內質網應激介導蛻皮甾酮對H2O2誘導的心肌細胞損傷的保護作用①

郭長磊 呂風華 王國戧

(新鄉醫學院第一附屬醫院心內科,新鄉 453002)

內質網應激介導蛻皮甾酮對H2O2誘導的心肌細胞損傷的保護作用①

郭長磊 呂風華 王國戧②

(新鄉醫學院第一附屬醫院心內科,新鄉 453002)

目的探討蛻皮甾酮(EDS)如何通過調節內質網應激對過氧化氫(H2O2)誘導的心肌細胞損傷起保護作用。方法大鼠H9c2心肌細胞隨機分為對照(Control)組，正常心肌細胞；H2O2組，不同濃度H2O2(1×10-3、1×10-4、1×10-5mol/L)誘導損傷細胞；EDS組，在H2O2組基礎上，加入不同濃度的EDS(25、50、100 μmol/L)處理。MTT法和流式細胞術分別檢測實驗各組細胞活力及細胞凋亡率。Western blot檢測各組細胞中Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、caspase-4、caspase-7、caspase-12、GRP78和CHOP的蛋白水平，同時檢測各組細胞中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。結果與Control組相比，H2O2組的細胞活力減弱，凋亡率升高，MOD含量升高，SOD活性降低，GRP78和CHOP的表達升高(均P<0.05)。H2O2組加入EDS處理后，細胞活力提升，凋亡率下降，MOD含量降低，SOD活性升高，GRP78和CHOP的表達降低(均P<0.05)。結論通過抑制內質網的應激過程，蛻皮甾酮能減輕H2O2誘導的心肌細胞損傷。

內質網應激；蛻皮甾酮；心肌細胞；H2O2

目前，心腦血管疾病已成為我國僅次于惡性腫瘤的第二殺手[1,2]，心肌細胞(Cardiomyocytes，CMs)損傷是參與多種心血管疾病發生發展的重要機制之一[3,4]。內質網是真核細胞中參與蛋白質組裝、折疊和轉運等的重要細胞器。在細胞中，蛋白質只能通過在內質網中正確折疊轉運后才能發揮正常功能，而當細胞發生感染、炎癥、過度氧化等造成的損傷時，內質網功能受損，蛋白質代謝障礙，最終會導致內質網應激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)的產生[5]。研究表明過長時間或過強的內質網應激會導致細胞的保護機制不能與損傷相抗衡，致使細胞凋亡，進而影響多種心血管疾病發生[6,7]。蛻皮甾酮(Ecdysterone，EDS)是一類植物甾酮，具有抗氧化，促進核酸、蛋白質等的合成，改善微循環，減輕血管內皮損傷等作用[8]。最新研究表明蛻皮甾酮對多種疾病的細胞凋亡有抑制作用，且其對心腦血管疾病的防治也有一定效果，并最新研究表明蛻皮甾酮在心肌細胞的損傷中有保護作用，但是關于EDS對損傷的心肌細胞中內質網應激的影響還未見報道[9]。本文以過氧化氫(H2O2)誘導的心肌細胞為研究對象，探討EDS抗心肌細胞損傷的作用及與內質網應激的關系。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 大鼠H9c2心肌細胞購于美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)；胰蛋白酶、胎牛血清和高糖DMEM培養基購自HyClone公司；蛋白Ⅰ抗和Ⅱ抗購于Pierce公司；AV/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自BD公司。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(Malonaldehyde，MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1實驗分組 心肌細胞H9c2培養于混合10%胎牛血清的高糖DMEM培養液中，并置于37℃,5% CO2培養箱中培養，細胞生長至90%融合狀態后傳達，取對數期生長狀況良好的細胞進行隨后實驗。Control組細胞為正常培養的H9c2細胞；H2O2組為加入H2O2(濃度分別為1×10-3、1×10-4、1×10-5mol/L)培養的H9c2細胞；EDS組在H2O2組的基礎上加入EDS(濃度分別為 25、50、100 μmol/L)進行心肌細胞培養。心肌細胞分組處理后各培養48 h，進行后續檢測。

1.2.2MTT法檢測細胞活力 各分組細胞加藥后，分別在24、48及72 h用MTT法檢測其細胞活力。各組H9c2細胞以6×104個/孔接種于96孔板，并且每組細胞設置3個復孔，繼續培養24 h。棄去原培養液后每孔加入MTT(5 g/L)20 μl，置于37℃培養4 h。棄去上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min使結晶充分溶解，使用酶標儀上檢測各組細胞吸光度值A490，并計算細胞活力，細胞活力=處理組A490/對照組A490×100%。

