以普通干酵母粉為原料的酵母抽提物制備工藝研究

崔春，趙龍，趙謀明

(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510640)

以普通干酵母粉為原料的酵母抽提物制備工藝研究

崔春，趙龍，趙謀明*

(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510640)

為降低酵母抽提物生產對活性酵母原料的依賴，文章以普通干酵母粉為基本原料，以蛋白回收率、水解度、轉化率和干物質得率為主要指標，通過單因素試驗并結合正交試驗優化，最終確定了其最佳制備工藝：料液比1∶9，加酶量0.5%(E/S，胰酶∶風味蛋白酶為3∶1)，酶解時間16 h，溫度55 ℃，酶解pH值8.5。在該條件下制備酵母抽提物，蛋白回收率達71.84%±0.10%，水解度為29.17%±0.12%，所測定的17種游離氨基酸總質量分數達160.21 mg/g，其中苦味氨基酸、甜味氨基酸和鮮味氨基酸分別占58.53%，20.38%和15.82%。肽分子量分析結果表明酵母抽提物中小于3 kDa的肽段質量分數高達76.68%。

酵母；酵母抽提物；酶解；分子量分布；游離氨基酸；正交試驗

酵母抽提物(yeast extract，YE)，又稱酵母味素、酵母精、酵母浸膏等，它主要以面包酵母或啤酒酵母為原料，在一定條件下通過酵母自溶和酶法破壁，使得菌體細胞內的蛋白質、核酸類等物質充分釋放和降解，再進一步通過濃縮或干燥等處理，制備而成的膏狀或粉狀產品[1]，作為一種天然、綠色、健康的調味品，酵母抽提物受到廣大消費者的喜愛。此外，酵母抽提物中富含多肽、氨基酸、核苷酸、維生素等眾多營養物質，營養價值極高，同時其還含有一定量的谷胱甘肽，對于增強機體免疫功能有著重要意義[2]。

由于活性酵母菌菌體較為飽滿，破壁難度較小，且活性酵母的自溶可起到破壁和增強風味的作用，因而目前酵母抽提物的生產均以活性酵母菌為原料[3]。然而，由于活性酵母液運輸和保藏難度大，而活性干酵母成本太高，因而使得酵母抽提物的生產嚴重依賴于活性酵母生產線，這嚴重限制了酵母抽提物的發展。為此，本文以噴霧干燥后的普通干酵母粉為主要原料，以蛋白回收率、水解度和干物質得率為主要指標，在單因素試驗的基礎上，進一步結合正交優化試驗，探討其最佳制備工藝條件，以期降低酵母抽提物的生產對活性酵母原料的依賴。

1 材料與方法

1.1 主要材料

普通干酵母粉(活細胞率低于5%)：湛江五洲生物工程有限公司；Alcalase 2.4 L、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶：均購于諾維信(中國)生物技術有限公司；木瓜蛋白酶：購于廣州華琪生物科技有限公司；胰酶：購于重慶市祥盛生物制藥有限公司；三氟乙酸、甲醇：均為色譜純；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、硫酸等：均為分析純。

1.2 主要試驗儀器

HYP-308型八孔消化爐、KDN-103F型蛋白質測定儀 上海纖檢儀器有限公司；AL204型電子分析天平 瑞士METTLER TOLEDO公司；GL-21M型高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；PHS-3E型數顯pH計 上海精密科學儀器有限公司；TM840型自動電位滴定儀 法國雷迪美特(中國)有限公司；TSK-GEL G2000SWXL型分析柱 日本TOSOH東曹株式會社；Waters 600型高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.3 酵母抽提物的制備工藝流程

酵母抽提物的制備工藝流程見圖1。

圖1 酵母抽提物的制備工藝流程Fig.1 Flow chart of preparation technology of yeast extract

1.4 單因素試驗方法

按1∶9的料液比將酵母粉與水混勻，分別加入質量分數為0.5%(以酵母蛋白計)的木瓜蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、Alcalase 2.4 L和胰酶，在其最適pH值、55 ℃下水解12 h，根據試驗結果選取酶解效果最優的酶制劑與產物風味較好的酶制劑，再按照不同的比例進行復配試驗，探討其較佳復配比例，復配酶解條件為pH值 8.0，55 ℃，總加酶量0.5%(E/S)，酶解時間12 h。在復配試驗的基礎上，依次對料液比、加酶量、酶解pH值、溫度和時間進行單因素優化試驗。

