miR-126對結腸癌細胞生物學行為的影響及其在調控結腸癌EMT轉化中的作用①

魏海峰 米旭光 劉 磊 蘆小單 李首慶 譚 巖 方艷秋

(吉林省人民醫院醫學診治實驗中心，長春 130021)

·生物治療·

miR-126對結腸癌細胞生物學行為的影響及其在調控結腸癌EMT轉化中的作用①

魏海峰 米旭光 劉 磊 蘆小單 李首慶 譚 巖 方艷秋

(吉林省人民醫院醫學診治實驗中心，長春 130021)

目的觀察miR-126在不同轉移潛能的人結腸癌細胞系中的表達情況及其對結腸癌細胞增殖、侵襲轉移能力的影響并探討可能的作用機制。方法采用實時熒光定量PCR檢測結腸癌細胞系(SW480、SW620及HCT116)中miR-126的表達量。通過脂質體瞬時轉染法將miR-126過表達(miR-126 mimics)，并設置陰性對照組，然后采用CCK8法檢測細胞的增殖能力，細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力，Transwell侵襲小室實驗檢測細胞的侵襲能力，Western blot實驗檢測E-cadherin和Vimentin蛋白表達量的變化。結果相對于低轉移潛能的結腸癌細胞株SW480，miR-126在高轉移潛能的SW620和HCT116細胞中的表達降低。過表達miR-126可使SW620細胞增殖、遷移和侵襲能力降低，E-cadherin蛋白表達增加，Vimentin蛋白表達降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論低表達的miR-126與結腸癌的轉移密切相關，miR-126影響結腸癌細胞生物學行為的作用可能是通過調控EMT進程實現的。

miR-126；結腸癌；上皮細胞-間充質轉化；腫瘤生物治療

結腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，發病率也正逐年升高。早期結腸癌患者通過手術治療預后較好，但是晚期患者的5年生存率僅有20%左右，治療效果不佳，其死亡的主要原因是腫瘤的轉移[1]。結腸癌的轉移機制非常復雜，這一過程涉及癌細胞的上皮-間質轉換、侵襲黏附能力、血管生成等作用[2,3]，其中上皮間充質轉化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)是腫瘤轉移的關鍵啟動步驟，在結腸癌進展中發揮著主導作用。然而，EMT相關信號通路涉及多個分子、多條信號通路，任何針對單個分子的干預方法，都難以達到理想的逆轉效果。因此，有必要尋找新的手段和策略。最近研究表明，miRNA可以通過負性調控EMT相關基因的表達，在腫瘤轉移中起著重要的作用[4,5]。到目前為止，僅有少數miRNA被證實參與了腫瘤EMT的發生，miRNA在腫瘤尤其是結腸癌EMT中所起的作用及其分子機制還遠未闡明。本研究通過觀察miR-126的過表達對結腸癌細胞增殖、細胞周期、遷移和侵襲的影響及EMT相關蛋白表達的變化，觀察miR-126在結腸癌轉移復發中的作用并探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人結腸癌細胞株SW480、SW620及HCT116為本實驗室凍存；胎牛血清、RPMI medium 1640、DMEM培養基(Gibco，美國)；Trizol、LipofectamineTM2000(Life Technologies，美國)；Has-miR-126 mimics及陰性對照Cel-miR-67 mimics(上海百奧邁科，中國)；miR-126、U6引物(上海生工，中國)；RT-PCR試劑盒(Promega，美國)；SYBR Green Master(Roche，瑞士)； Matrigel基質膠、Transwell小室(Coming公司);CCK8試劑(北京碧云天公司);E-cadherin、Vimentin及GAPDH抗體(Santa Cruz公司)。其他常規試劑產自北京化工。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的RPMI1640在37℃、5%CO2的培養箱中培養，常規換液、傳代。

1.2.2脂質體轉染 按照LipofectamineTM2000說明書進行操作，用于轉染的細胞，在轉染前一天選取對數生長且狀態良好的細胞，胰酶消化，以1×105個/孔接種細胞數接種至6孔細胞培養板中。轉染當天細胞豐度可達60%～70%。每孔轉染miRNA mimics 5 μl(終濃度為50 nmol/L)，轉染后48 h，留取細胞、提取RNA或蛋白用于后續實驗。

1.2.3總RNA提取和qRT-PCR檢測 Trizol法提取結腸癌細胞株總RNA。紫外分光光度計測量純度和濃度。按逆轉錄說明書將1 μg RNA逆轉錄為cDNA。將得到的cDNA 5倍稀釋用于熒光定量PCR反應。使用2×SYBR Green Master在ABI7500熒光定量PCR儀上測定。miRNA表達以U6作為內參。引物序列：hsa-miR-126:頸環引物5′-GTCGTA TCCAG TGCAG GGTCC GAGGT ATTCG CACTG GATAC GACCG CATT-3′，miR-126-3p forward primer:5′-GTCTC GTACC GTGAG TAAT-3′，miRNA Universal primer:5′-GTGCA GGGTC CGAGGT-3′；U6 forward primer:5′-CTCGC TTCGG CAGCA CA-3′，reverse primer:5′-AACGC TTCAC GAATT TGCGT-3′。以2-ΔΔCt法計算每組細胞miR-126的表達量。