1.2.3流式細胞術檢測心肌細胞凋亡 各組H9c2細胞培養48 h后，用4℃預冷的PBS洗滌2次，隨后加入含0.0.2% EDTA的0.25%胰酶消化并且收集細胞。加入1×Annexin V 結合緩沖液1 ml，800 r/min離心8 min后棄去上清，加入結合緩沖液200 μl重懸細胞。并在懸液中加入5 mg/L的Annexin V-FITC 10 μl以及PI 5 μl，混勻后37 ℃避光孵育 30 min。最后以激發波長488 nm，發射波長530 nm ，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4Western blot法檢測蛋白水平 H9c2細胞培養48 h后收集細胞，加入RIPA細胞蛋白裂解液65 μl，提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度?？偟鞍捉汼DS-PAGE電泳分離，電泳后轉膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入1∶1 000稀釋的山羊抗鼠Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、caspase-4、caspase-7、caspase-12、GPR78(immunoglobulin binding protein)、CHOP(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein)和β-actin的Ⅰ抗，4 ℃環境輕搖過夜。過夜后加入1∶100比例稀釋的HRP-標記的兔抗山羊Ⅱ抗，室溫下孵育1 h，漂洗3次；最后結果用X線膠片曝光分析，Image-Pro Plus軟件處理，以待測蛋白與內參β-actin的灰度值比值作為蛋白的相對表達量。

1.2.5MDA含量的測定 用酶聯法測定心肌中細胞的MDA含量。按照MDA試劑盒說明，收集各組處理過48 h的心肌細胞，加入20%的三氯乙酸(Trichloroacetic acid solution，TCA)孵育20 min，隨后加入0.67%硫代巴比妥酸(Thiobar-bituric acid，TBA)和0.1 mol/L鹽酸(HCl)置于95℃水浴1 h。隨后離心，在532 nm波長處測量其吸光度值。

1.2.6SOD活性的測定 按照相關試劑盒使用說明完成超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)的活性檢測。在分組處理48 h的心肌細胞中加入水溶性四氮唑鹽工作液以及酶工作液，37 ℃下恒溫孵育20 min，540 nm波長處測量其吸光度值

2 結果

2.1H2O2降低心肌細胞活力，EDS對抗H2O2的損傷作用 如圖1所示，與對照組相比，H2O2處理能夠顯著抑制心肌細胞H9c2的活力，且其抑制效果具有藥物濃度和時間依賴性，即H2O2濃度越高，處理時間越長，H9c2細胞活力越低，因此后續實驗選用1×10-3mol/L為H2O2的誘導濃度。進一步檢測不同濃度EDS處理H2O2誘導心肌細胞的活力變化，結果表明H9c2在EDS處理組的細胞活力顯著升高，且呈濃度和時間依賴性，后續實驗中選取100 μmol/L為EDS的處理濃度。

2.2EDS 對H2O2作用下心肌細胞形態的影響 為探討EDS在H2O2誘導的心肌細胞損傷中的作用，采用100 μmol/L EDS處理1×10-3mol/L H2O2誘導的心肌細胞H9c2。如圖2所示，H2O2組中的心肌細胞與Control組相比，細胞密度降低，部分細胞胞體變小變圓，生長狀況明顯降低；而EDS處理抑制了H2O2誘導的細胞生長狀況下降。

2.3EDS抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡 流式細胞術檢測細胞的凋亡水平，結果如圖3A所示。1×10-3mol/L H2O2處理心肌細胞48 h后，H9c2細胞的凋亡率顯著上升。用H2O2和EDS共同處理心肌細胞，其細胞凋亡率與H2O2組相比明顯下降(P<0.05)。Western blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、caspase-4、caspase-7、caspase-12以及cleaved-caspase-3的蛋白水平變化(圖3C)，結果表明與Control組相比，H2O2組的Bcl-2的白表達水平顯著降低，而Bax、caspase-4、caspase-7、caspase-12、cleaved-caspase-3 cleaved-caspase-4、cleaved-caspase-7和cleaved-caspase-12的表達顯著升高。同時與H2O2組相比，EDS組的Bcl-2蛋白表達水平明顯提升，Bax、caspase-4、caspase-7、caspase-12和cleaved-caspase-3的表達顯著下降(P<0.05)。

圖1 EDS對H2O2誘導的心肌細胞活力的影響Fig.1 Effect of EDS on H2O2 induced H9c2 cell activityNote: s.n=3.

