酵素食品微生物指標與主要功效酶及有機酸分析

張夢梅，劉芳，胡凱弟，胡露，劉金霞，張美佳，劉書亮,2*

1(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014) 2(四川農業大學 食品加工與安全研究所，四川 雅安，625014)

酵素食品微生物指標與主要功效酶及有機酸分析

張夢梅1，劉芳1，胡凱弟1，胡露1，劉金霞1，張美佳1，劉書亮1,2*

1(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014) 2(四川農業大學 食品加工與安全研究所，四川 雅安，625014)

為了解不同原料自然發酵酵素食品中微生物組成，評價市售酵素食品的理化指標、微生物指標、主要功效酶活力和有機酸組成，對23份發酵期酵素樣品進行酵母菌數、乳酸菌數和醋酸菌數測定，對4種市售酵素食品進行總酸、可溶性固形物含量、微生物指標及蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、超氧化物歧化酶活力測定，并采用高效液相色譜法對其有機酸的種類及含量進行分析。結果表明，發酵期酵素中廣泛存在酵母菌、乳酸菌和醋酸菌；市售酵素食品的功效酶活力偏低，主要有機酸為草酸、蘋果酸、乳酸和乙酸。結論：市售酵素食品質量參差不齊，功效酶活力較低，與其宣傳功效不符。該研究為了解酵素食品品質、正確看待酵素食品提供了數據參考。

酵素食品；微生物；酶活；有機酸

酵素，實際上是“酶”的舊譯，是由生物體產生的具有催化活性的大分子，參與人體新陳代謝、機體免疫和組織修復等生命活動。酵素食品是指以一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、藥食同源中草藥等為原料，經多種有益菌發酵而成的功能性產品，含有豐富的酶、維生素、礦物質和次生代謝產物等營養成分[1]。具有改善腸胃功能[2-3]、增強機體免疫力[4]、美白抗衰[5]等功能。酵素食品的原料豐富，產品種類多樣，如酵素原液、酵素粉、酵素片、酵素飲料等。近年來，學者對酵素的發酵工藝和酵素食品的抗氧化性進行了較多研究。酵素食品發酵工藝有自然發酵和人工接種發酵兩種，人工接種發酵根據發酵劑的不同可以分為單一菌種發酵[6]和多菌混合發酵[7]。酵素食品普遍具有較好的抗氧化性，發酵過程中抗氧化性能總體呈現上升趨勢[8]。

酵母菌、乳酸菌和醋酸菌為發酵食品中的常見微生物，三者之間共同作用可以形成獨特風味。如民間傳統茶飲料“紅茶菌”即是由酵母菌、乳酸菌和醋酸菌組成的共生體系將糖和茶葉發酵而成[9]；食醋的釀造也是常見的多菌發酵體系。酶活是酵素的主要質量指標，蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是酵素類食品的主要功效酶。其中SOD酶活性是評價酵素品質優劣的重要指標之一，也是各品牌在保健功效上的宣傳重點。有機酸是大分子化合物的代謝產物，在發酵食品香味的形成中起著重要作用[10]。近年來關于酵素食品中有機酸成分的研究鮮見報道，僅蔣增良[11]對葡萄酵素、藍莓酵素、樹莓酵素中有機酸的種類及含量進行了分析，ARUN等[12]測定了環保酵素不同發酵階段的有機酸含量，酵素食品中有機酸來源于果蔬原料及有益菌的代謝產物。

本研究分析了不同原料的酵素發酵期的微生物組成，對國內市售的4種不同品牌、不同原料的液體酵素進行了理化指標、微生物指標、主要功效酶活性測定和有機酸成分分析，對液體酵素產品質量進行了初步評價，以期為液體酵素食品品質研究提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

發酵期酵素1～23號(發酵時間約為30～180 d)；市售酵素A、B、C、D。

表1 發酵期酵素原料

表2 市售酵素原料

1.2試劑與儀器

1.2.1 培養基

孟加拉紅培養基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯，杭州微生物試劑有限公司。

乳酸菌固體培養基(MRS)：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖20.0 g，K2HPO42.0 g，MgSO40.58 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，牛肉膏10.0 g，MnSO40.25 g，吐溫80 2.0 g，乙酸鈉5.0 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 6.0～6.4。

醋酸菌固體培養基：酵母膏10.0 g，葡萄糖10.0 g，CaCO315.0 g，瓊脂20.0 g，水1 000 mL，使用前添加30 mL無水乙醇。

平板計數培養基(PCA)：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸膏2.5 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂15.0 g，水1 000 mL，pH 6.8～7.2。

