6過氧化氫清除能力

6種水果中，粗梗稠李中可溶性多酚的過氧化氫清除能力最強(表2)，達(37.93±0.59) μmol FAE/g，與其他5種水果均存在差異顯著(p<0.05)；香椿果中鍵合多酚的過氧化氫清除能力最強，達到(15.34±6.24) μmol FAE/g，與青刺果、多依果、蛇皮果和雞嗉子果均存在差異顯著(p<0.05)。除蛇皮果外，其他水果中可溶性和鍵合多酚的過氧化氫清除能力均呈現差異顯著，其中青刺果、多依果、雞嗉子果和粗梗稠李中可溶性多酚的過氧化氫清除能力顯著大于鍵合多酚(p<0.05)，但香椿果中，鍵合多酚的過氧化氫清除能力顯著大于可溶性多酚(p<0.05)。

4 結論

提取分離了多依果、蛇皮果、粗梗稠李、雞嗉子果和香椿果中可溶性多酚和鍵合多酚，得到了可溶性多酚、鍵合多酚和總多酚的含量。香椿果中總多酚和鍵合多酚含量最高，分別達(91.85±7.48)和(35.69±1.29) μmol FAE/g，與其他5種水果均呈現差異顯著(p<0.05)；除多依果外，其他5種水果中可溶性多酚和鍵合多酚均呈現差異顯著(p<0.05)。

利用5種體外抗氧化活性測定體系對6種水果中多酚化合物進行了抗氧化活性測定，發現6種水果均具有較高的抗氧化活性。香椿果中鍵合多酚的還原能力、總抗氧化能力和過氧化氫清除能力最高，多依果中鍵合多酚的鐵離子還原/抗氧化能力最強，蛇皮果中鍵合多酚的DPPH自由基清除能力最強。多依果中可溶性多酚的總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力最強，青刺果中可溶性多酚的鐵離子還原/抗氧化能力最強，雞嗉子果中可溶性多酚的還原能力最強，粗梗稠李中可溶性多酚的過氧化氫清除能力最強。說明水果多酚的抗氧化能力與多酚含量、多酚種類和水果品種有一定的關系。

[1] 張福平, 張秋燕, 陳蔚輝, 等.野生水果資源的利用與保護[J].中國食物與營養, 2003,9(5):27-28.

[2] 朱薇, 程玉, 張秀英, 等.云南野生水果的抗氧化性及其他生理生化特性分析(Ⅰ)[J].中國南方果樹, 2014(5):66-69.

[3] 張曉鵬, 林曉明.青刺果油調節血脂及對人血小板體外聚集作用的影響[J].衛生研究, 2005, 34(1):79-81.

[4] 董彩虹, 聶發玉.香椿資源的研究、開發現狀[J].生物學雜志, 2002, 19(6):35-37.

[5] 字剛, 楊順麗, 何雷,等.雞嗉子葉化學成分研究[J].云南民族大學學報：自然科學版, 2011(6):443-446.

[6] 陳玉麗, 阮志鵬, 林麗珊, 等.香椿的化學成分及藥理作用研究進展[J].長治醫學院學報, 2008, 22(4):315-317.

[7] 李榮生, 尹光天, 曾炳山, 等.印度尼西亞蛇皮果的開發利用[J].林業實用技術, 2008(6):46-48.

[8] VISIOLI F, DE C A, ANDRES-LACUEVA C, et al.Polyphenols and human health:a prospectus[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2011, 51(6) 524.

[9] ADOM K K, LIU R H.Antioxidant activity of grains[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2002, 50(21):6 182-6 187.

[10] GUO W, BETA T.Phenolic acid composition and antioxidant potential of insoluble and soluble dietary fibre extracts derived from select whole-grain cereals[J].Food Research International, 2013, 51(2):518-525.

[11] CHANDRASEKARA A, SHAHIDI F.Content of insoluble antiproliferative potential and DNA scission inhibitory activity of phenolics from whole millet grains[J].Journal of Functional Foods, 2011, 3(3):159-170.