1.2.4CCK-8實驗 細胞以5×103個/孔接種于96孔板，連續培養4 d后，每孔加入10 μl CCK8試劑與90 μl培養液，培養箱內反應2 h后，酶標儀測定在490 nm處波長的吸光度(A)，每組設6個復孔，計算平均值，重復實驗3次。

1.2.5細胞劃痕實驗 將細胞以5×105個/孔接種于6孔板中，培養箱中孵育培養，待細胞長滿至80%時，用10 μl微量移液頭消毒后在細胞板上垂直劃痕，PBS洗滌細胞3次，去除脫落的細胞，加入無血清培養基。于實驗第1天及培養48 h后倒置顯微鏡下觀察各組細胞的遷移情況。

1.2.6Transwell侵襲實驗 接種前2 h用無血清培養基稀釋Matrigel膠，以50 μl/孔的體積鋪于小室上，放置于培養箱內2 h，細胞饑餓24 h后調整濃度為5×105ml-1，上室接種200 μl細胞懸液，下室加入600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養液。繼續培養24 h后取出Transwell小室，棄去孔中培養液，FBS洗滌，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，用棉簽擦去上室Matrigel膠和未穿過膜的細胞，PBS清洗、干燥。倒置顯微鏡下隨機選取5個高倍視野計數穿過膜的細胞數，計算平均值，重復實驗3次。

1.2.7Western blot實驗 提取細胞總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，電泳、轉膜、脫脂奶粉封閉后，加入目標蛋白一抗4℃孵育過夜，與辣根過氧化酶標記二抗室溫反應、孵育后，利用膠片曝光、顯影、定影，圖像分析儀行膠片掃描，分析灰度值。

2 結果

2.1不同結腸癌細胞中miR-126的表達水平 如圖1所示，相對于結腸癌細胞株SW480，miR-126在結腸癌細胞SW620和HCT116中的表達明顯更低。

2.2結腸癌細胞SW620轉染miRNA mimics后miR-126的表達情況 以脂質體LipofectamineTM2000轉染miR-126 mimics入SW620細胞中，終濃度為50 nmol/L，Cel-mir-67 mimics為陰性對照(Negative control,NC)，以U6為內參。數據以2-ΔΔCt方式表示。實驗結果顯示(圖2)，轉染miRNA mimics 48 h后，可使低表達miR-126的結腸癌細胞株SW620中此miRNAs的表達顯著上調(P<0.01)。

圖1 miR-126在不同結腸癌細胞中的表達差異Fig.1 Expression of miR-126 in different colon cancer cells

圖2 結腸癌細胞SW620轉染miRNA mimics 后miR-126的表達Fig.2 Expression of miR-126 in colon cancer cell SW620 after mimics transfectedNote: Compared with NC group，**.P<0.01.

2.3過表達miR-126對細胞增殖的影響 CCK8法結果顯示：隨著培養時間的延長，過表達miR-126組結腸癌細胞SW620的增殖能力從第3天后開始比陰性對照組下降，至第4天時差異有統計學意義(P<0.05)，表明miR-126具有抑制結腸癌細胞SW620增殖的能力(圖3)。

2.4劃痕實驗檢測miR-126對細胞遷移能力影響 對結腸癌細胞SW620進行劃痕處理后，48 h后觀察細胞的遷移情況，陰性對照組及miR-126 mimics轉染組劃痕區域相對寬度分別為(44.67±2.34)%及(62.47±3.16)%。miR-126 mimics轉染組劃痕細胞斷端的距離較陰性對照組顯著寬大，差異有統計學意義(P<0.05)，表明miR-126可抑制SW620細胞的遷移能力。

圖3 miR-126 mimics對結腸癌細胞SW620增殖能力的影響Fig.3 Effect of miR-126 mimics on proliferation of colon cancer cell SW620 after mimics transfectedNote: Compared with NC group，*.P<0.05.

圖4 Western blot檢測SW620細胞E-cadherin和Vimentin蛋白表達Fig.4 Expression of E-cadherin and Vimentin protein in SW620 cells

2.5Transwell小室檢測miR-126對細胞侵襲能力影響 Transwell小室結果顯示，miR-126 mimics轉染組穿過濾膜遷移至下室的細胞個數為(74.00±6.58)個，較陰性對照組(186.40±9.74)個顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05)，表明miR-126具有抑制結腸癌SW620細胞侵襲的作用。

2.6Western blot檢測細胞E-cadherin和Vimentin蛋白表達情況 Western blot結果顯示(圖4)，與陰性對照組相比，miR-126 mimics轉染組SW620細胞E-cadherin的表達增加，而Vimentin表達降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