1.5 正交試驗方法

在單因素優化試驗的基礎上，以蛋白回收率為指標，選取加酶量、溫度和酶解pH值設計三因素三水平正交試驗，對酵母抽提物的制備工藝進一步進行優化。

1.6 分析測定

1.6.1 蛋白回收率的測定

采用凱氏定氮法(參照GB 5009.5-2010)測定普通干酵母粉原料與酶解離心后上清液中的總氮，則蛋白回收率(%)=(上清液總氮質量分數×上清液總質量)/(干酵母粉總氮質量分數×干酵母粉總質量)×100%。

1.6.2 干物質得率

采用常壓直接干燥法(參照GB 5009.3-2010)，分別精確稱取2.0000 g的上清液和普通干酵母粉原料放入105 ℃烘箱中干燥至恒重，分別測得上清液和干酵母粉原料中的干物質含量，則干物質得率(%)=(上清液干物質質量分數×上清液總質量)/(干酵母粉干物質質量分數×干酵母粉總質量)×100%。

1.6.3 水解度的測定

采用甲醛電位滴定法測定酶解離心后上清液中的游離氨態氮含量[4]，再結合干酵母粉原料的總氮，則水解度(%)=(上清液游離氨態氮質量分數×上清液總質量)/(干酵母粉總氮質量分數×干酵母粉總質量)×100%。

1.6.4 肽分子量分布的測定

取酵母抽提物稀釋至蛋白濃度為4 mg/mL，采用凝膠色譜法測定其肽分子量分布情況[5]，檢測條件：Waters 600高效液相色譜儀，TSK-GEL G2000SWXL色譜分析柱(批次編號：502R)，流動相配制：38 g Na2HPO4·12H2O+5.04 g NaH2PO4·2H2O+1 mL TFA 定容至1 L，檢測流速1 mL/min，檢測波長220 nm。標準肽樣品：牛血清白蛋白(bovine serum albumin，67000 Da)，卵清蛋白 (ovalbumin，43000 Da)，細胞色素C (cytochrome C，12384 Da)，抑肽酶(aprotinin，6512 Da)，維生素B12(1355 Da)，谷胱甘肽(glutathione，307 Da)，相對分子質量的對數值與洗脫體積擬合直線方程為y=-0.4201x+7.9984(R2=0.99)，其中，y為標準肽分子量的對數；x為洗脫體積，mL。

1.6.5 游離氨基酸的測定及其呈味分析

采用A300氨基酸分析儀測定樣品中的游離氨基酸[6]。取酶解后的離心上清液4 mL，加入1 mL磺基水楊酸，4 ℃下靜置沉淀60 min以上，在8000 r/min下離心15 min，取上清液重復離心操作，再使用鋰鹽稀釋液將二次離心后的上清液稀釋至其氨態氮質量分數為0.008%，將稀釋后的樣液過0.22 μm有機濾膜并上機測定。按照不同的呈味特性對測定結果進行分類并根據文獻中各類氨基酸的呈味閾值計算酶解產物中各類氨基酸的呈味強度(taste activity value, TAV)如下：

呈味強度(TAV)=氨基酸質量分數(mg/g)/氨基酸呈味閾值(mg/g)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶的種類及其復配對酶解效果的影響

圖2 酶的種類及其復配對酶解效果的影響Fig.2 Effect of different enzymes and enzyme complex on hydrolysis effect of yeast

注：a為酶的種類對酶解效果的影響，料液比 1∶9，溫度55 ℃，加酶量0.5%(E/S)，酶解時間12 h；b為酶的復配對酶解效果的影響，料液比1∶9，溫度55 ℃，pH值 8.0，加酶量0.5%(E/S)，酶解時間12 h。

