黃酒及其原料中微量氰化物的測定

鄒偉,王棟,徐巖

(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室，食品安全與營養協同創新中心，江南大學生物工程學院釀造微生物及應用酶學研究室，江蘇 無錫，214122)

黃酒及其原料中微量氰化物的測定

鄒偉,王棟*,徐巖

(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室，食品安全與營養協同創新中心，江南大學生物工程學院釀造微生物及應用酶學研究室，江蘇 無錫，214122)

基于氰化物衍生化及LC-MS/MS聯用技術，建立了適用于黃酒及其原料中游離態氰化物及總氰化物測定的方法，該方法具有良好的準確度、精密度和靈敏度，檢出限為0.01 μg/L，相對標準偏差低于5%，回收率在93.6%～106.0%。利用該方法對不同黃酒及其釀造原料中的游離態和總氰化物的含量進行了分析檢測。結果表明，黃酒釀造原料大米和麥曲及黃酒中均含有微量氰化物。其中，麥曲氰化物含量相對較高，其游離態氰化物含量20.35～93.73 μg/L，總氰含量98.09～1 032.03 μg/L。黃酒中游離態氰化物的含量低于15 μg/L，總氰含量一般低于30 μg/L，表明在黃酒儲存和銷售過程中，氰化物可能不是影響黃酒氨基甲酸乙酯(EC)增加的主要因素。該研究結果為進一步明確黃酒中氰化物與EC的關系提供了技術手段和研究基礎。

黃酒；麥曲；氰化物；檢測

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)廣泛存在于發酵食品和飲料酒中，如葡萄酒、黃酒、蒸餾酒、醬油等[1]。由于其具有潛在的危害性，近年受到越來越多的重視。2007年國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)將EC定義為2A類致癌物質[2]。黃酒中EC含量較高[3]?？刂艵C的含量對于黃酒產業的發展至關重要。

飲料酒中EC的形成一般認為有2種途徑。在葡萄酒和清酒等發酵酒中，EC的形成主要由前體物質尿素及瓜氨酸等氨甲?；衔锱c乙醇反應生成[4]。尿素等前體物質主要來源于酵母代謝和原料[5-7]。而在蒸餾酒中，包括中國白酒[8]、威士忌、白蘭地、利口酒等[9-10]，EC主要由氰化物(cyanide，CN)與乙醇反應生成，而且氰化物轉化生成EC的速率相對較快[11]。氰化物作為EC形成的重要前體物質，主要來自于釀酒原料中的生氰糖苷(cyanogenic glycoside)。世界上有超過2 000種植物含有生氰糖苷[12]，它們經β-葡萄糖苷水解酶或者高溫酸解釋放出氰化物[13]。由于黃酒釀造原料中存在生氰糖苷[14-15]，黃酒中的EC除了主要由尿素形成外，釀造過程中氰化物的釋放也可能會增加EC的含量，目前尚未有明確的研究報道。

氰化物可分為游離態氰化物和結合態氰化物(如生氰糖苷)[16]。對于飲料酒中氰化物的測定較多針對蒸餾酒領域，常見的測定方法包括比色法、氣相色譜-氮磷檢測法(gas chromatography-nitrogen phosphorus detector,GC-NPD)、氣相色譜-質譜法(gas chromatography-mass spectrography,GC-MS)等[17-19]。國內外現行的蒸餾酒中氰化物測定方法是歐盟[20]及GB 5009.36—2016推薦的異煙酸-吡唑啉酮比色法[21]。但該方法定量限較高(0.015 mg/L)，易出現顏色干擾，難以滿足釀造酒中微量氰化物測定的要求。由于氰化物是一種對人體具有嚴重毒害作用的物質[22]，為滿足對氰化物準確定量的需要，近年來一些微量氰化物測定方法已用于血液[23]、環境[17]等樣品的檢測，但用于釀造酒中則少見報道。本研究基于氰根離子與2,3-萘基二縮醛(NDA)和?；撬嵋子诎l生衍生化反應生成一種苯環衍生物(N-substituted 1-cyanobenzoisoindole，CBI)的原理[24]，利用氰化物柱前衍生和液相色譜-二級質譜連用(liquid chromatography-mass spectrography/mass spectrography，LC-MS/MS)聯用，建立了黃酒及其原料中微量氰化物的測定方法。

