血管活性腸肽對大鼠角膜堿燒傷后IL-1β的降低作用①

阮 玥 蔣 華 王光潔 高洪瑞 路振莉

(錦州醫科大學濟南軍區總醫院研究生培養基地眼科，濟南 250000)

血管活性腸肽對大鼠角膜堿燒傷后IL-1β的降低作用①

阮 玥 蔣 華 王光潔 高洪瑞 路振莉

(錦州醫科大學濟南軍區總醫院研究生培養基地眼科，濟南 250000)

目的探討血管活性腸肽對大鼠角膜堿燒傷后不同時期IL-1β的降低作用。方法將27只健康成年雌性Wistar大鼠，隨機分為A組(正?？瞻讓φ战M)、B組(堿燒傷生理鹽水對照組)、C組(堿燒傷血管活性腸肽治療組)。A組不處理，B、C組均制作右眼中度角膜堿燒傷模型。堿燒傷后B、C組分別用0.9%的生理鹽水、0.25 g/L血管活性腸肽滴眼液滴眼，每日4次。堿燒傷后每天用顯微鏡觀察眼前節情況，在堿燒傷后3、7、14 d通過亞甲藍染色測量角膜著色面積，計算角膜上皮愈合率。3、7、21 d時分別取下堿燒傷側角膜組織分為兩等份，一份HE染色觀察角膜組織結構，另一份進行角膜免疫組織化學法測定IL-1β的表達。結果7 d、14 d角膜上皮愈合率C組大于B 組(P<0.05)，差異有統計學意義。免疫組織化學法檢測IL-1β平均光密度值結果顯示：3 d時平均光密度值B組、C組分別為(1.62±0.69)×10-2、(0.98±0.45)×10-2；7 d時B組、C組分別為(1.42±0.62)×10-2、(0.71±0.22)×10-2；21 d時B組、C組分別為(0.37±0.24)×10-2、(0.13±0.16)×10-2；各時間點大鼠角膜IL-1β平均光密度值C組水平均低于B組(P<0.05)，差異具有統計學意義。結論血管活性腸肽能降低角膜堿燒傷后IL-1β的表達，下調免疫應激水平，減輕炎癥反應，促進堿燒傷后角膜的恢復。

血管活性腸肽；角膜；堿燒傷；白細胞介素-1β

角膜堿燒傷是常見的影響眼球安全且較為難治的眼外傷，堿燒傷后角膜可發生潰瘍或穿孔，合理而有效的治療尤為重要。近年來研究發現自身免疫反應在角膜堿燒傷病理變化過程中發揮著重要作用。Thiel等[1]發現在堿燒傷后，角膜中MHCⅡ類抗原陽性細胞和T淋巴細胞增多，引起自身免疫反應，導致組織的損傷。而IL-1β作為一種重要的前炎癥因子，可刺激多種細胞因子的表達，推動自身免疫反應的發生和發展，并與堿燒傷后角膜炎癥反應呈正相關[2,3]，因此降低IL-1β的表達，可能有利于堿燒傷后角膜的恢復。血管活性腸肽(Vasoactive intestinal peptide ,VIP)是一種由28個氨基酸組成的直鏈肽，是一種非膽堿能非腎上腺能神經介質[4]。VIP在許多器官和組織中發揮著免疫調節作用，例如VIP在肺損傷及干燥綜合征等免疫系統疾病中發揮著免疫調節作用[5]，通過抑制多種細胞因子的趨化和基質金屬蛋白酶的表達以調節局部組織的免疫失衡[6]。但關于其在角膜堿燒傷中作用的數據很少。本研究擬通過觀察VIP在角膜堿燒傷后對IL-1β表達的影響，探討血管活性腸肽在角膜中的免疫調節作用，觀察其對角膜堿燒傷后，將為角膜堿燒傷的臨床治療尋找新的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組 27只健康清潔級Wistar大鼠(山東大學醫學院實驗動物中心提供)，體重220～250 g，均為雌性，裂隙燈顯微鏡下檢查雙眼排除眼前節病變。隨機分為正?？瞻讓φ战M(A組，3只)、堿燒傷生理鹽水對照組(B組，12只)，堿燒傷血管活性腸肽治療組(C組，12只)。A組不處理，B、C組均制作右眼中度堿燒傷模型。堿燒傷后B、C組分別用0.9%生理鹽水、0.25 g/L血管活性腸肽滴眼液滴眼，每天4次。所有動物的飼養及處死均按照NIH的《實驗動物管理及使用指南》進行。

1.1.2主要試劑及儀器 血管活性腸肽( 美國Merck Millipore公司)用生理鹽水配制成的0.25 g/L滴眼液，IL-1β單克隆抗體(中國Wanleibio公司)，DAB顯色試劑盒(中國Solarbio公司)，顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，石蠟切片機(德國 Leica公司)。

