HSP90B1基因多態性與系統性紅斑狼瘡易感性的關聯研究①

孫秀秀 徐建華 錢 龍 王春淮 潘海峰 葉冬青 鄒延峰

(安徽醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學系，安徽省重大自身免疫性疾病重點實驗室，合肥 230032)

·基礎免疫學·

HSP90B1基因多態性與系統性紅斑狼瘡易感性的關聯研究①

孫秀秀 徐建華②錢 龍③王春淮③潘海峰 葉冬青 鄒延峰

(安徽醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學系，安徽省重大自身免疫性疾病重點實驗室，合肥 230032)

目的探討HSP90B1基因多態性與中國漢族人群系統性紅斑狼瘡(SLE)易感性的關系。方法從醫院收集360例對照和360例SLE患者，按照年齡和性別進行匹配。利用Multiplex SNaPshot分型技術對SNP位點分型。采用基于錯誤發現率(FDR)標準的本杰明-漢伯格(BH)法進行多重檢驗校正。結果顯性模型分析發現rs1165681的基因型頻率分布在對照組和SLE組之間存在統計學差異(Crude OR=0.621,95%CI=0.450-0.856,P=0.004;Adjusted OR=0.619,95%CI=0.449-0.855,P=0.004)；隱性模型分析發現rs10778306(Crude OR=0.568,95%CI=0.328-0.984,P=0.044;Adjusted OR=0.570,95%CI=0.329-0.988,P=0.045)、rs2722188(Crude OR=0.227,95%CI=0.076-0.681,P=0.008;Adjusted OR=0.227,95%CI=0.076-0.682,P=0.008)的基因型分布在兩組之間存在統計學差異。BH法校正后，rs1165681基因型分布在兩組之間有統計學差異(PBH=0.044)。單倍型分析后CCATTAGGCAT(OR=0.323,95%CI=0.154-0.680,P=0.002)、CCCTTAGGCAC(OR=1.324,95%CI=1.014-1.729,P=0.039)、TCCCTAGTCGC(OR=0.465,95%CI=0.221-0.979,P=0.039)和TTCTCGGGCAT(OR=0.443,95%CI=0.224-0.875,P=0.016)與SLE的發病風險有關；BH法校正后，CCATTAGGCAT在兩組之間的分布有統計學差異(PBH=0.028)，其他單倍型均無統計學差異(P>0.05)。結論HP90B1基因多態性可能與中國漢族人群的SLE發病有關。

系統性紅斑狼瘡；HSP90B1；單核苷酸多態性；單倍型

系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種能夠產生抗自身抗體的慢性全身性自身免疫性疾病，其臨床表現主要包括皮疹、脫發、關節炎、蝶形紅斑、貧血、凝血功能障礙、雷諾現象等，嚴重危害育齡期女性的健康[女性∶男性=(8～9)∶1][1]。有證據提示HSP90家族在SLE中起重要作用。中國漢族人群的全基因組關聯研究(Genome-wide asso-ciation study,GWAS)的結果已經顯示12q23.2-23.3區域和SLE的發生存在關聯趨勢[2]，同時也有研究發現12q23-24區域和自身免疫性疾病多發性硬化癥(Multiple sclerosis,MS)的易感性有關[3]。HSP90B1基因位于12q23.3，可能與SLE發生有關。因此，我們開展此次研究探討HSP90B1基因多態性與SLE易感性的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象 SLE患者是安徽醫科大學第一附屬醫院和第二附屬醫院就診的患者，均符合1997年美國風濕病學會(ACR)的SLE診斷標準。對照組來自于安徽醫科大學第一附屬醫院體檢中心，納入對照組的成員無自身免疫性疾病或重大疾病，也無自身免疫性疾病家族史。按照性別和年齡進行匹配。本次研究已獲得安徽醫科大學倫理委員會的批準，所有的研究對象自愿參與并且簽署書面知情同意書。

