1，8-cineol作為流感疫苗佐劑提高流感疫苗免疫效果的實驗研究①

廖尚輝 栗 昀 徐玉琳 賴艷妮 徐培平

(廣州中醫藥大學，廣州 510405)

1，8-cineol作為流感疫苗佐劑提高流感疫苗免疫效果的實驗研究①

廖尚輝 栗 昀 徐玉琳 賴艷妮 徐培平

(廣州中醫藥大學，廣州 510405)

目的評價1,8-cineol作為流感疫苗佐劑提高流感疫苗免疫效果的作用。方法將80只BALB/c小鼠分為空白對照組、1,8-cineol組、HA組以及HA+1,8-cineol組，每組20只?？瞻讓φ战M正常飼養，HA組接種0.2 μg HA、HA+1,8-cineol 組接種(0.2 μg HA+100 mg/kg 1,8-cineol)、1,8-cineol組接種(100 mg/kg 1,8-cineol )。除空白組外，每組小鼠分別在第0、7、14天滴鼻免疫。第21天乙醚輕度麻醉小鼠，以10LD50流感病毒FM1感染每組10只小鼠。連續觀察6 d后，每組處死10只小鼠，收集血清，采用酶聯免疫法(ELISA)檢測血清中IgG、IgG1b、IgG2a、IgG2b在450 nm的吸光值(OD值)。摘取肺組織，計算肺指數，檢測肺病理。每組剩余10只小鼠感染15LD50FM1，觀察15 d，記錄感染鼠的死亡情況,計算感染鼠的生存率。結果與HA組相比，HA+1,8-cineol組能降低感染鼠的肺指數，緩解感染鼠的肺部病變，能夠提高血清中IgG、IgG1b、IgG2a的抗體水平，提高感染鼠的生存率。結論1,8-cineol作為疫苗佐劑，能夠加強流感疫苗的免疫效果。

1，8-cineol；流感病毒；疫苗佐劑

流感是常見的呼吸道傳染病，可引起較高的死亡率，尤其是新型毒株的出現，可引起世界范圍內的流感大流行[1，2]。接種流感疫苗是預防流感感染和阻止大流行的主要手段[3]。臨床中主要的流感疫苗有亞單位疫苗、滅活疫苗以及重組疫苗[4]。這些流感疫苗對于同一亞型的流感病毒能夠起到很好的保護作用，但是，由于流感病毒特殊的結構特點，不同亞型的毒株容易發生抗原漂移和抗原轉換，使得這些流感疫苗對新出現的或者不同亞型的流感毒株很難產生很好的抵抗作用，不能夠有效保護人體健康[5,6]。其次，由于蛋白合成和純化技術的發展，人類用疫苗向著純度更高，成分更加明確的方向發展。然而，疫苗抗原的純化往往導致疫苗“內佐劑”的消除，使得高純度疫苗的免疫原性降低[7]。早期的疫苗由滅活的全菌、減毒或滅活病毒或細菌類毒素組成[8]，這些純度很低的疫苗經常含有“內佐劑”，包括微量的有活性的外毒素或者是內毒素,可以增加疫苗的免疫原性，發揮較好的保護作用[9]。使用免疫佐劑增強高純化疫苗的免疫原性，是增強疫苗免疫效果的有效方法。

流感疫苗佐劑一直是疫苗研究領域的熱點問題。MF59是唯一一個通過美國食品藥品管理局(FDA)認證，可以應用于人的疫苗佐劑[10]。隨著流感病毒致病機制的不斷深入，抗流感病毒信號通路中相關分子或者受體作為流感疫苗佐劑的研究也受到重視[11]。Toll樣3(TLR3)、Toll樣4(TLR4)、Toll樣7(TLR7)受體作為流感疫苗佐劑已經進入臨床實驗中[12-14]。1，8-cineol 是從桉樹中提取的單體化合物，具有多種生物活性?，F代藥理學證實：1，8-cineol具有抗炎作用[15,16]。我們前期的實驗也已證實：1，8-cineol 可以降低由流感病毒引起的病毒性肺炎的病變程度，緩解炎癥反應[17]。為了研究1，8-cineol 是否具有佐劑作用，能否提高流感疫苗的保護效果，我們利用小鼠流感病毒模型，從肺部病理變化、抗體水平等方面評價其佐劑作用，現將報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物以及病毒株 80只BALB/c小鼠，SPF級，雌性，13～15 g,購自廣東省實驗動物中心。實驗動物合格證號SCXK(粵)20132-2014。流感病毒鼠肺適應株A/FM/1/47(H1N1)由中國醫學科學院醫藥生物技術研究所提供，經廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所病毒實驗室雞胚擴種后-80℃冷凍保存，LD50為106。