1 材料和方法

1.1材料與試劑

1.1.1 實驗材料

麥曲、大米等黃酒釀造原料由浙江、江蘇等地黃酒釀造工廠提供，黃酒樣品為市售商品。

1.1.2 實驗試劑

乙腈，甲醇，磷酸：色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；無水乙醇，2,3-萘基二縮醛(NDA)，C13N15-氰化鉀：色譜純，上海百靈威；乙酸銨，?；撬幔荷V純，美國Sigma-Aldrich公司；氨水，硫酸，酒石酸，乙酸鋅，氫氧化鈉，氰化鉀：分析純，上海國藥集團。

1.2實驗儀器

Xevo TQ三重四級桿液質聯用儀(LC-MS/MS)、C18色譜柱(Acquity UPLC BEH 100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，美國Waters公司；Milli-Q超純水機，美國Millipore公司。

1.3實驗方法

1.3.1 黃酒樣品預處理

游離態氰化物預處理方法：參考文獻[24]的方法。在20 mL的頂空瓶中加入2 mL的黃酒樣品和10 μL質量濃度為1 mg/L的內標C13N15-氰化鉀標準品溶液，頂空瓶內放入1個裝有40 μL衍生劑(2.71 mmol/L用甲醇溶解的2,3-萘基二縮醛(NDA)溶液、50 mmol/L的?；撬崛芤?、甲醛和氨水體積比為25∶25∶45∶5的混合溶液)的1.5 mL的離心管。沿壁添加2 mL濃硫酸后立即密封頂空瓶。室溫下振蕩30 min，得到衍生后產物，進樣檢測游離氰化物含量。

總氰化物預處理：按參考文獻[21]的預處理方法。量取25 mL酒樣于250 mL蒸餾瓶中，加入100 mL超純水，將冷凝管下端插入盛有10 mL衍生劑(2.71 mmol/L用甲醇溶解的2,3-萘基二縮醛(NDA)溶液、50 mmol/L的?；撬崛芤?、甲醛和氨水體積比為25∶25∶45∶5的混合溶液)比色管的液面下。加入1～2 g酒石酸，迅速連蒸餾裝置進行水蒸氣蒸餾，收集蒸餾液約50 mL，然后用甲醇定容至50 mL，混合均勻，加入內標進行取樣檢測。

1.3.2 固體樣品預處理

游離態氰化物預處理方法：參照文獻[25]的方法。使用磷酸/25%乙醇溶液提取固體樣品中的氰化物，然后將提取液按照與1.3.1中黃酒游離態氰化物相同的方法進行處理。

總氰化物預處理方法：參照文獻[21]的方法。稱取20 g試樣于500 mL水蒸氣蒸餾裝置中，加水約200 mL，塞嚴瓶口，在室溫下放置2 h，然后加入20 mL乙酸鋅溶液和2.0 g酒石酸，迅速連接好裝置，將冷凝管下端插入盛有10 mL衍生劑(2.71 mmol/L用甲醇溶解的2,3-萘基二縮醛(NDA)溶液、50 mmol/L的?；撬崛芤?、甲醛和氨水體積比為25∶25∶45∶5的混合溶液)比色管的液面下。收集蒸餾液約50 mL，然后用甲醇定容至50 mL，混合均勻，加入內標進行取樣檢測。

1.3.3 樣品檢測

報道的檢測條件[24]，在本實驗條件下，主要對色譜分析中的流動相及洗脫程序和質譜檢測條件碰撞能量等進行了優化。從3種流動相(乙酸銨、乙腈；乙酸銨、甲醇；水、乙腈)中確定2 mmol/L乙酸銨和乙腈作為流動相，響應值最高；通過調整洗脫程序得到較好的峰形。優化后的具體條件如下。

色譜條件：色譜柱：Acquity UPLC BEH，100 mm×2.1 mm，1.7 μm；柱溫40 ℃；進樣量2 μL；流動相：A為2 mmol/L乙酸銨，B為乙腈，流速0.3 mL/min；流動相梯度洗脫程序如表1所示。

