SARI基因促進急性髓性白血病細胞凋亡機制的探討①

薛 龑 陳梅環 唐永金 吳 瑋 王小花 徐建萍 林東紅

(福建醫科大學醫學技術與工程學院，福州 350004)

SARI基因促進急性髓性白血病細胞凋亡機制的探討①

薛 龑 陳梅環②唐永金 吳 瑋 王小花 徐建萍 林東紅

(福建醫科大學醫學技術與工程學院，福州 350004)

目的通過慢病毒載體過表達SARI(Suppressor of AP-1,regulated by IFN)基因，探討SARI基因促進急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)細胞凋亡的分子機制。方法構建SARI基因過表達的慢病毒載體，感染AML細胞HL-60和NB4，應用實時熒光定量PCR和Western blot對感染后細胞進行過表達的鑒定。兩株AML細胞均設空白對照組(CON組)、空載體對照組(NC組)及SARI組，應用Western blot檢測SARI過表達后兩株AML細胞組凋亡相關蛋白Bcl-2、Bcl-xl、Bax和凋亡途徑相關蛋白CytoC、Caspase8、Caspase9、Caspase3、Actived-Caspase3、PARP的表達變化。結果SARI組細胞的SARI mRNA和蛋白表達水平均顯著高于CON組和NC組(P<0.05)，表明SARI過表達成功。SARI過表達的HL-60和NB4細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl表達均下調，促凋亡蛋白Bax表達上調。CytoC表達增加，Caspase8、Caspase9、Caspase3剪切激活，Actived-Caspase3上調，PARP下調，PARP剪切體上調。結論SARI基因促進AML細胞凋亡可能是通過激活外源性凋亡途徑及與外源性凋亡途徑交叉的內源性凋亡途徑。

SARI；AML；細胞凋亡；凋亡途徑；分子機制

SARI (Suppressor of AP-1,regulated by IFN)基因是美國弗吉尼亞聯邦大學科學家在2008年用差減雜交(Subtraction hybridization)技術發現的一種新的抑癌基因[1]，其可干擾癌細胞分子抑制腫瘤生長和存活。研究報道在多種實體瘤組織中SARI基因的表達水平低于其對應的癌旁組織，進一步證實了SARI基因與癌癥的發生密切相關[2-8]。本課題組前期研究發現，SARI基因在白血病中也發揮抑癌作用，上調SARI基因可促進AML細胞的凋亡，抑制AML細胞的增殖，但其機制尚未明了。因此，本實驗主要研究探討上調SARI基因促進AML細胞凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 介導SARI過表達的慢病毒購自上海吉凱基因化學技術有限公司。熒光定量PCR(qPCR)試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司?？谷薙ARI抗體、Bax、Bcl-2源自Abcam公司。Bcl-xl、PARP購自美國Cell Signaling Technology公司。β-actin購自Bioworld公司。CytoC 購自碧云天生物技術研究所。Caspase8、Caspase9、Caspase3、Actived-Caspase3購自美國Signalway Antibody公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.2主要儀器及器材 低溫高速臺式離心機及低溫冰箱購自美國Thermo Fisher公司。凝膠成像儀購自天能公司。7500型實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。電泳槽、電泳儀購自北京六一儀器廠，轉膜裝置(DYC40C)購自Bio-Rad公司。微量加樣器購自Eppendorf公司。

1.1.3細胞來源與培養 HL-60和NB4細胞株為福建省血液病研究所提供。HL-60和NB4細胞分別采用含15%和10%胎牛血清的RPMI1640培養液，均置于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養箱中培養，2～3 d換液1次，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2方法

1.2.1細胞轉染 HL-60和NB4細胞均設空白對照組CON組、空載體對照組NC組及SARI組。取各組對數生長期細胞，調整細胞密度為5×103個/孔，接種于96孔板，分別加入MOI=100的病毒溶液，培養體系為100 μl，將處理好的細胞移置37℃，5%CO2及飽和濕度的培養箱培養。轉染8～12 h后，更換新鮮培養基，48～72 h后觀察GFP表達情況，確定病毒感染效率。