圖2 EDS對H2O2誘導的心肌細胞損傷的影響(×100)Fig.2 Effect of EDS on H2O2 induced H9c2 cell injury(×100)Note: The cells were observed under inverted microscope,n=3.

2.4EDS抑制H2O2誘導的心肌細胞內MDA水平升高以及SDO水平降低 檢測分組處理的心肌細胞內MDA含量和SOD活性。結果表明H9c2細胞經H2O2處理后MDA的含量明顯增加，SOD的活性顯著降低(P<0.05)。同時在H2O2處理的心肌細胞中加入EDS，MDA含量顯著降低，SOD活性提升(P<0.05)，見圖4。

2.5EDS抑制H2O2誘導的心肌細胞內內質網應激 為檢測心肌細胞內的內質網應激水平，我們用Western blot實驗檢測了內質網應激標志蛋白GRP78及CHOP的表達。結果表明，GRP78及CHOP的表達在H2O2組中比在Control組中顯著升高，并在經EDS處理后明顯降低(P<0.05)，見圖5。

圖3 EDS對H2O2誘導的心肌細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of EDS on H2O2 induced H9c2 cell apoptosisNote: ±s.n=3.*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs H2O2 group.

圖4 EDS對H2O2誘導的心肌細胞中MDA和SOD水平的影響Fig.4 Effect of EDS on content of MDA and activity of SOD in H2O2 induced H9c2 cellsNote: ±s，n=3.*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs H2O2 group.

圖5 檢測GRP78和CHOP 表達的變化反映EDS對H2O2誘導的心肌細胞內質網應激的影響Fig.5 Effect of EDS on endoplasmic reticulum stress in H2O2 induced H9c2 cells by determining protein expression of GRP78 and CHOPNote: *.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs H2O2 group.

3 討論

EDS是廣泛存在的一種類固醇激素，是許多中藥如川牛膝、懷牛膝、桑葉、澤瀉、白毛夏枯草等的有效成分。EDS對昆蟲生長和分化有促進作用，可導致昆蟲變態,而在哺乳動物中EDS也表現出能夠調控能量代謝、細胞免疫和氧化應激等許多藥理活性[10]。研究表明，EDS在缺氧的心肌細胞中具有抗凋亡作用[11]。心肌細胞的凋亡現象存在于多種心血管系統的生理和病理變化過程中，是參與并導致心血管疾病發生發展的重要細胞學基礎[12,13]。內質網應激反應介導的細胞凋亡是參與心血管疾病發病的重要凋亡機制之一。EDS與內質網應激之間的作用在心肌細胞損傷中還未有研究。為此，本文以H2O2誘導的心肌細胞為損傷模型，觀察EDS對心肌細胞損傷，內質網應激程度的影響，以期為以后的心血管疾病治療提供新的理論依據。

為了探討EDS保護心肌細胞損傷的機制，實驗中我們采用H9c2心肌細胞進行傳代培養，建立H2O2誘導損傷模型，觀察EDS對H9c2心肌細胞生長的影響。結果表明EDS能夠顯著抑制H2O2引起的心肌細胞活力下降，說明EDS能減輕H2O2誘導的心肌細胞生長損傷，且其作用皆有濃度依賴性，與蘇華等[9]的研究一致。細胞凋亡又稱程序性死亡，是嚴格受到調控的細胞自主死亡形式。本研究結果顯示H2O2可誘導心肌細胞凋亡升高，與其他研究者的報道一致[14]。促凋亡分子Bax以及抗凋亡蛋白Bcl-2分屬于Bcl蛋白家族。研究表明Bcl-2過表達對多種因素誘導的細胞凋亡有抑制作用，同時Bax通過調節Bcl-2的活性而起到促凋亡作用[15]。Caspase-3 是細胞凋亡過程中關鍵的蛋白酶，在多種凋亡途徑的下游充當效應蛋白，是重要的凋亡執行者[16]。本實驗通過檢測凋亡相關蛋白發現，H2O2能誘導Bax和cleaved-caspase-3的表達，同時促進凋亡蛋白caspase-4、caspase-7、caspase-12的表達，并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，進一步說明H2O2能夠誘導心肌細胞凋亡。同時，EDS處理可抑制H2O2誘導的凋亡，證明EDS能減輕H2O2誘導的心肌細胞損傷。