1.2方法

1.2.1角膜堿燒傷模型的制備 27只健康成年雌性Wistar大鼠，堿燒傷模型建立前3 d用3 g/L鹽酸左氧氟沙星滴眼液滴眼，每天4次，預防感染。Wistar大鼠用100 g/L水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，4 g/L鹽酸奧布卡因滴眼局部麻醉，用棉簽拭去過多水分，將直徑3 mm的無菌單層濾紙浸入1 mol/L氫氧化鈉溶液中1 min，使其達飽和狀態，吸除多余液體，將濾紙片置大鼠右眼角膜中央30 s取下，用生理鹽水沖洗結膜囊1 min，此時在角膜中央可見圓形灰白色角膜燒傷區，燒傷后給予3 g/L左氧氟沙星滴眼液滴眼，每天3次；妥布霉素眼膏涂眼，每天1次，預防感染。

1.2.2活體觀察 堿燒傷模型制作24 h后，每天第1次滴藥前用裂隙燈顯微鏡觀察眼前段大體情況并進行記錄，角膜混濁的評分參照Holland標準[7]：0分：角膜無混濁；1分：角膜輕度混濁；2分：角膜混濁較重，可見虹膜紋理；3分：角膜混濁進一步加重，不能窺見虹膜，但可見瞳孔；4分：角膜完全混濁，看不到前房。B、C組于3、7、14 d進行角膜亞甲藍染色計算角膜上皮愈合率，拍照并輸入Digimizer圖像分析系統，按照 公式計算角膜上皮愈合率。結果進行統計學分析。

1.2.3取材、HE染色及免疫組織化學法檢測IL-1β 在3、7、21 d時A組隨機取1只，B、C組隨機各取4只大鼠頸椎脫臼法處死，摘除帶1 mm寬鞏膜的角膜組織，沿垂直中軸線分為兩等份，一份HE染色觀察角膜組織結構變化，另一份進行角膜免疫組織化學染色測定IL-1β表達。HE染色病理學檢查：4%多聚甲醛溶液內固定，包埋切片，切片脫蠟至水，蘇木素染色，鹽酸酒精分化，自來水反藍，伊紅染色，乙醇脫水，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察角膜各層的病理改變。角膜免疫組織化學染色：包埋，切片脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育15 min，PBS中浸泡5 min，重復3次。山羊血清封閉，一抗孵育，二抗孵育，辣根酶標記，DAB顯色，蘇木素復染3 min，封片，鏡檢。測定IL-1β免疫組化染色的平均光密度值(Mean optic density,MOD)，半定量的分析IL-1β的表達。

2 結果

2.1活體觀察角膜混濁度 ①堿燒傷后1 d：B、C組角膜上皮脫落，基質水腫混濁，角膜緣血管輕度擴張充血。②堿燒傷后3 d：B、C組角膜上皮缺損，基質層明顯水腫混濁，瞳孔及虹膜紋理隱約可見，B、C組差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。③燒傷后7 d：B組角膜混濁較C組明顯，B組出現1例角膜穿孔，B、C組差異有統計學意義(P<0.05，見圖1、表1)。④燒傷后14 d：B組角膜彌漫性水腫、混濁明顯加重。C組角膜水腫及混濁均減輕，角膜緣稍透明。B、C組差異有統計學意義(P<0.05)。⑤燒傷后21 d：C組角膜上皮愈合，角膜水腫混濁基本消退，角膜基本恢復透明；B組角膜上皮仍有點片狀缺損，角膜水腫混濁明顯。B、C組差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2角膜上皮愈合率情況 角膜堿燒傷后3 d，C 組上皮愈合率(41.9±0.06)%，與B組(37.5±0.05)%比較，差異無統計學意義(P<0.05)。角膜堿燒傷后7、14 d時B、C組差異均有統計學意義(P<0.05)。其中，C組染色區未見擴大，染色情況較穩定；B組染色區擴大及上皮再次脫落缺損，見表2。

2.3角膜病理組織HE染色 堿燒傷后3 d，B組角膜上皮水腫、部分缺失，基質層水腫邊界不清，基質層中可見大量中性粒細胞浸潤，基質層可見少量新生血管，管腔內充滿紅細胞；C組角膜上皮基底細胞呈水泡狀，較多炎癥細胞浸潤。燒傷后 7 d，B組角膜上皮細胞開始有修復，修復的上皮細胞邊界不清晰、形狀不規則、排列欠整齊，可見較多空泡，淺基質層膠原纖維排列紊亂，較多炎癥細胞浸潤，見圖2；C組角膜修復上皮約有2～3層細胞，淺基質層膠原纖維排列相對整齊，基質水腫略輕，炎癥細胞較少。堿燒傷后21 d，B組角膜部分上皮再次脫落，上皮細胞形態、排列均不規則，炎癥細胞減少，成纖維細胞增多；C組角膜上皮愈合較好，細胞排列趨于整齊，基質水腫減輕，炎癥細胞明顯減少。

Groups3d7d14d21dB2.50±0.523.42±0.513.58±0.513.83±0.38C2.33±0.492.42±0.512.75±0.452.42±0.50P0.4300.0000.0000.000

圖1 各組角膜活體觀察Fig.1 Corneal observationNote: A.Group B at 7 d,corneal perforation;B.Group B at 7 d.