1.2.2qPCR檢測細胞中mRNA的表達 收集各組細胞，按照試劑盒說明書提取總RNA，逆轉錄生成cDNA，qPCR檢測SARI mRNA的表達。以GAPDH為內參。GAPDH引物序列為：F：5′-TCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′；R：5′-GCCCAATACGACCAA-ATCC-3′，SARI基因引物為：F：5′-GCCTAAGCCATGCACCTCTGT-3′；R：5′-TCTTCAGCTGCCTTTGTT-GCTC-3′，反應體系為20 μl，cDNA 1 μl、引物1 μl(含上下游引物各為5 pmol)、含有ROX的2×SYBR GreenMix 10 μl、去離子水 8 μl，每個樣本均設3個復孔，同時設置空白對照(以去離子水代替cDNA)，PCR反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火/延伸1 min,40個循環。

1.2.3Western blot檢測細胞中蛋白的表達 收集各組細胞，約 5×105個/組，PBS洗滌2次，加入RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白，BCA法定量。取待測標本40 μg，加入 5×loading buffer 2 μl，超純水補至10 μl，99℃，5 min 變性后上樣于10% SDS-PAGE 膠上電泳，轉膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉，分別加入稀釋的相應一抗，4℃孵育過夜。次日1× TBST洗滌3次，分別加入相應 HRP 標記的二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，1× TBST洗膜后用化學發光法定影顯影。采用 Gel-Pro analyzer 軟件系統對膠片進行圖像掃描和分析，目的蛋白的相對表達量為目的條帶與β-actin的灰度值之比。實驗獨立重復3次。

2 結果

2.1HL-60和NB4細胞SARI過表達的鑒定

2.1.1qPCR鑒定慢病毒轉染后HL-60和NB4細胞SARI mRNA的表達情況 結果顯示：兩株AML細胞的SARI組SARI mRNA表達水平均顯著高于CON組和NC組，差異有統計學意義(P<0.001,表1)，表明SARI基因過表達成功。

2.1.2Western blot鑒定慢病毒轉染后HL-60和NB4細胞SARI蛋白的表達情況 結果顯示：兩株AML細胞的SARI組SARI蛋白表達水平較CON組和NC組增高，差異均有統計學意義(P<0.05，圖1和表2)。

表1慢病毒轉染后HL-60和NB4細胞SARImRNA的變化情況

Tab.1ChangesofSARImRNAofAMLcellafterinfectedbylentivirus

CellsCONNCSARIHL-60/0.484924367±0.1715031.53385333±1.944401)NB4/0.8993085±0.1560059.09723333±0.10001)

Note：SARI group vs NC group，1)P<0.05.

圖1 慢病毒轉染后HL-60和NB4細胞SARI 蛋白水平的變化Fig.1 Changes of SARI protein expression level of HL-60 and NB4 after infected by lentivirus

2.2SARI過表達后HL-60和NB4細胞凋亡相關蛋白的變化情況 圖2和表3顯示，SARI過表達后HL-60和NB4細胞的凋亡相關蛋白表達發生變化，促凋亡蛋白Bax均上調(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl均下調(P<0.05)。

2.3SARI過表達后HL-60和NB4細胞凋亡途徑相關蛋白的變化情況 如圖3和表4所示，HL-60和NB4的SARI過表達組細胞的CytoC均上調(P<0.05)，Caspase3的作用底物PARP前體均下調(P<0.05)，而其活性剪切體均上調(P<0.05)。均有Caspase8、Caspase9 、Caspase3的剪切激活(P<0.05)，Actived-Caspase3均上調(P<0.05)，提示SARI過表達的HL-60和NB4細胞的外源性凋亡途徑及與外源性凋亡途徑交叉的內源性凋亡途徑激活。

圖2 Western blot檢測SARI基因過表達后各組細胞凋亡相關蛋白的變化情況Fig.2 Expression level of apoptosis related proteins after SARI overexpression

圖3 SARI基因過表達后各組細胞凋亡途徑相關蛋白變化情況Fig.3 Expression level of apoptotic pathway related proteins after SARI overexpression

表2慢病毒轉染后HL-60和NB4細胞SARI蛋白水平的變化

Tab.2ChangesofSARIproteinexpressionlevelofAMLcellafterinfectedbylentivirus

CellsCONNCSARIHL-600.0043927±0.000098760.0081894±0.000494340.0102756±0.000021541)NB40.0011791±0.000039820.0019915±0.000055330.0078482±0.000100051)

Note：SARI group vs NC group，1)P<0.05.