為了進一步探討EDS減輕心肌細胞損傷的保護作用機制，本研究測定了各組細胞中MDA的含量和SOD的活性。MDA是脂質過氧化反應的產物之一，其含量的高低與細胞的過氧化程度相關[17]。SOD是一種重要的抗氧化酶，其活性高低由機體清除氧自由基的能力決定[18]。本研究用MDA含量和SOD活性來衡量H2O2誘導的心肌細胞損傷程度。結果顯示與正常對照組相比，H2O2組的MDA含量明顯增高，SOD顯著下降，而與H2O2組相比，EDS組的MDA含量明顯下降，SOD含量顯著升高，這說明EDS對H2O2在心肌細胞中造成細胞損傷有逆轉作用。

內質網應激是內質網腔錯誤折疊蛋白聚積所形成的一種適應性反應，一方面未折疊蛋白反應(Unfolded protein response，UPR)被激活來抵御外界刺激所造成的有害影響，另一方面當UPR不足以重新構建內質網穩態時，UPR通路將誘導細胞凋亡信號而引起細胞凋亡[19]。為研究EDS對H2O2誘導心肌細胞中內質網應激的影響，我們檢測了內質網應激標志蛋白GRP78和CHOP的表達。GRP78又稱免疫球結合蛋白，是公認的內質網應激信號系統的上游開關分子，是ERS的關鍵調節蛋白[20]。CHOP是ERS誘導的細胞凋亡的關鍵調節分子。正常細胞中CHOP的表達非常低，而在細胞受到刺激產生持久且過強的內質網應激反應時，其表達顯著增加，從而誘導內質網相關性細胞凋亡，清除受損細胞[21]。本研究實驗表明，與正常對照組相比，GRP78和CHOP的表達在H2O2組中顯著升高，說明H2O2誘導的心肌細胞中發生內質網應激，對心肌細胞的凋亡有一定影響。此結果與沈志嘉等[14]的研究結果相一致。EDS組中GRP78和CHOP的表達比在H2O2組中明顯下降，說明EDS處理能夠降低H2O2誘導引起的內質網應激，從而抑制心肌細胞的凋亡。

綜上所述，本研究結果證實H2O2能夠引起心肌細胞內質網應激，誘導心肌細胞凋亡造成細胞損傷，而EDS處理可以通過抑制細胞中的內質網應激減輕心肌細胞損傷程度，說明EDS對心肌細胞損傷有一定的緩解作用。需要進一步在動物模型中研究，為EDS在心腦血管疾病的臨床應用提供理論支持。

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[收稿2017-05-12 修回2017-06-28]

(編輯 張曉舟)

EndoplasmicreticulumstressinfluencesprotectiveeffectofecdysteroneinH2O2inducedmyocardialinjury

GUOChang-Lei,LüFeng-Hua,WANGGuo-Qiang.

DepartmentofCardiology,FirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Xinxiang453002,China

Objective:To study the role of endoplasmic reticulum stress(ERS)on ecdysterone(EDS)influenced protective effect in H2O2induced myocardial injury.MethodsThe H9c2 cells were randomly divided into control group(normal cells),H2O2groups(the cells treated with H2O2at concentrations of 1×10-3,1×10-4,1×10-5mol/L,respectively);EDS group(the cells were exposed to H2O2and treated with EDS at concentrations of 25,50,100 μmol/L respectively).The cell activity and apoptosis were measured by MTT assay and flow cytometry,respectively.The protein levels of Bcl-2,Bax,cleaved-caspase-3,caspase-4,caspase-7,caspase-12,GRP78 and CHOP were deter mined by Western blot.The MDA content and SOD activity were detected by the MDA and SOD detection kits.ResultsThe cell activity was decreased,cell apoptosis was increased,the content of MDA was elevated,the activity of SOD was inhibited and the protein expression of GRP78 and CHOP were increased in H2O2group as compared with control group,which were all significantly reversed by EDS treatment(P<0.05).ConclusionEcdysterone exhibits a protective effect on the cardiomyocytes with H2O2induced injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress.

Endoplasmic reticulum stress;Ecdysterone;Cardiomyocytes;H2O2

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.009

①本文為河南省醫學科技攻關計劃項目(201403141)。

②新鄉醫學院第一附屬醫院檢驗科,新鄉 453002。

R542.2

A

1000-484X(2017)11-1642-05

郭長磊(1972年-),男,碩士,副主任醫師,主要從事心血管疾病的基礎與臨床治療研究，E-mail:guochanglei2017@163.com。

及指導教師：呂風華(1970年-),女,博士，主任醫師,主要從事心血管疾病的基礎與臨床治療研究，E-mail:ghy892017@163.com。