1.2方法

1.2.1血樣標本的采集與處理 用BD EDTA靜脈真空一次性血常規采血管(抗凝管)(Plastic Whole Blood tube with spraycoated K2EDTA,貨號 367861)采取所有參與者的外周靜脈血5 ml，并對血樣進行編號，然后放入4℃冰箱保存。應用Qiagen 提取試劑盒(德國 Qiagen FlexiGen DNA kit,貨號51206)提取DNA，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2SNP的篩選和基因分型 使用 HapMap 數據庫(Chinese Han in Beijing,release No.24/phaseⅡNov08,on NCBI B36 assembly)獲得HSP90B1基因38個SNPs，利用 Haploview(4.0版)軟件依據Linkage Distance(LD)圖篩選候選基因SNPs，最終篩選出12個SNPs(rs1165681、rs1242638、rs17034943、rs3794240、rs10861147、rs1177457、rs10778306、rs170 34931、rs2722188、rs1165687、rs17034938、rs3794 241)。篩選SNPs的標準是最小等位基因頻率(Minor allele frequency,MAF)大于0.01。利用SNaPshot SNP分型技術進行SNP位點分型。用在線Primer3 軟件設計引物(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。在一個反應體系中采用多重聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)獲得目標 SNP 位點所在區段的擴增，其次用蝦堿酶(SAP)和外切酶Ⅰ(EXOⅠ)對擴增產物進行純化，純化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進行延伸反應，延伸產物用SAP純化后在ABI3730xl上樣。數據文件處理采用 Gene Mapper 4.1 軟件來分析。

2 結果

2.1一般特征描述 本研究按照性別、年齡進行匹配，分別收集360例對照和360例SLE患者，其中男性37例(10.28%)，女性323例(89.72%)。對照組的平均年齡(35.30±9.70)歲，SLE組的平均年齡(35.06±12.05)歲，結果見表1。

2.2HSP90B1基因型頻率及遺傳平衡檢驗 為了檢測對照組和SLE組HSP90B1基因型頻率是否達到遺傳平衡，進行了HWE遺傳平衡檢驗。除rs17034943在對照組中不滿足HWE遺傳平衡定律外，其他11個位點均符合HWE遺傳平衡(P>0.05)，結果見表2。

表1對照組與SLE組的基本特征

Tab.1Characteristicsofcasesandcontrols

ParameterControls(n=360)Cases(n=360)Age,years1)35.30±9.7035.06±12.05Sex,n(%)2)Female323(89.72)323(89.72)Male37(10.28)37(10.28)

Note：Compared with controls,1)t=0.296,P=0.768;2)χ2=0.000,P=1.000.

表2HSP90B1基因型頻率分布和HWE檢驗

Tab.2GenotypedistributionandHardy-WeinbergEquili-briumtestforHSP90B1tagsinglenucleotidepolymorphisms

SNPs(MAF)GenotypeWildtypeHeterozygousHomozygousrs1165681(T)Controls91(25.28)190(52.78)79(21.94)Cases127(35.28)172(47.78)61(16.94)rs12426382(T)Controls182(50.55)149(41.39)29(8.06)Cases195(54.17)145(40.28)20(5.55)rs17034943(G)1)Controls90(25.00)201(55.83)69(19.17)Cases121(33.61)184(51.11)55(15.28)rs3794240(A)Controls166(46.11)157(43.61)37(10.28)Cases179(49.72)157(43.61)24(6.67)rs10861147(C)Controls244(67.78)103(28.61)13(3.61)Cases257(71.39)98(27.22)5(1.39)rs1177457(T)Controls100(27.78)167(46.39)93(25.83)Cases89(24.72)192(53.33)79(21.95)rs10778306(G)Controls180(50.00)143(39.72)37(10.28)Cases193(53.61)145(40.28)22(6.11)rs17034931(C)Controls247(68.61)100(27.78)13(3.61)Cases224(62.22)117(32.50)19(5.28)rs2722188(T)Controls246(68.33)97(26.95)17(4.72)Cases258(71.67)98(27.22)4(1.11)rs1165687(A)Controls353(98.06)7(1.94)0(0.00)Cases358(99.44)2(0.56)0(0.00)rs17034938(G)Controls299(83.05)56(15.56)5(1.39)Cases297(82.50)58(16.11)5(1.39)rs3794241(T)Controls216(60.00)129(35.83)15(4.17)Cases225(62.50)118(32.78)17(4.72)

Note：1)HWEχ2=5.226,P=0.022.