表3SARI基因過表達對HL-60和NB4細胞凋亡相關蛋白水平的變化情況

Tab.3ExpressionlevelofapoptosisrelatedproteinsafterSARIoverexpression

CellHL-60-CONHL-60-NCHL-60-SARINB4-CONNB4-NCNB4-SARIBcl-20.0299±0.00060.0305±0.00040.0194±0.00021)0.0878±0.00090.0622±0.00090.0222±0.00091)Bcl-xl0.0012±0.00000.0312±0.00030.0026±0.00001)0.1174±0.00410.0364±0.00100.0022±0.00011)Bax0.0743±0.00010.0284±0.00030.0484±0.00021)0.0009±0.00000.0062±0.00010.0369±0.00011)

Note：SARI group vs NC group，1)P<0.05.

表4SARI基因過表達后HL-60和NB4細胞凋亡途徑相關蛋白變化

Tab.4ExpressionlevelofapoptoticpathwayrelatedproteinsafterSARIoverexpression

CellHL-60-CONHL-60-NCHL-60-SARINB4-CONNB4-NCNB4-SARICytoC0.0005±0.00000.0004±0.00000.0524±0.00031)0.0003±0.00000.0001±0.00000.0395±0.00071)Caspase90.0007±0.00000.0550±0.00010.0030±0.00001)0.1448±0.00380.0448±0.03330.0163±0.00031)Caspase80.0015±0.00000.0052±0.00000.0035±0.00001)0.0053±0.00000.0093±0.00020.0063±0.00001)Caspase30.0104±0.00000.0067±0.00000.0037±0.00001)0.0176±0.00040.0095±0.00010.0038±0.00021)Actived-Caspase30.0000±0.00000.0001±0.00000.0050±0.00001)0.0006±0.00000.0108±0.00010.0268±0.00001)PARP0.0002±0.00000.0060±0.00000.0046±0.00001)0.01356±0.00000.0179±0.00010.0143±0.00011)PARPcleavage0.0002±0.00000.0024±0.00000.0124±0.00031)0.0001±0.00000.0001±0.00000.0060±0.00011)

Note：SARI group vs NC group，1)P<0.05.

3 討論

急性髓性白血病是血液系統常見的惡性腫瘤之一，AML的特征為幼稚粒細胞克隆性增殖凋亡減少且不伴有明顯的分化，臨床上分為多種亞型，目前大部分亞型的發病機制尚不十分清楚。故尋找特異性的治療手段，提高AML患者的療效和生存率，是目前亟待解決的問題之一。

SARI基因是最近美國科學家用差減雜交技術發現的一種新的抑癌基因[1]。SARI又稱為BATF2或ATF-like2，位于人類11號染色體長臂1區2帶和1區3帶(即11q12和11q13)之間，cDNA 含有2 140個堿基對，能夠編碼一種含274個氨基酸殘基的蛋白質，理論分子量為29.4 kD，包含三種外顯子，翻譯從第一個外顯子開始，終止密碼子位于第三種外顯子處，是一種包含亮氨酸拉鏈的I-IFN誘導早期反應基因，其通過干擾癌細胞分子的作用，抑制腫瘤的生長和存活。研究發現SARI基因在多種實體性腫瘤組織中的表達水平低于其對應的癌旁組織，表明SARI具有抑癌基因的生物學作用，并被證實其作用與抑制某些信號通路及轉錄因子有關[2-8]。盧星軒等[9]研究發現，在宮頸癌中，SARI發揮抑癌作用可能是通過抑制AP-1的轉錄、下調抗凋亡分子Mcl-1的表達實現的。SARI基因因其有望成為攻克某些癌癥的新的基因治療靶點，成為近期研究的熱點。

目前，對SARI基因抑癌生物學作用及其機制的研究主要集中在實體瘤方面，其與血液病相關的研究報道甚少。本實驗作為SARI基因在白血病中抑癌機制系列研究的一部分，主要研究慢病毒過表達上調SARI基因促進AML細胞凋亡的分子機制。

細胞凋亡途徑主要包括死亡受體介導的外源性凋亡途徑、線粒體介導的內源性凋亡途徑、B粒酶介導的細胞凋亡途徑以及內質網應激途徑[10]。線粒體凋亡途徑(又稱內源途徑)發揮作用與大量線粒體膜上分子的作用有關，并且受Bcl-2家族蛋白的調控。受凋亡刺激時，Bcl-2家族蛋白Bim、 Puma、Bid、Bad、Noxa等結合并抵抗Bcl-2家族的抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xl等)，從而使Bcl-2家族的促凋亡蛋白(如Bax)活化。本實驗研究顯示，SARI過表達的HL-60和NB4細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl表達明顯下調(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達明顯上調(P<0.05)，表明SARI基因可通過改變抗/促凋亡蛋白促進AML細胞凋亡。