[12] VITAGLIONE P.Cereal dietary fibre:a natural functional ingredient to deliver phenolic compounds into the gut[J].Trends in Food Science & Technology, 2008, 19(9):451-463.

[13] CHANDRASEKARA A, SHAHIDI F.Content of insoluble bound phenolics in millets and their contribution to antioxidant capacity[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(11):6 706-6 714.

[14] CHANDRASEKARA A, NACZK M,SHAHIDI F.Effect of processing on the antioxidant activity of millet grains[J].Food Chemistry, 2012, 133(1):1-9.

[15] AK T, GüL?IN I.Antioxidant and radical scavenging properties of curcumin[J].Chemico Biological Interactions, 2008, 174(1):27-37.

[16] 陸洋, 楊士花, 黃佳琦, 等.老黑谷米中多酚化合物的提取及體外抗氧化活性研究[J].中國食物與營養, 2016, 22(8):53-57.

[17] DENG G F, XU X R, GUO Y J, et al.Determination of antioxidant property and their lipophilic and hydrophilic phenolic contents in cereal grains[J].Journal of Functional Foods, 2012, 4(4):906-914.

[18] AJILA C M, RAO U J S P.Mango peel dietary fibre:Composition and associated bound phenolics[J].Journal of Functional Foods, 2013, 5(1):444-450.

[19] 黃佳琦, 楊士花, 初雅潔, 等.老黑谷米色素的提取工藝優化及體外抗氧化活性分析[J].食品科學,2016，37(2):19-24.

[20] 張一鳴, 楊士花, 黃佳琦, 等.雞嗉子果色素提取工藝優化及體外抗氧化性[J].食品與發酵科技, 2016, 52(4):1-6.

[21] 黃佳琦, 楊士花, 張一鳴, 等.紫色馬鈴薯中多酚提取工藝的優化[J].中國食物與營養, 2016, 22(7):54-58.

ComparativestudyonthephenoliccontentsandantioxidantactivitiesoftypicalfruitsinYunnanprovince

LUO Heng-guo1, YANG Shi-hua2, LI Qing1, LUO Yu1, HUANG Yong-hua1, CHU Ya-jie3, LI Chun4, LI Yong-qiang1*

1(College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China) 2(College of Foreign Languages, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China) 3(Dali Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry, Dali 671003, China) 4(Yongping County’s Food and Drug Testing Institute, Yongping 672600, China)

The total phenolic contents and antioxidant activities of soluble polyphenol and insoluble bound polyphenol were determined in order to compare the differences among 6 kinds of selected fruits. The total phenolic content was determined by Folin-Ciocalteu method, the antioxidant activities were evaluated by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity, ferric reducing antioxidant power(FRAP), trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), reducing power (RP) and hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activityinvitro. Results showed that total polyphenol and insoluble bound polyphenol contents oftoonasinensiswere the highest (respectively 91.85±7.48 and 35.69±1.29 μmol FAE/g); the two fractions were significantly higher than others (p<0.05). Soluble polyphenol contents were the highest inDendrobenthamiacapitata( 60.28±7.98 μmol FAE/g), and was significantly higher than others (p<0.05).The reducing power (RP), hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity and trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) of insoluble bound polyphenols inToonasinensiswere the highest, the trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) and DPPH radical scavenging activity of soluble polyphenols ofDocyniadelavayiwere higher among 6 fruits. The results showed that the antioxidant capacity of polyphenol may be related to the variety of fruit, polyphenol content and phenolic compounds.

Yunnan province; characteristic fruits; polyphenol; contents; antioxidant activity

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014045

碩士研究生(李永強副教授為通訊作者，E-mail：liyongqiang7512@163.com)。

國家自然科學基金面上項目(31360378；31560428)；云南省自然科學基金項目(2013FB042)；云南省高校食品加工與安全控制重點實驗室項目(201401)；云南省教育廳大學生創新創業訓練計劃項目(2016106760032；2016106760033)

2017-02-13，改回日期：2017-03-14