以上培養基均于121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 試劑

氫氧化鈉、鹽酸、福林試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、乳酸、乳酸鈉、標準酪蛋白、L-酪氨酸、聚乙烯醇、橄欖油、乙醇、磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉、碘、碘化鉀、可溶性淀粉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、鄰苯三酚：分析純，成都市科龍化工試劑廠；酚酞：分析純，成都化學試劑廠；三羥甲基氨基甲烷，分析純：北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈：色譜純，瑞典Oceanpak公司。

有機酸標準品：L-蘋果酸(純度≥99%)，美國Sigma公司；檸檬酸(純度≥99.5%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乳酸、乙酸、琥珀酸、草酸、酒石酸(純度≥99.5%)，天津市光復精細化工研究所。

1.2.3 儀器與設備

CPA225D型精密天平，德國Sartorius公司；UV-1800PC型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；VBR90A手持折光儀，杭州匯爾儀器設備有限公司；LC-2010C HT液相色譜儀，日本Shimazu公司，配可變波長紫外檢測器(UV)；LC-Solution工作站，日本Shimazu公司；Milli-Q Gradient超純水儀，美國Millipore公司；Sorvall ST 16R冷凍離心機，美國Termo Fisher Scientific公司；SCIENTZ-09無菌均質器，寧波新芝生物科技有限股份有限公司；Sep-Pak C18固相萃取小柱，美國Waters公司。

1.3方法

1.3.1 理化指標測定

總酸：參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，采用酸堿滴定法，以乳酸計。每個樣品重復測定3次。

可溶性固形物：取1 mL樣品經蒸餾水稀釋后采用VBR90A手持折光儀測定可溶性固形物含量。

1.3.2 微生物指標分析

菌落總數：參照GB 4789.2—2010；酵母菌、霉菌數：參照GB 4789.15—2010；乳酸菌數：參照GB 4789.35—2010；醋酸菌數：將樣品梯度稀釋，選擇適宜梯度吸取0.1 mL液體涂布于醋酸菌固體培養基，30 ℃培養48 h后計數；大腸菌群：參照GB 2789.3—2010。

1.3.3 酶活性測定

酵素樣品原液經4 000 r/min離心10 min，取上清液進行主要功效酶活力測定。

蛋白酶活力：采用福林酚法測定，參照GB/T 23527—2009。

脂肪酶活力：采用滴定法測定，參照GB/T 23535—2009。

α-淀粉酶活力：參照GB/T 24401—2009。

SOD酶活力：采用修改的Marklund方法，參照GB/T 5009.171—2003。

1.3.4 有機酸測定

1.3.4.1 有機酸標準溶液的配制

測定酵素食品中草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸、乙酸的含量。按表3配制有機酸標準品混合溶液，并分別取2、10、50、75、100 μL，定容至1 mL，配制成不同質量濃度的混合標液，用0.45 μm水相微孔濾膜過濾后，用HPLC分析獲得各種有機酸的線性方程。

表3 有機酸標準品溶液的配制

1.3.4.2 樣品處理

取一定體積的酵素樣品以10 000 r/min離心10 min[13]。取上清液稀釋10倍后過0.45 μm水相微孔濾膜[13]，取5 mL濾液以1 mL/min流速流經C18固相萃取小柱(使用前預先用5 mL甲醇活化，再用等量超純水平衡)除去色素干擾物，棄去初濾液，收集3 mL續濾液供HPLC分析，做3次重復[14-15]。

1.3.4.3 色譜條件

色譜柱：Sepax HP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：18 ℃；流動相：5%乙腈-95% 0.05 mol/L KH2PO4(用磷酸調至pH 2.5)；流速：0.6 mL/min；進樣量：10 μL；紫外檢測器波長：210 nm，得到的7種有機酸混合標準品的色譜圖如圖1所示，所測的7種有機酸的相關系數均大于0.990(表4)。

1-草酸；2-酒石酸；3-蘋果酸；4-乳酸；5-乙酸；6-檸檬酸；7-琥珀酸圖1 7種有機酸標準樣品色譜分離圖Fig.1 The standard map of 7standard organic acid

有機酸線性范圍/(mg·mL-1)線性方程相關系數R2草酸0.025～0.250y=1.0×107x+649090.9997酒石酸0.250～2.500y=2.0×106x+310980.9994蘋果酸0.150～1.500y=916346x+218280.9978乳酸0.250～2.500y=651568x+158680.9960乙酸0.300～3.000y=544790x+121690.9994檸檬酸0.150～1.50y=1.0×106x+145040.9992琥珀酸0.150～1.500y=670041x+3598.10.9987