1.1.2藥物以及試劑 Influenza AH H1N1(A/California/07/2009)Hemagglutinin/HA protein(批號LC07AP0104) 購自北京義翹神州生物技術有限公司；1，8-cineol(批號：Y16D5S1)購自上海源葉生物科技有限公司。Mouse IgG2a ELISA Kit(批號:EK273-20150722);Mouse IgG1b ELISA Kit(批號:EK272-20150724);Mouse IgG2b ELISA Kit(批號:EK277-20160126);Mouse IgG ELISA Kit(批號:EK2731-20151224),均購自聯科生物。4%多聚甲醛購自Sigma,乙醚購自廣州斯壯生物科技有限公司。

1.1.3儀器 MC-1180型顯微鏡(廣州粵顯光學儀器公司)。DG5033A型酶聯免疫檢測儀(南京華東電子集團)。SUT5062型石蠟旋轉式切片機(德國labsun公司)。Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(Media Cybernetics Inc.Rockville,MD,USA)。

1.2方法

1.2.1動物分組以及給藥 80只BALB/c小鼠隨機分成4組，每組20只，分別為：空白對照組、1,8-cineol 組、HA組、HA+1、8-cineol組?？瞻捉M正常飼養，HA組滴鼻接種0.2 μg HA、HA+1,8-cineol組滴鼻接種(0.2 μg HA+100 mg/kg 1，8-cineol)、1,8-cineol組滴鼻接種(100 mg/kg 1，8-cineol)。連續免疫3周，每周一次。第4周乙醚輕度麻醉小鼠，以10LD50流感病毒FM1滴鼻感染小鼠,每組10只。連續觀察6 d后，每組處死10只小鼠，采集標本。每組剩余10只小鼠以15LD50流感病毒FM1滴鼻感染小鼠，觀察15 d，記錄感染鼠的死亡情況。

1.2.2肺指數 攻毒后第6天，每組取10只小鼠，摘取肺組織，生理鹽水洗兩次，濾紙吸干，稱取肺重。計算肺指數。計算公式為：肺指數=小鼠肺重(g)/小鼠體重(g)×100%。

1.2.3肺病理檢測 每組10只小鼠肺組織稱重后浸入到4%多聚甲醛溶液中固定，常規包埋，切片，HE染色，鏡檢。根據鏡下觀察肺組織病變程度，給予病理打分，具體評分標準參考文獻[18]。

1.2.4血清IgG、IgG1b、IgG2a以及IgG2b檢測 摘除眼球采血，收集血液，室溫放置30 min以上，離心10 min，3 000 r/min，收集血清，-20℃保存。采用ELISA試劑盒檢測有關抗體，血清稀釋5 000倍，檢測在450 nm吸光值(OD值),具體實驗步驟根據試劑盒操作。

1.2.5保護實驗 感染15LD50流感病毒FM1后，每組剩余10只小鼠觀察15 d，記錄感染鼠死亡情況和生存時間，評價1，8-cineol作為流感疫苗佐劑對感染鼠的保護效果。

2 結果

2.11，8-cineol 作為流感疫苗佐劑對肺指數的影響 肺指數是反映肺病病理變化程度的重要指標。流感病毒感染引起肺部炎癥變化，大量炎癥細胞浸潤，使得肺重量增加。感染流感病毒后，單獨1,8-cineol組感染鼠肺指數明顯增加，表明流感病毒引起肺部炎癥變化，而單獨滴鼻免疫1,8-cineol 沒有發揮保護作用。接種HA和HA+1，8-cineol 后，肺指數有所下降，尤其是HA+1，8-cineol 組，肺指數明顯降低，如圖1。