表1 流動相洗脫梯度

質譜條件：電離方式ESI(-)；多反應檢測掃描質譜模式；離子源溫度為150 ℃；碰撞能量30 eV；錐孔電壓25 V；毛細管壓力2 500 V。

1.3.4 標準曲線

將10 mg/L氰化鉀標準品儲備液稀釋成一系列質量濃度的標準液，取上述溶液各2 mL，按照與樣品相同的方法加入頂空瓶中進行衍生化處理。衍生物經LC-MS/MS檢測，將所測得的峰面積與同位素峰面積的比值作為縱坐標，氰化物CN質量濃度為橫坐標進行線性回歸分析，得到標準曲線方程(y=0.023 05x+0.116 16，R2=0.991 34)。

2 結果與分析

2.1氰化物測定方法的建立與評價

2.1.1 目標物定性分析

按照1.3.1的操作步驟對氰化物標準品和黃酒樣品進行衍生化操作，在優化的檢測條件下氰化物衍生物及其同位素衍生物的質譜圖如圖1所示，衍生后的產物CBI分子量為300，在設定的質譜條件下，負離子模式分別選擇離子對m/z299→191、m/z301→193和m/z299→81、m/z301→81作為定量離子對和定性離子對。

圖1 氰化物衍生物質譜圖Fig.1 Mass spectrum of CBI

按照1.3.3中的檢測條件，對氰化物標準品和黃酒酒樣進行分析，得到色譜圖結果如圖2所示。在本檢測條件下，衍生后的產物保留時間為2.21 min。且在MRM(Multi Reaction Monitoring，多反應檢測掃描)模式下，黃酒酒樣和標準品的衍生后產物峰形良好，無干擾。

2.1.2 方法的精密度

為評估衍生化及LC-MS/MS聯用測定黃酒及其原料中游離態和總氰化物方法的適用性，對該方法的

精確度、檢測限、準確性等指標進行了考察。首先對10 μg/L的標準氰化鉀溶液按照與樣品相同的處理方法及測定條件進行日內和日間6次測定，結果如表2所示。測定結果表明，該測定方法較為穩定，相對標準偏差在2%～4%之間，精確度達到實驗要求，具有較高重現性。

a-氰化鉀標準溶液；b-黃酒圖2 LC-MS/MS法測定氰化物衍生產物色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of CBI by LC-MS/MS

氰化物質量濃度/(μg·L-1)測定次數123456平均值/(μg·L-1)相對標準偏差/%日內10.2010.1610.409.8510.5010.2310.222.19日間10.4910.0410.2010.4110.619.5710.223.70

2.1.3 方法的檢測限和定量限

根據檢測限和定量限的常用計算方法[26]，當待測樣品的信號與空白基質噪音的比值為3，即S/N=3時的濃度為氰化物測定的檢測限；當待測樣品信號與空白基質噪音的比值為10，即S/N=10時的濃度為氰化物測定的定量限。在本研究條件下，通過測定不同氰化物濃度樣品，計算信噪比，可得氰化物測定的檢測限和定量限分別為0.01 μg/L和0.05 μg/L。由于MS/MS的應用，使得微量氰化物測定的靈敏性得到了很大的提高[27]。與已報道的分析方法相比[22]，本方法具有更低的檢測限。

2.1.4 乙醇含量的影響

由于黃酒是酒精飲料，為考察乙醇對該測定方法的影響，分別對乙醇體積分數不同(0、5%、10%、15%、20%)的10 μg/L氰化物CN溶液，按照與樣品相同的處理方法及測定條件進行測定，結果如圖3所示。不同乙醇體積分數對氰化物測定結果沒有顯著影響。因此，該方法可用于酒精飲料中氰化物的測定。