2 結果與分析

2.1酵素微生物指標分析

取發酵中不同原料酵素樣品1～23號進行酵母菌、乳酸菌及醋酸菌計數。由表1及表5可知，樣品1～11主要原料為蔬菜，多數樣品中含有極少的乳酸菌；12～13主要原料為水果，微生物以酵母菌為主；14～20主要原料為藥用植物，樣品中含有較多的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌；21～23為蔬菜、水果、藥用植物兩兩混合發酵樣品，均含有一定數量的酵母菌和醋酸菌，樣品間乳酸菌數量差異較大。除樣品1、8、14外均含有一定數量的酵母菌，大部分樣品含有乳酸菌和醋酸菌。樣品5、7、13的發酵體系中微生物以酵母菌為主，基本無乳酸菌、醋酸菌。樣品1、2、9的主要原料均為西胡瓜、黃瓜、萵筍，醋酸菌為該發酵體系中的主要微生物。微生物組成以酵母菌為主可能會使產品中乙醇含量過高、酸度過低，影響產品風味且存在一定安全隱患。樣品15、18、19為發酵時間不同的趕黃草酵素，可以看出在發酵過程中酵母菌數、乳酸菌數和醋酸菌數的數量級發生變化，3者間此消彼長。

表5 發酵期酵素中酵母菌、乳酸菌和醋酸菌數

2.2市售酵素總酸及可溶性固形物含量情況

測定4種市售酵素樣品的總酸和可溶性固形物含量，結果見表6。樣品D的總酸含量最高，為37.15 g/kg；樣品C的總酸含量最低，僅為6.78 g/kg。樣品C的可溶性固形物含量最高，為58.0%，而樣品B的可溶性固形物含量僅為4.8%?？扇苄怨绦挝锓从沉藰悠分心苋苡谒幕衔锏目偡Q，包括可溶性糖類和可溶性蛋白質等。樣品B可溶性固形物含量較低可能是由于發酵原料單一，且與原料本身及加糖量有關。

表6 市售酵素的總酸及可溶性固形物含量

2.3市售酵素微生物指標

市售酵素微生物檢測結果見表7。樣品A菌落總數、酵母菌數較多，分別為1.5×103CFU/mL和4.5×105CFU/mL。樣品D菌落總數和酵母菌數均小于1。4個樣品均無霉菌、大腸菌群檢出。若以GB 7101—2015《飲料》中規定的微生物限量為衡量標準，僅樣品D的微生物指標合格。

表7 市售酵素微生物檢測結果

2.4市售酵素主要功效酶活性情況

對市售酵素樣品A、B、C、D蛋白酶活力、脂肪酶活力、α-淀粉酶活力及SOD酶活力進行測定。結果見表8，樣品A、B、C、D的蛋白酶活力分別為8、1、1、3 U/mL。結果表明，這4種酵素具有一定的蛋白酶活性，但活力較低。樣品C的脂肪酶酶活力為2 U/mL，其余3種樣品均無脂肪酶活力。4種樣品均無α-淀粉酶活力。樣品D的酶活力為41.7 U/mL，其余樣品無SOD酶活力。表明樣品D具有一定清除自由基的能力。

表8 市售酵素功效酶活力

注：“-”表示無相應酶活力。

2.5市售酵素有機酸組成

由表9可知，不同原料的酵素中有機酸的組成和含量差異較大，但4種酵素樣品中均含有草酸、蘋果酸、乳酸和乙酸。樣品A有機酸以草酸、蘋果酸、乳酸和乙酸為主，樣品B有機酸以蘋果酸、乳酸和乙酸為主，樣品C以草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸和檸檬酸為主，樣品D中則含有所檢測的7種有機酸。有機酸種類與含量的差異可能與原料、發酵方式、發酵環境、微生物組成等多種因素有關。由產品標簽可知，樣品A、B分別由單一蔬菜、藥材自然發酵而成；樣品C由52種蔬果及食用菌經自然發酵而成，樣品D以24種綜合草本蔬果為原料，采用多種乳酸菌為菌種發酵而成。

表9 四種酵素樣品中有機酸的含量

注：-表示未檢出。

3 討論與結論

本文對自然發酵酵素中的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌數量進行了檢測，發現多數樣品中均存在該三類微生物，但數量存在差異。說明酵素自然發酵過程中廣泛存在酵母菌、乳酸菌和醋酸菌，結果與陳英等[16]一致，它們的存在對風味物質的形成有促進作用[17]。而樣品中酵母菌、乳酸菌和醋酸菌數量上的差異則與原料表面攜帶的微生物及樣品發酵環境有關。