2.21，8-cineol作為流感疫苗佐劑對肺病理的影響 病毒性肺炎是導致流感病毒高死亡率的主要原因之一。流感病毒感染呼吸道黏膜，激活固有免疫和適應性免疫反應，導致大量的炎癥細胞和免疫細胞從外周淋巴組織遷移至肺組織，發揮抗病毒和抗炎的正常生理功能。但是，過多的炎癥細胞聚集，超過機體自身的承受能力，則會加劇肺部炎癥反應，導致更嚴重的肺部病變。NC組的小鼠肺組織結構清楚，支氣管以及小支氣管沒有發生病理變化，在肺泡中可見正常的紅細胞，可進行正常的氣體交換(圖2A)。1，8-cineol 組小鼠感染流感病毒后，肺組織發生嚴重的炎癥反應，肺結構不清楚，大量炎癥細胞和單核細胞浸潤支氣管和小支氣管，使之發生融合，肺泡充血，肺泡壁變厚(圖2B)。HA組感染鼠肺組織結構較清晰，但在支氣管和小支氣管都有較明顯的淋巴細胞浸潤以及在肺泡可見明顯的充血(圖2C)。HA+1,8-cineol 組感染鼠表現出明顯減輕的肺病理變化。肺組織結構清楚，炎癥反應不明顯，氣管以及支氣管和肺泡有輕微的炎癥反應(圖2D)。肺病理得分與病理變化表現一致。

2.31，8-cineol 作為流感疫苗佐劑對抗體的影響 抗體水平是評價免疫應答的重要指標。IgG是流感病毒激活適應性免疫應答而產生的具有特異性的保護抗體。流感雖為胞內感染，但是，體液免疫反應在抗流感感染過程中發揮著重要作用。IgG及其亞型的變化，反映了藥物作用于流感小鼠模型后所誘導的免疫水平變化。IgG2a是具有交叉保護作用的抗體，能夠中和不同亞型的流感病毒，這對于增強流感疫苗的免疫效果，擴大使用范圍具有重要意義。隨著免疫次數的增多，IgG及其亞型的水平隨之增強(圖3)。尤其是HA+1，8-cineol組，IgG,IgG1b以及IgG2a水平升高明顯。而IgG2b抗體水平在HA+1，8-cineol組和HA組兩組比較中，沒有統計學差異(P>0.05)。

圖1 1，8-cineol 作為流感疫苗佐劑對肺指數的影響(n=8)Fig.1 Effect of 1,8-cineol on lung index as influenza virus adjuvant(n=8)Note: Compared to the HA group，**.P<0.01，***.P<0.001.

2.41，8-cineol 作為流感疫苗佐劑對感染鼠生存率的影響 感染15LD50FM1后，1，8-cineol組小鼠在感染病毒后第2天開始死亡，生存率僅為30%,平均生存時間為(4±1.6)d；HA+1,8-cineol組的小鼠生存時間(13±1.2)d和生存率(75%)明顯高于HA組的生存時間(7±1.2)d和生存率(40%)。在生存實驗過程中，NC 組小鼠沒有出現死亡情況。如圖4。

圖4 1，8-cineol 作為流感疫苗佐劑對感染鼠生存率的影響Fig.4 Effect of 1,8-cineol on survival rate of mice infected influenza virus as influenza virus adjuvantNote: Compared to the HA group，**.P<0.01,***.P<0.001.

3 討論

疫苗佐劑在誘導免疫反應中的主要作用是提高機體免疫系統，提高抗原或者是免疫原的免疫應答反應。疫苗佐劑可以激活固有免疫反應以及提高抗原對免疫系統的遞承和刺激作用，進而激活適應性免疫應答。適應性免疫反應產生的各種細胞因子能夠促進B細胞產生IgG2a、IgG2b和IgG3抗體[19]。流感病毒雖為細胞內感染,但在流感病毒感染過程中所誘導的體液免疫發揮著重要作用,黏膜表面分泌的交叉性保護抗體sIgA主要作用于上呼吸道感染,而血清 IgG 主要在抵抗下呼吸道感染中發揮主要作用[20，21]。血清中的抗體IgG及其亞型可以中和病毒，調理細菌，激活補體的級聯反應，限制病原體增殖和擴散，防止組織損傷；其次，保護性抗體 IgG2的亞型與交叉保護作用有關，這在預防流感爆發以及應對新的毒株中發揮著重要作用[22,23]。