2.4免疫組織化學法檢測角膜IL-1β的表達 IL-1β為胞漿著色，胞漿中出現棕黃色或棕褐色的非特異性著色者判為染色陽性，染色的深淺反映著陽性程度的高低。堿燒傷后3 d，B組角膜全層細胞胞漿呈深棕色；C組角膜上皮層胞漿呈棕色，堿燒傷后7 d，B組上皮層胞漿呈深棕色，基質層陽性表達減輕；C組少量細胞質陽性表達。堿燒傷后21 d，兩組著色程度均降低(見圖3)。測定堿燒傷后不同時期大鼠角膜IL-1β的平均光密度值，陽性表達的強弱與平均光密度值呈正相關。兩組角膜堿燒傷后3、7 d時IL-1β平均光密度增高，在21 d時下降。在各時間點上，B組IL-1β平均光密度均明顯高于C組，C組與B組相比差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

圖2 各組角膜結構(HE，×200)Fig.2 Cornea stained (HE，×200)Note: A.Group B at 7 d;B.Group C at 7 d.

圖3 各組角膜結構(IHC，×400)Fig.3 Cornea stained(IHC，×400)Note: A.Group B at 3 d;B.Group B at 7 d;C.Group C at 3 d;D.Group C at 7 d.

Groups3d7d21dB1.62±0.691.42±0.620.37±0.24C0.98±0.450.71±0.220.13±0.16P0.0140.0010.009

3 討論

本實驗結果表明堿燒傷后7、14 d時C組角膜上皮愈合率和角膜混濁度均優于B組，差異具有統計學意義(P<0.05)；堿燒傷后各不同時間點，C組IL-1β的平均光密度值均低于B組，且差異具有統計學意義(P<0.05)。VIP可能通過降低IL-1β的平均光密度值，減少炎癥因子的趨化作用，阻止自身免疫作用的放大效應，在改善角膜愈后和防止角膜穿孔中發揮著積極作用。文獻資料表明，IL-1β主要由活化的巨噬細胞分泌，在角膜堿燒傷后免疫炎癥反應中發揮著重要作用[8]。一方面角膜堿燒傷后產生的IL-1β可引起和維持角膜炎癥反應，促進多形核白細胞滲出，并對炎性細胞有趨化作用，引起角膜損傷處炎性細胞聚集，還可誘導基質金屬蛋白酶的產生，進一步加重角膜組織的損傷[9]。另一方面IL-1β能通過刺激多種炎癥因子的表達，激活NF-κB信號傳導通路，推動自身免疫作用的發展。

VIP已被證明是一種免疫調節肽，能有效地抑制活化免疫炎癥細胞[10]。VIP 主要通過結合VPAC1、VPAC2受體，并通過cAMP 依賴的蛋白激酶A轉導途徑；肌醇磷脂途徑；鳥氨酸脫羧酶多胺途徑發揮其生物學作用[11]。研究證實VIP可抑制活化的巨噬細胞分泌NO、IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子以及促進抗炎癥因子IL-10的產生。VIP通過上調巨噬細胞B7.2的表達，增加巨噬細胞對 CD41 T細胞的共刺激活性，從而使VIP處理的巨噬細胞獲得誘導Th2型細胞因子如IL-4和IL-5的能力，減少Th1型細胞因子如TNF-α和IL-1β的釋放，使得原始T淋巴細胞優先向Th2型細胞分化，抑制其向Th1型細胞分化[12,13]。此外，VIP可結合VPAC1受體通過cAMP依賴的蛋白激酶A途徑，抑制Th17細胞反應，發揮免疫抑制作用[14]。從正常的生理作用的角度來看，VIP可促進Th2型細胞的產生和長期存活，而Th2型細胞與器官的免疫赦免有關，例如腦和眼等器官中的免疫赦免是由存在的Th2型細胞因子產生的調節性T細胞介導的免疫偏離的活性過程。從病理學的角度來看，這些發現揭示了使用VIP及其類似物治療具有普遍的Th1背景的炎癥和自身免疫疾病的可能性，并部分解釋了VIP在內毒素性休克模型發揮良好的作用[15]。角膜堿燒傷后角膜組織中CD4+T淋巴細胞明顯增多，抗原刺激后的CD4+T淋巴細胞分化為Th1和Th2效應細胞，VIP通過降低Th1型細胞因子如IL-1β的產生，對Th1型細胞和Th2型細胞分化進行調節，抑制CD4+T淋巴細胞分化為Th1型細胞，從而下調角膜堿燒傷后的免疫炎癥反應。Koh等[16]發現VIP能保護角膜上皮細胞免受氧化應激的損傷。VIP 對細胞因子的調節作用的分子機制屬于轉錄水平，通過限制多種轉錄因子的重新表達或核遷移，同時減少cAMP反應元件結合蛋白的合成，使促炎因子的mRNA及合成的蛋白水平降低，通過相反的機制提高抗炎因子mRNA和蛋白水平[11,17-19]。Koh等[20,21]證實VIP是一個自分泌營養因子，可保護正常房水中的角膜內皮細胞免受H2O2或其他氧化作用的損害，同時可刺激角膜內皮細胞內cAMP的產生，VIP的這種刺激效應呈劑量和時間依賴關系。Tuncel等[22]發現VIP可降低堿燒傷后角膜組織中的多形核白細胞浸潤，表明VIP可能對堿燒傷角膜傷口愈合有益。VIP的生物學特性及作用機制為它在角膜堿燒傷的治療過程中奠定了豐富的理論基礎。