2.3SLE與HSP90B1基因多態性之間的關系 由于rs17034943位點不符合HWE遺傳平衡定律，因此Logistic回歸分析SLE與HSP90B1基因多態性的關聯時，rs17034943被排除。多元Logistic回歸分析調整了年齡與性別。顯性模型分析的結果發現rs1165681的基因多態性與SLE的發病有關(Crude OR=0.621,95%CI=0.450-0.856;Adjusted OR=0.619,95%CI=0.449-0.855)。隱性模型分析發現rs10778306的基因多態性(Crude OR=0.568,95%CI=0.328-0.984;Adjusted OR=0.570,95%CI=0.329-0.988)和rs2722188的基因多態性(Crude OR=0.227,95%CI=0.076-0.681;Adjusted OR=0.227,95%CI=0.076-0.682)與SLE的發病有關。但經BH法校正后，僅有rs1165681位點的基因多態性在顯性模型中與SLE有關(PBH=0.044)，結果見表3。

2.4HSP90B1基因單倍型分析 利用SHEsis軟件處理數據時要求單倍型頻率不小于0.03，結果獲得14個單倍型，其中CCATTAGGCAT(OR=0.323,95%CI=0.154-0.680)、CCCTTAGGCAC(OR=1.324,95%CI=1.014-1.729)、TCCCTA-GTCGC(OR=0.465,95%CI=0.221-0.979)和TTCTCGGGCAT(OR=0.443,95%CI=0.224-0.875)與SLE的發病風險有關；經BH法校正后，CCATTAGGCAT在兩組之間的分布有統計學差異(PBH=0.028)，其他單倍型分布均無統計學差異(P>0.05)，結果見表4。

表3SLE與HSP90B1基因多態性的關系

Tab.3AssociationofsystemiclupuserythematosusandHSP90B1tagsinglenucleotidepolymorphisms

SNPsDominantmodelCrudeOR(95%CI)AdjustedOR(95%CI)PBHRecessivemodelCrudeOR(95%CI)AdjustedOR(95%CI)PBHrs11656811)0.621(0.450-0.856)0.619(0.449-0.855)0.0440.726(0.500-1.052)0.726(0.571-1.054)0.184rs124263820.865(0.646-1.159)0.866(0.646-1.161)0.4400.671(0.372-1.211)0.672(0.373-1.212)0.304rs37942400.865(0.646-1.159)0.865(0.645-1.159)0.4400.624(0.365-1.066)0.625(0.365-1.068)0.184rs108611470.843(0.613-1.159)0.843(0.613-1.158)0.4400.376(0.133-1.066)0.375(0.32-1.062)0.184rs11774571.171(0.840-1.633)1.168(0.838-1.630)0.4400.807(0.572-1.138)0.803(0.569-1.134)0.304rs107783062)0.865(0.646-1.159)0.866(0.646-1.160)0.4400.568(0.328-0.984)0.570(0.329-0.988)0.184rs170349311.327(0.975-1.806)1.331(0.978-1.813)0.3801.487(0.723-3.059)1.491(0.725-3.068)0.348rs27221883)0.853(0.620-1.174)0.852(0.619-1.173)0.4400.227(0.076-0.681)0.227(0.076-0.682)0.080rs11656870.282(0.058-1.365)0.282(0.058-1.370)0.429---rs170349381.040(0.706-1.531)1.039(0.705-1.530)0.8471.000(0.287-3.484)0.993(0.285-3.464)0.993rs37942410.900(0.667-1.215)0.900(0.667-1.215)0.5401.140(0.560-2.319)1.142(0.561-2.324)0.793

Note：Compared with controls,1)dominant model(CrudeP=0.004,AdjustedP=0.004);2)recessive model(CrudeP=0.044,AdjustedP=0.045);3)recessive model(CrudeP=0.008,AdjustedP=0.008).