本文對4種市售酵素中的有機酸進行了分析，不同樣品中有機酸的種類與含量不同，但均含有草酸、蘋果酸、乳酸和乙酸，其中樣品D的有機酸種類最為豐富。酵素中有機酸的形成除與原料有關外，主要來源于微生物以及各物質之間的相互轉化。乳酸的生成可能是由于發酵體系中乳酸菌的存在。在蘋果酸-乳酸發酵(MLF)[18-19]作用下，乳酸菌能將蘋果酸轉化成為乳酸和CO2。研究表明，乙酸的生成源于乳酸氧化而不是乳酸菌的糖代謝(乳酸氧化生成乙酸)[20]。大多數酵母菌可以利用高濃度的蘋果酸[21]。

與火龍果酵素[22]及核桃青皮果蔬酵素[23]相比，A、B、C、D四個樣品中主要功效酶活性均偏低?？赡苁怯捎谀承┙退禺a品在殺菌過程中采用高溫，致使酶失去活性，對于要求無菌的酵素產品可以更改殺菌方式，如采用超濾除菌[23]、巴氏滅菌[24]等方式。另一方面，原料種類及比例對酶活性也有一定影響，可以對配方進行優化以達到提高酶活性的目的。劉敏等[25]研究發現，不同配方發酵的酵素產品中的蛋白酶活力、纖維素酶活力、脂肪酶活力、總酸含量、ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力不同。楊靖娟等[26]利用D-最優混料設計試驗法研究了配方中各原料不同組合對酵素酶活及活性成分含量等主要品質指標的影響，在最優配方組合基礎下得到的酵素產品蛋白酶活力為293.04 U/g，SOD酶活力為57.00 U/g。

從結果可以發現，選擇的4種市售酵素功效酶含量并不高，與產品宣傳不符。酵素產品的保健功效還需要經過更全面、更嚴謹的評價。目前，國內還沒有酵素的明確歸類及相關國家標準、行業標準，缺乏審查細則，導致產品質量參差不齊，無法規范管理酵素市場，難以保證產品質量。若按《GB/T 10789—2015飲料通則》對液體酵素產品進行分類，以水果、蔬菜為原料的產品可歸為發酵果蔬汁飲料(按照GB/T 31121—2014執行)，以食用菌為原料的產品可歸為植物飲料(按照GB/T 31326—2014執行)，實際生產中產品原料多結合了果蔬、食用菌、藥食源中草藥，且聲稱具有特定保健功能，因此也可歸為其他類飲料。不同的分類導致酵素難以有統一的生產標準及質量標準。因此，酵素產品的歸類和相關標準將直接影響酵素產品的理化指標、微生物指標和功效評價。在標準制定時應根據酵素產品的具體類別明確可溶性固形物含量等理化指標；酵素產品作為以果蔬、食用菌等為基礎的發酵產品應有更細化的分類，如活菌型與非活菌型，又或者根據原料的不同進行劃分；由于目前其功效還未得到充分證實，更傾向于將其歸為飲料，在之后的研究中需要對其宣傳功效進行系統的驗證。本文研究結果為了解酵素產品品質，正確看待酵素產品，促進酵素行業健康發展提供了參考。

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Analysisonmicroorganismindex,mainenzymesandorganicacidsofleavenfood

ZHANG Meng-mei1,LIU fang1,HU Kai-di1,HU Lu1, LIU Jin-xia1,ZHANG Mei-jia1,LIU Shu-liang1,2*

1(College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China) 2(Institute of Food Processing and Safety,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

In order to understand the microorganism compositions of natural fermentation leaven food with different raw materials, and evaluate the physical-chemical index, microorganism index, main enzyme activity and organic acids components, the amount of yeast, lactic acid bacteria and acetic acid bacteria was detected. In this paper, the content of total acid and soluble solid, and the microorganism index of commercially available leaven food were detected. At the same time, the activity of protease, lipase, α-amylase and superoxide dismutase was determined, the organic acids was analyzed with high performance liquid chromatography. Results showed that there were yeast, lactic acid bacteria and acetic acid bacteria in leaven in the fermentation period. The activity of main enzymes of the commercially available leaven food was low. The main organic acids of commercially available leaven food were oxalic acid, malic acid, lactic acid and acetic acid. In conclusion, the quality of commercially available leaven food was not uniform. And the low enzyme activity was incompatible with the propaganda. This work could provide data reference for obtaining a correct view of leaven food and comprehending the leaven food quality.

leaven food; microorganism; enzyme activity; organic acids

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014137

碩士研究生(劉書亮教授為通訊作者，E-mail：lsliang999@163.com)。

四川省農業科技成果轉化資金項目(編號：14NZ0012)

2017-02-24，改回日期：2017-03-27