圖3 乙醇含量對測定的影響Fig.3 Effect of ethanol on determination of cyanide

2.1.5 方法的準確性

在此基礎上，進一步通過檢測回收率分別考察了該方法對于黃酒中游離態氰化物和總氰化物(含結合態)測定的準確性。

在游離態氰化物質量濃度為4.71 μg/L的黃酒樣品中，分別準確加入終濃度為2.5、10 μg/L的氰化物標準品，按照游離態氰化物測定的處理方法進行處理和分析，計算其回收率及相對標準偏差，結果如表3所示。添加不同質量濃度標準品的測定回收率分別為106.0%和93.6%，相對標準偏差為2.50%和5.61%，該方法對于黃酒中游離態氰化物的測定是準確的。

表3 游離態氰化物測定方法的準確度和回收率

在總氰化物質量濃度為24.0 μg/L的黃酒樣品中，分別準確添加終質量濃度為500、1 000和2 000 μg/L的蜀黍糖苷(理論上可以轉化生成41.6、83.2和166.4 μg/L的CN)，按照總氰化物測定的處理方法進行處理和分析，測定衍生化后的產物濃度，計算其回收率及相對標準偏差，結果如表4所示。結果表明，添加不同濃度結合態氰化物的測定平均回收率分別為89.9%、105.5%和89.7%，相對標準偏差也均在實驗要求范圍內。表明該方法對于黃酒中總氰化物(含結合態氰化物)的測定也是準確的。

表4 總氰化物測定方法的準確度和回收率

2.2黃酒不同釀造原料中氰化物的含量

利用上述氰化物測定方法，對不同來源用于黃酒釀造的大米、麥曲以及其他相關原料進行了游離態和總氰化物的測定，測定結果見表5。在所分析的黃酒釀造原料大米和麥曲中均含有微量的氰化物。其中大米中氰化物的含量較低，總氰化物含量在45 μg/kg以下，且主要是游離態氰化物，占總氰化物含量的54%以上。麥曲中游離態氰化物的含量為20.35～93.73 μg/kg，但總氰化物的含量相對較高，為98.09～1032.3 μg/kg，平均達到438.57 μg/kg。不同麥曲氰化物含量差異較大，而且麥曲中的氰化物主要以結合態為主，游離態氰化物所占比例較低。麥曲以小麥為主要原料，對小麥及其麩皮的氰化物含量測定結果表明，小麥中游離態氰化物的含量為15.32～42.05 μg/kg，總氰化物為63.02～168.95 μg/kg，而麩皮的氰化物含量相對較高，總氰化物的含量在96.94～828.77 μg/kg，說明小麥的總氰化物，特別是結合態氰化物，可能主要在麩皮中。黃酒釀造原料中，由小麥制得的麥曲中含有相對較高的總氰化物含量，在釀造過程中可能會分離出游離氰化物進而反應引起EC的增加，因此黃酒釀造對麥曲原料的選擇可能需引起注意。相關研究還需進一步進行。

表5 釀酒原料中的氰化物含量

2.3黃酒中氰化物的含量

利用本研究建立的氰化物測定方法，進一步對市售的不同黃酒樣品進行了測定分析，結果如表6所示。在所檢測的黃酒樣品中，均含有微量游離態氰化物，但含量低于15 μg/L，總氰化物絕大部分在30 μg/L以下。美國環保署和世界衛生組織對飲用水中氰化物的限量標準分別是200 μg/L[28]和70 μg/L[29]，黃酒中氰化物的含量遠低于飲用水限量標準。由于黃酒產品中的氰化物含量較低，可以認為氰化物對于黃酒貯存過程中EC的增加沒有顯著影響。

表6 黃酒中氰化物的含量

3 結論

為考察氰化物對黃酒EC形成可能的影響，本研究基于氰化物衍生化及LC-MS/MS聯用技術，建立了適用于黃酒及其原料中游離態氰化物及總氰化物測定的方法。該方法具有檢測限低、準確度與精密度良好等特點，適用于黃酒中游離態氰化物及總氰化物的檢測。利用該方法對不同黃酒及其釀造原料中的游離態和總氰化物含量的分析檢測結果表明，黃酒及釀酒原料中存在微量氰化物。黃酒釀造主要原料大米的氰化物含量相對較低，麥曲中總氰化物含量較高，主要是結合態氰化物。而且不同麥曲氰化物含量差異較大，制曲時需要注意對小麥原料的選擇。大量麥曲的使用可能會對黃酒釀造過程中EC的形成產生影響。黃酒中氰化物含量較低，對于黃酒貯存過程中EC的增加可能沒有顯著影響。研究結果為進一步明確黃酒中氰化物與EC的關系提供了技術手段和研究基礎。

參考文獻

[1] WEBER J V,SHARYPOV V I.Ethyl carbamate in foods and beverages:a review[J].Environmental Chemistry Letters,2009,7(3):233-247.