表4HSP90B1SNPs的單倍型分析

Tab.4HaplotypeanalysisforSNPsofHSP90B1gene

HaplotypesFrequencyofcontrols(n,%)Frequencyofcases(n,%)OR(95%CI)PBHCCATCACGCAC37.37(0.052)53.07(0.074)1.535(0.995-2.371)0.143CCATTAGGCAC28.78(0.040)25.54(0.035)0.927(0.538-1.598)0.821CCATTAGGCAT1)29.50(0.041)9.40(0.013)0.323(0.154-0.680)0.028CCCTCACGCAC64.97(0.090)67.25(0.093)1.096(0.764-1.572)0.723CCCTTAGGCAC2)128.63(0.179)152.41(0.212)1.324(1.014-1.729)0.137CCCTTAGGCAT33.86(0.047)41.44(0.058)1.303(0.816-2.082)0.372CTCTCAGGCAC13.00(0.018)21.70(0.030)1.778(0.886-3.569)0.202TCCCTAGTCAC83.47(0.116)62.86(0.087)0.765(0.540-1.083)0.228TCCCTAGTCGC3)22.77(0.032)10.30(0.014)0.465(0.221-0.979)0.137TCCTCGGGCGC19.06(0.026)25.46(0.035)1.417(0.774-2.594)0.372TTATCGGGCAC77.58(0.108)55.90(0.078)0.730(0.508-1.050)0.202TTATCGGGCAT22.89(0.032)20.41(0.028)0.932(0.508-1.712)0.821TTCTCGGGCAC41.57(0.058)44.73(0.062)1.138(0.734-1.763)0.717TTCTCGGGCAT4)28.21(0.039)12.23(0.017)0.443(0.224-0.875)0.112

Note：Compared with controls,1)P=0.002;2)P=0.039;3)P=0.039;4)P=0.016.

3 討論

目前SLE的病因依舊不明，單一因素無法解釋其發病機制。雖然早期診斷、規律隨訪和合理治療提高了SLE患者的生存，但是依然給個人和社會帶來重大經濟負擔。近年來通過GWAS研究發現有些基因位點可能與SLE有關[4]，增加了我們對SLE病因基因學方面的了解。GWAS是一種有效定位大效應位點的方法，但對微效應位點挖掘能力則十分有限，可能造成一些與SLE有關的微效應易感基因沒有被發現。HSP90B1基因是HSP90家族重要的成員之一，已有研究發現12q23-24區域是MS的易感性基因位點[3]。HSP90B1基因編碼熱休克糖化蛋白96(Gp96)或者糖調節蛋白94(GRP94)，且抗GRP94自身抗體在SLE患者體內增加[5]，綜上我們假設HSP90B1基因可能與SLE發病有關，并且此次研究的基因多態性的關聯分析和單倍型分析結果也支持該假設。

HSP90B1蛋白(GRP94/Gp96)是一種高度保守的分子伴侶，對維持細胞穩態至關重要。在細胞內質網內出現未折疊/錯誤折疊蛋白或干擾蛋白累積以及鈣離子紊亂等，激活未折疊蛋白反應(Unfolded protein response,UPR)，啟動內質網應激(Endoplas-mic reticulum stress,ERS)。ERS發生在多種自身免疫性疾病中，比如SLE、炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)、原發性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)、自身免疫性關節炎[6]。當ERS發生時，HSP90B1基因的表達可能增加，從而促使HSP90B1激活蛋白的正確折疊和組裝，抑制細胞凋亡，促進細胞存活[7]，維持機體的穩態。

HSP90B1基因編碼的蛋白GRP94/Gp96在自身免疫和炎癥疾病中發揮促炎和抗炎的作用。Toll受體(TLR)是主要表達在抗原呈遞細胞(APCs)表面的模式識別受體。細胞外的Gp96作為TLR2和TLR4的配體，在重組N端結構域與其結合，激活TLR信號通路，分泌促炎因子IL-6和TNF-α[8]，對可能的損害因子起到防御反應，增強機體防御機制，降低患SLE的風險。其次，CD91是Gp96在APCs的另一受體。Gp96可以與CD91直接結合，促使CD91磷酸化，激活NF-κB，從而調節免疫反應和炎癥反應中的分子，也可以上調MCH-Ⅰ和MCH-Ⅱ有效激活特定的CD8+和CD4+T細胞反應[9,10]，從而針對自身細胞或成分發生免疫應答。此外，細胞外的Gp96可能作為自身抗原誘導產生自身抗體。細胞表面的Gp96的慢性表達可以誘導小鼠狼瘡樣癥狀[11]。GRP94/Gp96可能在SLE的發生中起到促炎/抗炎和自身抗原的作用。

腫瘤與SLE的發生均與自身免疫有關，二者的發生可能存在共同的病理機制。HSP90B1基因與某些癌癥的關系已被證實。Coskunpinar等[12]發現在土耳其人群中HSP90B1基因多態性與非小細胞肺癌(NSCLC)之間存在關聯，病例組的突變型基因(rs2070908 C/G)明顯高于對照組。此外，Sun等[13]發現HSP90B1基因可能是口腔鱗狀細胞癌(OSCC)的易感基因，其單倍型GCCAGCAC-CACAGCGC與OSCC之間存在關聯。因而，HSP90B1基因可能與SLE的易感性有關?？傊?，HSP90B1作為ERS功能蛋白以及在免疫反應中的作用，這提供有效的證據證明HSP90B1基因多態性可能與SLE易感之間存在關聯。