分別采用Alcalase 2.4 L、風味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶和胰酶對普通酵母干粉進行酶解，試驗結果見圖2a。由圖2a可知，胰酶和Alcalase 2.4 L的酶解效率較高，其中胰酶酶解的干物質得率、蛋白回收率和水解度最高，分別高達52.89%，70.12%和26.04%，風味蛋白酶酶解的干物質得率和蛋白回收率最低，僅為30.97%和36.76%，但其水解度較高，且鮮味較好，苦味較淡。分析原因主要與酶的特異性有關，胰酶和Alcalase 2.4 L作為肽鏈內切酶，可迅速降解大分子蛋白質的肽鏈生成小分子肽，此外胰酶中還含有少量的淀粉酶和脂肪酶，具有一定的脂肪酶和糖酶性質，可促進酵母的水解[7,8]。而風味蛋白酶具有外切酶的特點[9]，可從肽鏈末端脫除氨基酸，提高酶解產物的水解度并降低酶解產物的苦味。為此，本文選擇胰酶和風味蛋白酶按照不同的比例復配對酵母進行酶解處理，試驗結果見圖2b。由圖2b可知，胰酶與風味蛋白酶的比例為4∶1和3∶1時，干物質回收率和蛋白回收率差異不大，但胰酶與風味蛋白酶的比例為3∶1時，酵母抽提物的苦澀味較弱，鮮味和厚味較強，且隨著胰酶所占比例的繼續下降，酵母酶解的干物質得率和蛋白回收率逐漸下降，而鮮味和厚味改善效果減弱。綜合考慮，本文選擇胰酶與風味蛋白酶的比例3∶1作為兩種酶的較佳復配比例進行下一步試驗。

2.1.2 料液比對酶解效果的影響

圖3 酶解工藝條件對酶解效果的影響Fig.3 Effect of different enzymatic hydrolysis conditions on hydrolysis effect of yeast

注：a為料液比對酶解效果的影響，胰酶與風味蛋白酶的比例 3∶1，pH值 8.0，溫度55 ℃，加酶量0.5%(E/S)，酶解時間12 h；b為加酶量對酶解效果的影響，料液比 1∶9，胰酶與風味蛋白酶的比例3∶1，pH值 8.0，溫度55 ℃，酶解時間12 h；c為酶解pH值對酶解效果的影響，料液比 1∶9，胰酶與風味蛋白酶的比例3∶1，溫度55 ℃，加酶量0.5%(E/S)，酶解時間12 h；d為溫度對酶解效果的影響，料液比 1∶9，胰酶與風味蛋白酶的比例3∶1，pH值 8.0，加酶量0.5%(E/S)，酶解時間12 h；e為時間對酶解效果的影響，料液比1∶9，胰酶與風味蛋白酶的比例3∶1，pH值 8.0，溫度55 ℃，加酶量0.5%(E/S)。

料液比對酵母酶解效果的影響見圖3a。由圖3a可知，隨著料液比的逐漸減小，酵母酶解的干物質得率、蛋白回收率和水解度均逐漸升高，且當料液比小于1∶9后其升高趨勢逐漸平緩，分析原因主要是水的增多有利于酵母的分散和蛋白的溶出，對酶促反應有利，然而料液比減小易造成能耗升高，因此選擇1∶9作為酵母酶解的較適料液比。

2.1.3 加酶量對酶解效果的影響

加酶量對酶解效果的影響見圖3b。由圖3b可知，隨著加酶量的逐漸增大，酵母酶解的干物質得率、蛋白回收率和水解度均呈現升高的趨勢，但在加酶量超過0.5%后，干物質得率和蛋白回收率逐漸趨于平緩，這主要是因為加酶量的增大可以增加酶與底物的接觸幾率，從而促進酶解。為控制生產成本，并避免酵母深度酶解后苦味過重的問題，本文選擇加酶量0.5%進行下一步試驗。

2.1.4 酶解pH值對酶解效果的影響

酶解pH值對酶解效果的影響見圖3c。由圖3c可知，隨著酶解pH值的逐漸升高，干物質得率、蛋白回收率和水解度均呈現先增加后降低的趨勢，且在酶解pH值為8.0時達到最高點，這主要與酶的最適作用pH值有關，試驗中所用胰酶的最適作用pH值為8.0左右，風味蛋白酶的最適作用pH值為7.0左右，但由于胰酶對酵母酶解效果更為顯著，因此最終酶解效果與胰酶的最適作用環境較為接近。綜合考慮，本文選擇pH值 8.0進行下一步試驗。

2.1.5 溫度對酶解效果的影響

酶解溫度對酶解效果的影響見圖3d。由圖3d可知，隨著溫度的逐漸升高，酵母酶解的干物質得率和蛋白回收率均呈現先升高后降低的趨勢，分別在溫度為55 ℃時達到最大值59.65%和74.67%，分析原因主要是在一定范圍內提高溫度可以促進底物的溶出并提高酶促反應的速率，但溫度過高易引起酶和底物蛋白變性[10]，因此，當溫度超過其最適溫度后，其干物質得率和蛋白回收率均降低，這與薛照輝等[11]的研究結果相一致。綜合考慮，本文選擇55 ℃進行下一步試驗。