Bax等Bcl-2家族促凋亡蛋白的活化可導致線粒體膜上的通道開放，CytoC等促凋亡因子從線粒體內釋放到細胞質中。釋放到胞質中的CytoC在ATP或dATP存在的情況下，與Apaf-1和pro-Caspase9結合形成凋亡小體，凋亡小體激活Caspase9，后者活化下游的凋亡執行分子Caspase3，引起Caspase的級聯反應，導致PAPR剪切活化，出現細胞凋亡的特征性變化如DNA片段化、染色質濃縮等，最終引起不可逆的細胞凋亡[11-13]。在外源性凋亡途徑中，由腫瘤壞死因子(TNF)家族的死亡受體通過死亡配體介導啟動、通過活化pro-Caspase8和pro-Caspase10，激活下游的Caspase3，導致細胞凋亡。在某些細胞中，外源性凋亡途徑和內源性凋亡途徑能夠交叉進行。在外源性凋亡途徑中Caspase8能裂解BID(BH3死亡結構域)形成tBID，tBID能易位到線粒體，活化線粒體凋亡途徑[14]。

本實驗結果顯示：SARI過表達后，HL-60和NB4胞質中的CytoC含量明顯增加(P<0.05)，提示線粒體內的CytoC釋放到胞質中；Caspase8、Caspase9 下調(P<0.05)，提示Caspase8、Caspase9剪切活化。 Caspase3下調(P<0.05)和Actived-Caspase3上調(P<0.05)，表明Caspase的級聯反應引起凋亡執行分子Caspase3的活化，進而其下游分子PARP前體的明顯下調(P<0.05)及其剪切體的明顯上調(P<0.05)，PARP剪切體可進入細胞核而執行凋亡功能。

綜上，本研究結果顯示過表達SARI基因可下調AML細胞中的抗凋亡蛋白、上調促凋亡蛋白。SARI基因通過外源性凋亡途徑及與外源性凋亡途徑交叉的內源性凋亡途徑是其促進AML細胞凋亡的分子機制之一。

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[收稿2017-06-26 修回2017-07-04]

(編輯 許四平 劉格格)

MechanismofSARIgenepromotingapoptosisinacutemyeloidleukemiacells

XUEYan,CHENMei-Huan,TANGYong-Jin,WUWei,WANGXiao-Hua,XUJian-Ping,LINDong-Hong.

TheSchoolofMedicalTechnologyandEngineering,FujianMedicalUniversity,Fujian350004,China

Objective:To explore the apoptotic mechanisms of acute myeloid leukemia(AML) cells by a lentivirus mediated-SARI(suppressor of AP-1,regulated by IFN) overexpression system.MethodsThe lentiviral vectors of overexpression SARI were transfected into AML cell HL-60 and NB4.Real-time quantitative PCR and Western blot were employed in the following evaluation tests.Both the cells were all divided into blank control group(CON group),empty vector control group(NC group)and SARI overexpression group(SARI group).Western blot was used to detect the expressions of apoptosis-related proteins Bcl-2,Bcl-xl,Bax and apoptotic pathway related proteins CytoC,Caspase8,Caspase9,Caspase3,Actived-Caspase3,PARP.ResultsThe SARI groups exhibited a high level of SARI mRNA and SARI protein when compared with CON group and NC group(P<0.05).In both the SARI groups,the expression of anti-apoptotic proteins Bcl-2,Bcl-xl were down-regulated and the pro-apoptotic protein Bax was up-regulated.CytoC increased,Caspase8,Caspase9 and Caspase3 decreased,Actived-Caspase3 up-regulated.PARP down-regulated,and PARP spliced variant up-regulated .ConclusionSARI might promote the apoptosis of AML cells through activing the exogenous and endogenous apoptotic pathways which crossed to exogenous.

SARI;AML;Cell apoptosis;Apoptosis pathway;Molecular mechanism

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.005

①本文受國家自然科學基金面上項目(81371879)資助。

②福建省婦幼保健院，福州 350001。

R733.72

A

1000-484X(2017)11-1621-05

薛 龑(1982年-)，女，實驗師，主要從事醫學技術實驗教學方面的工作，E-mail:xy0804@139.com。

及指導教師：林東紅(1965年-)，女，醫學碩士，教授，博士生導師，主要從事血液病的基礎與臨床研究，E-mail:lindh65@163.com。