[2] TANG A S P,CHUNG S W C,KWONG K,et al.Ethyl carbamate in fermented foods and beverages:dietary exposure of the Hong Kong population in 2007-2008[J].Food Additives & Contaminants Part B-Surveillance,2011,4(3):195-204.

[3] WU Pin-gu,PAN Xiao-dong,WANG Li-yuan,et al.A survey of ethyl carbamate in fermented foods and beverages from Zhejiang,China[J].Food Control,2012,23(1):286-288.

[4] STEVENS D F,OUGH C S.Ethyl carbamate formation-reaction of urea and citrulline with ethanol in wine under low to normal temperature conditions[J].American Journal of Enology and Viticulture,1993,44(3):309-312.

[5] WANG Pei-hong,SUN Jun-yong,LI Xiao-min,et al.Contribution of citrulline to the formation of ethyl carbamate during Chinese rice wine production[J].Food Additives & Contaminants Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess,2014,31(4):587-592.

[6] ARENA M E,SAGUIR F M,DE NADRA M C M.Arginine,citrulline and ornithine metabolism by lactic acid bacteria from wine[J].International Journal of Food Microbiology,1999,52(3):155-161.

[7] LIU SQ P G,HARDMAN M,PILONE G.Citrulline production and ethyl carbamate(urethane) precursor formation from arginine degradation by wine lactic acidBacterialeuconostocoenosandLactobacillusbuchneri[J].American Journal of Enology and Viticulture,1994,45(2):235-242.

[8] LIU Y P,DONG B,QIN Z S,et al.Ethyl carbamate levels in wine and spirits from markets in Hebei province,China[J].Food Additives & Contaminants Part B-Surveillance,2011,4(1):1-5.

[9] MACKENZIE W M,CLYNE A H,MACDONALD L S.Ethyl carbamate formation in grain based spirits:part Ⅱ the identification and determination of cyanide related species involved in ethyl carbamate formation in scotch grain whisky[J].Journal of the Institute of Brewing,1990,96(4):223-232.

[10] HASHIGUCHI T,HORII S,IZU H,et al.The concentration of ethyl carbamate in commercial ume (prunus mume) liqueur products and a method of reducing it[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2010,74(10):2 060-2 066.

[11] TAKI N,IMAMURA L,TAKEBE S,et al.Cyanate as a precursor of ethyl carbamate in alcoholic beverages[J].Japanese Journal of Toxicology and Environmental Health,1992,38(6):498-505.

[12] FRANCISCO I A,PINOTTI M H P.Cyanogenic glycosides in plants[J].Brazilian Archives of Biology and Technology,2000,43(5):487-492.

[13] AKAZAWA T,MILJANICH P,CONN E E.Studies on cyanogenic glycoside of sorghum vulgare[J].Plant physiology,1960,35(4):535-538.

[14] EBBS S D,KOSMA D K,NIELSON E H,et al.Nitrogen supply and cyanide concentration influence the enrichment of nitrogen from cyanide in wheat (TriticumaestivumL.) and sorghum (SorghumbicolorL.)[J].Plant Cell Environ,2010,33(7):1 152-1 160.

[15] JONES D A.Why are so many food plants cyanogenic?[J].Phytochemistry,1998,47(2):155-162.

[16] COOKE R D.An enzymatic assay for the total cyanide content of cassava (ManihotesculentaCrantz)[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,1978,29(4):345-52.

[17] MARTON D,TAPPARO A,DI MARCO V B,et al.Ultratrace determination of total and available cyanides in industrial wastewaters through a rapid headspace-based sample preparation and gas chromatography with nitrogen phosphorous detection analysis[J].Journal of Chromatography A,2013,1 300:209-216.