EMT是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，是導致上皮來源的惡性腫瘤細胞發生侵襲和轉移的關鍵步驟，因此研究結腸癌EMT發生的分子機制，尋找可以逆轉結腸癌EMT的重要分子靶點，在關鍵步驟對結腸癌轉移進行干預，理論上可更有效抑制結腸癌轉移。然而，EMT相關信號通路涉及多個分子、多條信號通路，任何針對單個分子的干預方法，都難以達到理想的逆轉效果。因此，有必要尋找新的手段和策略。由于單個miRNA可以同時調控多個靶基因的表達，靶向miRNA的干預理論上能更有效地逆轉腫瘤。例如ZEB1 和ZEB2 已被多名研究者證實為miR-200家族的直接靶基因，在其3′-UTR區域存在多個可被miR-200家族成員互補結合的位點，外源性過表達miR-200c 可以下調ZEB1 的表達進而促進上皮細胞標志分子E-cadherin 的表達，從而抑制腫瘤EMT的發生[6-8]。

miR-126同樣作為一種“抑癌性miRNA”，已在多項研究中證實其在正常組織中高表達、腫瘤組織中低表達[9,10]。本研究組前期工作亦證實，miR-126在結腸癌組織中較正常結腸組織和癌旁組織表達降低，且和淋巴結轉移具有明顯聯系，提示miR-126可能在結腸癌的復發和轉移中具有重要的作用。結腸癌細胞株SW480是一種低轉移潛能的細胞系，而SW620和HCT116為高轉移潛能的細胞系。研究已證實，不同轉移潛能的細胞系亦具有明顯的EMT表型差異。因此本研究首先觀察了不同轉移潛能的細胞系中miR-126的表達差異，結果證實相對于低轉移潛能的結腸癌細胞SW480，miR-126在結腸癌細胞SW620和HCT116中的表達明顯更低。對miR-126低表達的SW620細胞轉染miRNA mimics后，發現可以抑制細胞的增殖、遷移和侵襲能力，進一步提示miR-126在結腸癌的發生發展中具有重要的作用。

本研究結果還表明：miR-126可以促進SW620細胞E-cadherin的表達增加，降低Vimentin的表達，提示過表達miR-126有助于抑制結腸癌EMT的發生。EMT的發生發展涉及多條信號通路，例如RhoA信號通路、EGFR/PI3K/Akt信號傳導通路參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、血管生成，通過EMT調控方式參與腫瘤細胞侵襲和轉移[11,12]。低表達的miR-126可能通過負調控相關靶基因，激活信號通路，促進EMT的發生，加速結腸癌的轉移和復發，具體機制有待于進一步研究。

綜上，結腸癌中miR-126的低表達可能存在高轉移及復發風險，miR-126抑制結腸癌細胞SW620增殖、遷移及侵襲的機制可能是通過抑制EMT過程實現的，miR-126可能成為新的結腸癌分子預警標志和新的治療靶點。

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[收稿2017-07-11]

(編輯 張曉舟)

RoleofmiR-126ineffectofbiologicalbehaviourandepithelialtomesenchymaltransition(EMT)inhumancoloncancercells

WEIHai-Feng,MIXu-Guang,LIULei,LUXiao-Dan,LIShou-Qing，TANYan,FANGYan-Qiu.

CenterforMedicalTreatmentandDiagnosis,JilinProvincePeople′sHospital,Changchun130021,China

Objective:To investigate the expression of miR-126 in human colon cancer cell lines with different metastatic potential and its effect on the proliferation,invasion and metastasis of colon cancer cells,and to explore the possible mechanism.MethodsThe expression of miR-126 in human colon cancer cell lines (SW480,SW620 and HCT116) was determined by Real-time fluorescence quantitative PCR.miR-126 mimics were transiently overexpressed in SW620 cells throuIgh liposome transfection and the negative control group was set up.The proliferation ability of cells was detected by CCK8 method and the mobility of cells was detected by wound healing assay and Transwell migration and invasion assay.The expression of E-cadherin,Vimentin was determined by Western blot.ResultsThe expression of miR-126 was decreased in SW620 and HCT116 cells with high metastatic potential compared SW480 cells with low metastatic potential.The overexpression of miR-126 significantly inhibited the proliferation,migration and invasion ability of SW620 cells and Western blot indicated that miR-126 overexpression increased the expression of E-cadherin and decreased the expression of Vimentin in SW620 cells,which was significantly different from that of negative control(P<0.05).ConclusionLow expression of miR-126 is closely related to metastasis of colon cancer and the effect of miR-126 on the biological behavior of colon cancer cells may be mediated by the regulation of the EMT process.

miR-126；Colon cancer；EMT；Tumor biological therapy

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.012

①本文受吉林省科技廳自然科學基金(20150101178JC)、吉林省人社廳省人才開發資金(2016年度)和吉林省科技廳重點實驗室建設專項基金(20160622008JC)資助。

R392R730.5

A

1000-484X(2017)11-1658-04

魏海峰(1978年-)，男，博士，助理研究員，主要從事腫瘤基礎及方面的臨床研究,E-mail：whfweb@163.com。

及指導教師：方艷秋(1968年-)，女，博士，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事腫瘤生物治療基礎與臨床方面的研究,E-mail：yq.fang@163.com。