目前，佐劑根據其作用可以分為兩類：第一類是遞送系統，主要作用是延長抗原在接種部位的存留時間并招募更多的樹突狀細胞(DCs)參與應答。樹突狀細胞是連接固有免疫和獲得性免疫的主要細胞[24]。免疫佐劑可以增強不同類型的樹突狀細胞對抗原的攝取、加工和遞呈，增強免疫反應的強度和反應的持久性[25]。非生物佐劑，如礦物鹽或者是乳劑和微生物來源的佐劑，均是通過與樹突狀細胞亞群的接觸而發揮作用[26]。第二類是免疫調節劑，為單核細胞和DCs提供額外的分化和激活信號[27]。固有免疫和獲得性免疫沒有嚴格的區分，二者之間緊密接連。固有免疫系統能夠通過一組類特異性模式識別受體(PRR)識別病原體特異性分子模式(PAMPs)，而將其認為是“危險信號”，在疫苗接種部位的未成熟樹突狀細胞通過吞噬作用攝取抗原，同時通過與自然的PAMP或基于PAMP佐劑接觸成熟[28,29]。接下來成熟的樹突狀細胞轉移至淋巴結，在此，它們通過活化初始T細胞并遞呈抗原而啟動適應性免疫應答。在低純度的早期疫苗中觀察到的“內佐劑”現象，可能就是由于在這些疫苗制劑中含有PAMP。TLR3、TLR4,TLR7等分子受體主要是作為免疫調節劑發揮疫苗佐劑作用[30-32]，而MF59以及納米乳劑等佐劑形式則是作為抗原遞送系統，刺激樹突狀細胞的抗原提呈以及激活固有免疫而加強疫苗的免疫效果[33]。

1，8-cineol 作為流感疫苗佐劑免疫流感病毒感染鼠，能夠有效降低感染鼠的肺指數，緩解肺部病變，誘導較強的適應性免疫反應，提高特異性抗體IgG及其亞型水平，提高感染鼠的生存率，表明其加強了流感疫苗對感染鼠保護效果，具有疫苗佐劑的作用。但是，有關1，8-cineol作為疫苗佐劑機制需要我們進一步研究。

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[收稿2016-12-30 修回2017-07-18]

(編輯 倪 鵬)

1,8-cineolbasedinfluenzavaccinecanimprovevaccineefficacyonmiceinfectedinfluenzavirus

LIAOShang-Hui,LIYun,XUYu-Lin,LAIYan-Ni,XUPei-Ping.

GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China

Objective:To evaluate 1,8-cineol as vaccine adjuvants to enhance influenza vaccine immune efficacy.Methods80 BALB/c mice were divided into blank control group,1,8-cineol group,HA group and HA+ 1,8-cineol group,each group of 20.Blank control group normal breeding,HA group accepted HA protein 0.2 μg,the HA+1,8-cineol group was given 0.2 μg HA+ 100 mg/kg 1,8-cineol,1,8-cineol group was given 100 mg/kg 1,8-cineol.Except the blank group,other groups of mice intranasal immunized for three times interval of one week.At the fourth weeks each mice was infected with 10LD50 influenza virus FM1.On the 6 days after the infected,10 mice in each group were collected serum,using enzyme-linked immunoassay(ELISA)to detect serum IgG,IgG1b,IgG2a，IgG2b in 450 nm absorbance values(OD).Removed the lung tissue and measured the lung index and pathological.Remaining mice continue to observe 15 days and record the deaths,calculating the infected mice survival rate.ResultsCompared with the HA group,HA + 1,8-cineol group can reduce the lung index,alleviate the pulmonary lesions,improve the serum IgG,IgG1b,IgG2a，and increases the survival rate of infected mice.Conclusion1,8-cineol as vaccine adjuvants,can strengthen the immune effect of influenza vaccine.

1,8-cineol；Influenza virus；Vaccine adjuvant

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.002

①本文為國家自然科學基金項目(81072948,81470186)和廣東省自然科學基金研究團隊項目(S2012003000698)。

R332

A

1000-484X(2017)11-1606-05

廖尚輝(1992年-)，男，碩士，主要從事病毒性疾病的中醫藥防治方面研究，E-mail:408005007@qq.com。

及指導教師：徐培平(1974年-)，男，博士，副研究員，碩士生導師，主要從事病毒性疾病的中醫藥防治方面研究，E-mail: xupeiping@gzucm.edu.cn。