2.1.6 酶解時間對酶解效果的影響

酶解時間對酶解效果的影響見圖3e。由圖3e可知，隨著酶解時間的延長，酵母酶解的干物質回收率、蛋白回收率和水解度均逐漸上升，但干物質得率和蛋白回收率在酶解時間超過16 h后逐漸趨于平緩，而水解度則在酶解時間超過24 h后上升速度才呈現出減慢的趨勢。分析原因可能是酶解前期酵母破壁后，各類物質迅速溶出，酵母蛋白在酶的作用下迅速降解成小分子肽和氨基酸，因此干物質得率和蛋白回收率上升較快，而酶解后期酶主要作用于前期蛋白酶解所產生的多肽，因此此時干物質得率和蛋白回收率變化較小，但水解度卻顯著升高[12]。由于酵母深度酶解后苦味加重，且酶解液離心難度大，加工能耗較高，因此，選擇16 h作為酵母酶解的較佳酶解時間。

2.2 酵母抽提物制備工藝的正交優化試驗

由單因素試驗結果可知，干物質得率與蛋白回收率的變化趨勢基本一致，此外，水解度主要用以表述酵母蛋白在酶解過程中游離氨基酸的生成情況，該值過高易導致產物發苦，該值過低則說明酶解效果較差，正交優化試驗過程中所選因素及水平應盡量避免該值過高或過低，為此，在此基礎上，正交優化試驗以蛋白回收率為主要指標，以實現酵母抽提物生產效益的最大化。由單因素試驗可知，酵母抽提物的制備過程中加酶量、溫度和酶解pH值對酶解效果影響較大，為此在料液比1∶9、胰酶∶風味蛋白酶比例3∶1、酶解時間16 h的條件下，以蛋白回收率為指標，選取加酶量、溫度和酶解pH 3個變量按照表1設計三因素三水平正交試驗以進一步優化酵母抽提物的制備工藝，其極差分析結果見表1。

表1 酵母抽提物制備工藝的正交優化試驗及極差分析Table 1 The orthogonal experiment and range analysis of YE preparation

由表1可知，對蛋白回收率影響大小的排序為溫度>加酶量>酶解pH，由k值分析可知，其最優工藝組合為A3B2C3，但考慮到加酶量為0.6%(E/S)時，酶解產物水解度較高，苦味較重，且酶解產物工業化離心分離難度大，生產成本較高，為此，在實際操作和生產中選擇加酶量0.5%(E/S)。綜上所述，酵母抽提物的最佳制備工藝為料液比1∶9，加酶量0.5%(E/S，胰酶∶風味蛋白酶為3∶1)，酶解時間16 h，溫度55 ℃，酶解pH 8.5，在該條件下制備酵母抽提物，其蛋白回收率為71.84%±0.10%，水解度為29.17%±0.12%，產物鮮味突出，風味醇厚。

2.3 酵母抽提物的游離氨基酸含量及組成分析

在2.2節所述最佳制備工藝條件下制備酵母抽提物，采用全自動氨基酸分析儀測定其游離氨基酸含量，并計算其游離氨基酸組成，結果見表2。

表2 酵母抽提物的17種游離氨基酸含量及其呈味分析Table 2 The content and taste analysis of 17 free amino acids of yeast extract

由表2可知，酵母抽提物中17種游離氨基酸的總質量分數達160.21 mg/g(以干基計)，含量較為豐富。此外，表2中苦味氨基酸、甜味氨基酸和鮮味氨基酸的占比分別為58.53%，20.38%和15.82%[13]，這些呈味特性各異的氨基酸與其他呈味物質一起構成了酵母抽提物鮮美醇厚的風味。酵母抽提物的鮮味氨基酸主要由谷氨酸組成，其占比為12.17%，呈味強度為64.98；甜味氨基酸主要由丙氨酸組成，其占比為11.01%，呈味強度為29.41；苦味氨基酸主要由苯丙氨酸、賴氨酸和亮氨酸組成，其中以賴氨酸的呈味強度最高，高達63.60。這在一定程度上證實了游離氨基酸對酵母抽提物呈味特性的貢獻，然而，通過對酵母抽提物稀釋液(固形物質量分數0.5%)的進一步感官品評，發現在各種氨基酸含量均遠低于其閾值的情況下，樣品依然存在較強的鮮甜味，這充分說明酵母抽提物的呈味特性與其呈味肽緊密相關。盡管酵母抽提物中苦味氨基酸含量較高，但感官品評過程中其苦味較淡，分析原因可能是風味蛋白酶在酶解過程中脫除了肽鏈末端的疏水性氨基酸，從而增大了游離氨基酸中苦味氨基酸的含量和組成占比，但與此同時降低了酶解產物的苦味。