[18] 閻冠洲,鐘其頂,李國輝,等.頂空氣相色譜測定白酒中氰化物方法研究[J].釀酒科技,2013(3):89-92.

[19] 張建,蘇利進,李凱,等.GC-MS定性/HS-20頂空結合GC定量測定酒中痕量氰化物[J].釀酒科技,2014(7):105-108.

[20] OFFICIAL JOURNAL OF THE EUROPEAN COMMUNITIES.Commission regulation 99/4/EC Determining community methods for the analysis of wines[S].Brussels,1999.

[21] 國家質量監督檢驗檢疫總局.GB 5009.36—2016食品安全國家標準食品中氰化物的測定[S].北京:中國標準出版社,2016.

[22] MA J,DASGUPTA P K.Recent developments in cyanide detection:a review[J].Analytica Chimica Acta,2010,673(2):117-125.

[23] LOGUE B A,KIRSCHTEN N P,PETRIKOVICS I,et al.Determination of the cyanide metabolite 2-aminothiazoline-4-carboxylic acid in urine and plasma by gas chromatography-mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2005,819(2):237-244.

[24] TRACQUI A,RAUL J S,GERAUT A,et al.Determination of blood cyanide by HPLC-MS[J].Journal of Analytical Toxicology,2002,26(3):144-148.

[25] BRIEN G M,TAYLOR A J,POULTER N H.Improved enzymic assay for cyanogens in fresh and processed cassava[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,1991,56(3):277-289.

[26] MILLER J N.Basic statistical-methods for analytical-chemistry.Part 2.Calibration and regression methods[J].Analyst,1991,116(1):3-14.

[27] KANG H I,SHIN H S.Ultra-sensitive determination of cyanide in surface water by gas chromatography-tandem mass spectrometry after derivatization with 2-(dimethylamino)ethanethiol[J].Analytica Chimica Acta,2014,852:168-173.

[28] UNITED STATES ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (EPA),Methods for chemicalanalysis of water and wastes[DB/CD].http://www.epa.gov/ogwdw000/contaminants/basicinformation/cyanide.html,2010.

[29] WORLDHEALTH ORGANIZATION.Guidelines for Drinking-Water Quality,3rd[DB/CD].http://www.who.int/water sanitation health/ dwq/fulltext,2008.

DeterminationoftracecyanidesinChinesericewineanditsrawmaterials

ZOU Wei,WANG Dong*,XU Yan

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education Synergetic Innovation Center for Food Safety and Nutrition Laboratory of Brewing Microbiology and Applied Enzymology,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

A LC-MS/MS method coupled with cyanide derivatization was applied to the determination of free and total cyanide (CN) inHuangjiu(Chinese rice wine) and its raw materials. This method was precise, accurate and sensitive. Under the established conditions, the limit of detection LOD was 0.01 μg/L, the relative standard deviation RSD was less than 5% and the recovery was 93.6%-106.0%, respectively. Using this method, free and total cyanide were detected inHuangjiuand raw materials, and trace cyanides were found. A rather higher concentration of cyanides was detected in the raw material wheatQu, with a concentration range of 20.35-93.73 μg/L for the free cyanide and 98.09-1 032.03 μg/L for the total cyanide. Free cyanide and total cyanide inHuangjiuwere lower than 15 μg/L and 30 μg/L, respectively. This result suggested that cyanide might not be an important factor to increase the formation of ethyl carbamate during the storage and sale ofHuangjiu. This work provided an efficient analytical method and a basis for further studying the relationship between ethyl carbamate and cyanide inHuangjiu.

Huangjiu(Chinese rice wine); wheatQu; cyanide; determination

碩士研究生(王棟副教授為通訊作者，E-mail:dwang@jiangnan.edu.cn)。

國家重點研發計劃項目(No.2016YFD0400503)；國家高技術研究發展計劃(863計劃，2013AA102108)；江蘇省高校品牌特色專業建設工程(No.PPZY2015A056)

2017-03-03，改回日期：2017-05-03

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014209