目前有關VIP在角膜堿燒傷中免疫調節作用的研究資料較少。本實驗發現將VIP的免疫學特性應用于角膜堿燒傷后，可降低IL-1β的表達，減少自身免疫炎癥對角膜的損害，在角膜透明度、角膜上皮愈合率和角膜HE染色方面都有著良好的表現，VIP可能改善角膜堿燒傷的愈后。本實驗尚存在一些不足，例如角膜堿燒傷的程度可能不均勻，主觀評價角膜混濁度可能存在誤差。目前國內外較多應用免疫抑制劑來降低角膜免疫炎癥反應，但免疫抑制劑對人體多系統均有不同程度的毒副作用。VIP將有可能為治療角膜堿燒傷提供新思路，VIP的應用前景將更加廣闊。

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[收稿2017-06-26 修回2017-08-02]

(編輯 許四平 劉格格)

歡迎訂閱和投稿《中國免疫學雜志》

EffectofvasoactiveintestinalpeptideonIL-1βexpressionaftercornealalkaliburninrats

RUANYue,JIANGHua,WANGGuang-Jie,GAOHong-Rui,LUZhen-Li.

DepartmentofOphthalmology,JinzhouMedicalUniversityandJi′nanMilitaryGeneralHospitalGraduateTrainingBase,Ji′nan250000，China

Objective:To investigate the effect of vasoactive intestinal peptide on IL-1β expression after corneal alkali burn.Methods27 healthy adult female Wistar rats were randomly divided into group A (normal blank control group),group B (alkali burn treated with saline group),and group C (alkali burn treated with vasoactive intestinal peptide group).Group A were not processed.Group B,C were made right eyes′moderate corneal alkali burn models.After inducing burn,group B and group C were followed respectively by 0.9% saline and 0.25 g/L vasoactive intestinal peptide eye drops,4 times per day.The corneal epithelial healing rates were calculated by measuring the corneal staining area by methylene blue staining at 3 d,7 d and 14 d after inducing burn.At 3 d,7 d and 21 d,the corneal tissues were removed and divided into two equal parts.The corneal tissues were observed by staining,and the expression of IL-1β were detected by immunohistochemistry.ResultsThe healing rates of corneal epithelium in group C were greater than those in group B at 7 d and 14 d(P<0.05).The mean optical density of IL-1β was measured by immunohistochemistry.The mean optical density in group B and group C at 3 d were (1.62 ± 0.96) ×10-2,(0.98 ± 0.45) ×10-2,respectively,which at 7 d were (1.42 ± 0.62) ×10-2,(0.71 ± 0.22) ×10-2,respectively,which at 21 d were (0.37 ± 0.24) ×10-2,(0.13 ± 0.16) ×10-2,respectively.The mean optical density of corneal IL-1β in group C were lower than those in group B(P<0.05).ConclusionVasoactive intestinal peptide can decrease the expression of IL-1β after corneal alkali burn,down-regulate the level of immune stress,reduce the inflammatory reaction and promote the recovery of cornea after alkali burn.

Vasoactive intestinal peptide;Cornea;Alkali burn;IL-1β

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.007

①本文為2014年度軍區后勤科研計劃重點課題(CJN14L017)。

R779.13

A

1000-484X(2017)11-1631-05

阮 玥(1991年-)，女，在讀碩士，主要從事角膜病方向研究。

及指導教師：蔣 華(1964年-)，男，博士，主任醫師，博士生導師，主要從事角膜病方向研究。