2.4 酵母抽提物的肽分子量分布情況

在2.2節所述最佳制備工藝條件下制備酵母抽提物，測定其肽分子量分布，結果見圖4。

圖4 酵母抽提物的肽分子量分布Fig.4 The molecular weight distribution of peptides of yeast extract

由圖4可知，酵母蛋白在胰酶和風味蛋白酶的復合酶解作用下降解成不同分子量的肽段，且其分子量主要集中分布在5 kDa以下，其中小于3 kDa的肽段質量分數高達76.68%，這說明酵母蛋白酶解較為充分，結合表2可知，酵母抽提物的滋味特性來源可能主要與其所擁有的小分子肽有關。

3 結論

以普通干酵母粉為主要原料，通過單因素試驗并結合正交試驗方法優化并確定了酵母抽提物的最佳制備工藝條件：料液比1∶9，加酶量0.5%(E/S，胰酶∶風味蛋白酶為3∶1)，酶解時間16 h，溫度55 ℃，酶解pH 8.5，在該條件下制備酵母抽提物，其蛋白回收率為71.84%±0.10%，水解度為29.17%±0.12%，所測定的17種游離氨基酸總含量高達160.21 mg/g(以干重計)，其中苦味氨基酸、甜味氨基酸和鮮味氨基酸分別占58.53%，20.38%和15.82%。肽分子量分析結果表明酵母抽提物中小于3 kDa的肽段質量分數高達76.68%，這些呈味特性各異的氨基酸、小分子肽類和其他呈味物質一起構成了鮮美醇厚的呈味特性。

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PreparationofYeastExtractwithCommonDryYeast

CUI Chun, ZHAO Long, ZHAO Mou-ming*

(School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Since the preparation of YE with active yeast as raw material has caused a serious dependence on the resource of active yeast accompanied with a high cost for the raw material, the preparation of YE with common dry yeast is investigated in this paper. The enzyme complex, ratio of material to water, enzyme amount, hydrolysis time, hydrolysis temperature and pH value during preparation of YE are optimized through the determination of protein recovery, dry matter recovery,conversion rare and degree of hydrolysis. The orthogonal experiment is designed to further optimize the amount of enzyme complex, hydrolysis temperature and pH value to find the best processing technology for YE preparation with common dry yeast. The results show that the best process parameters are as follows: the ratio of material to water is 1∶9, the amount of enzyme is 0.5% (E/S, ratio of trypsin to flavourzyme is 3∶1), the hydrolysis time is 16 h, the hydrolysis temperature is 55 ℃, and the pH value is 8.5.The protein recovery of YE prepared under the best process parameters could reach 71.84%±0.10%, the degree of hydrolysis is 29.17%±0.12%.The total mass fraction of 17 kinds of free amino acids is 160.21 mg/g. The free amino acids analysis shows that the amino acids with bitterness account for 58.53%, the amino acids with sweetness account for 20.38% and the amino acids with umami account for 15.82%. The molecular weight distribution of peptides shows that the mass fraction of peptides less than 3 kDa in yeast extract reaches up to 76.68%.

yeast;yeast extract;enzymatic hydrolysis;molecular weight distribution;free amino acids;orthogonal experiment

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.001

1000-9973(2017)11-0001-06

2017-05-16 *通訊作者

國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2013AA102201)；廣東省戰略性新興產業核心技術攻關(2012A080800014，2012A020800002)；廣州市科技計劃項目(201604020067)

崔春(1978-)，男，湖北洪湖人，教授，博士，研究方向：食品生物技術；

趙謀明(1964-)，男，湖南益陽人，教授，博士，研究方向：食品生物技術。