盡管，本研究結果發現了HSP90B1與SLE之間存在關聯，但依然存在局限性。一方面， SLE并不是一種十分罕見的疾病，在中國人群的患病率為(97.5～100)/100 000[14]，本研究可能存在樣本不足的缺陷。另一方面，病例組來自安徽省的患者人群，結論外推時，存在地域限制。最后，本研究進行了年齡與性別的匹配，但其他因素(吸煙、VitD等)對SLE的發生發展也有影響，但這些因素太多，無法進行完全的匹配。

綜上所述，HSP90B1基因多態性可能與SLE發生有關。雖然近年來，SLE的遺傳學研究得到快速的發展，發現許多基因與SLE有關，但僅從基因角度無法完全闡述SLE的發病機制。因此，開展HSP90B1基因在SLE中功能表達的研究是有必要的。

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[收稿2017-05-08 修回2017-07-03]

(編輯 倪 鵬)

AssociationofHSP90B1genepolymorphismswithsystemiclupuserythemat-osuspatients

SUNXiu-Xiu,XUJian-Hua,QIANLong,WANGChun-Huai,PANHai-Feng,YEDong-Qing,ZOUYan-Feng.

DepartmentofEpidemiologyandBiostatistics,SchoolofPublicHealth,AnhuiMedicalUniversity,theKeyLaboratoryofMajorAutoimmuneDiseases,Hefei230032,China

Objective:To explore the association of HSP90B1 gene polymorphisms with susceptibility of systemic lupus erythematosus(SLE) in Chinese Han population.MethodsWe recruited 360 SLE patients from hospital as case group and selected 360 age- and sex-matched individuals without autoimmune diseases as control group.Multiplex SNaPshot was used for genotyp-ing.Benjamin-Hamburg(BH) method based on false discovery rate(FDR) standard was used for multiple testing correction.ResultsThe rs1165681 polymorphism(Crude OR=0.621,95%CI=0.450-0.856,P=0.004；Adjusted OR=0.619,95%CI=0.449-0.855,P=0.004) was significantly associated with SLE risk reduction in dominant model,and the rs10778306 polymorphism(crude OR=0.568,95%CI=0.328-0.984,P=0.044；Adjusted OR=0.570,95%CI=0.329-0.988,P=0.045) and the rs2722188 polymorphism(Crude OR=0.227,95%CI=0.076-0.681,P=0.008；Adjusted OR=0.227,95%CI=0.076-0.682,P=0.008) were significantly associated with SLE risk reduction in recessive model.After adjustment using BH method,genotype distribution of rs1165681 was statistical difference in two groups(PBH= 0.044).Significant associations were found between four haplotypes of HSP90B1 gene CCATTAGGCAT(OR=0.323,95%CI=0.154-0.680,P=0.002),CCCTTAGGCAC(OR=1.324,95%CI=1.014-1.729,P=0.039),TCCCTAGTCGC(OR=0.465,95%CI=0.221-0.979,P=0.039)and TTCTCGGGCAT(OR=0.443,95%CI=0.224-0.875,P=0.016)and SLE risk.After adjustment using BH method,the frequency of CCATTAGGCAT distribution difference was statistically significant in two groups(PBH= 0.028),but there were no statistical difference in other haplotypes frequency distributions (P>0.05).ConclusionHSP90B1gene polymorphisms may be associated with the susceptibility of SLE in Chinese Han population.

Systemic lupus erythematosus;HSP90B1;Polymorphism;Haplotype

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.001

①本文為國家自然科學基金項目(No.81673254，No.81373073)。

②安徽醫科大學第一附屬醫院風濕免疫科，合肥 230022。

③安徽醫科大學第二附屬醫院風濕免疫科，合肥 230601。

R446.11

A

1000-484X(2017)11-1601-05

孫秀秀(1990年-)，女，碩士，主要從事分子流行病學研究，E-mail：sunxiu628@sina.com。

及指導教師：鄒延峰(1979年-)，男，博士，副教授，主要從事分子流行病學研究，E-mail：zouyanfeng2015@163.com。