骨髓間充質干細胞對大鼠腦創傷后認知功能的影響

王英杰 王 晶 石 鑫

(承德醫學院，承德 067000)

骨髓間充質干細胞對大鼠腦創傷后認知功能的影響

王英杰 王 晶 石 鑫

(承德醫學院，承德 067000)

目的探討大鼠在腦創傷后，骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)移植對大鼠認知功能的影響。方法體外分離、培養雄性3周齡SD大鼠BMSCs傳至3代備用。選取60只SD雌性大鼠隨機分為3組(n=20)、對照組(Control group)、模型組(Model group)、BMSCs治療組(BMSCs treatment group)。使用腦皮質挫傷撞擊儀制作大鼠腦創傷模型，分別在模型建立成功后的第1、7、14、28天BMSCs治療組給予BMSCs(1×106ml-1)干預治療。另取20只大鼠行水迷宮測試，每組劃分為傷后6、7、8及9 d四個時間點。HE染色法檢測腦組織形態學變化；干濕比重法檢測腦組織水含量；Morris檢測法檢測大鼠的空間學習記憶能力；神經運動功能評分檢測分析神經功能狀態；礦場實驗檢測大鼠的空間學習記憶能力。結果干濕比重法檢測結果顯示與對照組相比，模型組均明顯高于對照組(P<0.05)，治療組在每個時間點的水含量與模型組相比又顯著的下降；水迷宮檢測結果，模型組在傷后第8天和第9天搜索安全島潛伏期明顯要比對照組時間增加，差異有統計學意義(P<0.05)。治療組在傷后第8天以及第9天搜索安全島潛伏期要比對照組有顯著的縮短；神經功能評分結果顯示，與對照組比，模型組的大鼠在后肢抓持反射、觸須誘發前肢定位以及側向墊步的測試中都有不正常的表現，導致功能評分降低，具有統計學意義(P<0.05)，治療組和模型組比，各項的功能評分有顯著的升高。結論通過對行為學相關實驗的檢測，數據顯示在大鼠腦創傷后BMSCs能夠在一定程度上對神經認知功能起到恢復的作用。

BMSCs；創傷性腦損傷；HE；水迷宮

現階段的研究顯示，創傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)后，預防神經細胞的死亡是挽救腦創傷患者最直接的最有效的手段。為了達到這樣的效果，有學者已經提出，在細胞的上游切斷細胞的啟動，能夠在一定程度上阻止腦損傷進一步惡化，進而達到預期的臨床治療作用[1]。當TBI發生后，創傷性的主要作用位置就在大腦的海馬區，無論是原發性的創傷，還是出現繼發性的創傷，這些都是左右海馬區正常工作的主要誘因[2]。在創傷發生后，因為海馬的破壞，致使其所控制的學習、記憶等功能出現了破壞[3]?，F代科技的進步，使得行為學自動分析技術越發的完善，進行長時間、實時的觀測記錄動物行為已經不再是難以實現的問題，新技術以及新儀器的應用，既可以節省人力，也能夠降低肉眼直觀導致的誤差，特別是針對大鼠的認知、需要長時間觀測的實驗，都有著顯著的優點[4]?，F階段實時行為檢測系統已經運用到了失眠、自閉癥等多項研究領域[5]。在TBI后也使常用行為學檢測手段如空間記憶、神經功能評分等。通過這些行為學實驗方法的檢測能夠更好地反映神經功能的實時狀態。

1 材料與方法

1.1動物 BMSCs的供體動物：SPF級幼年雄性SD大鼠8只，3～5周齡，體重90～110 g。BMSCs的受體動物：SPF級成年雌性SD大鼠60只，體重180～220 g，均購自北京維通利華動物公司。

1.2方法

1.2.1BMSCs的分離及培養 使用乙醚麻醉大鼠，然后脫頸處死大鼠，在無菌條件下將股骨和脛骨分離，暴露骨髓腔。用DMEM高糖培養基沖洗骨髓腔，并收集沖洗液，1 000 r/min低溫離心10 min后棄去上清液，用10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基重懸細胞。計數后按1×106個/cm2密度接種于培養瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養，48 h后進行第一次換液，第二次以后換液間隔2～3 d 1次。待細胞95%融合時，使用0.25%胰酶消化，按1∶2的比例進行傳代，細胞傳至第3代用于實驗。

1.2.2實驗動物與分組 SPF級健康成年雌性SD大鼠60只，體質量180～220 g。在實驗前讓大鼠自由進食飲水，適應性飼養一周。將其隨機分為3組：對照組、模型組、BMSCs治療組。治療組分別于造模成功后第1、7、14、28天經尾靜脈注射BMSCs與DMEM懸液1.0 ml(1×106ml-1)，對照組和模型組注射等劑量的DMEM。

1.2.3腦組織形態學檢測 大鼠采取腹腔麻醉法，使用10%水合氯醛，按照0.3 ml/100 g的劑量對大鼠進行麻醉，麻醉后將大鼠斷頭，分離腦組織，于視交叉后1 mm和6 mm的位置冠狀面切開，對組織進行修剪，最后剩下大鼠腦的海馬位置，在4%多聚甲醛固定液中固定48 h，按照梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋、5 μmol/L連續切片。進行HE染色，光學顯微鏡下觀察，拍照留圖。

1.2.4腦組織含水量測定 同樣采取腹腔麻醉法，麻醉大鼠，分離出整個腦組織，去除小腦，使用濾紙吸去腦組織表面的水分，然后稱其濕重。再用錫紙將其封閉，入烤箱內烘干24 h，取出后稱干重，多次測量直至重量不再出現變化。腦組織的水含量=含水量(濕重-干重)/濕重×100/%。

1.2.5神經運動功能評分 ①后肢抓持反射試驗(Grasping reflect of the hindpaws)將大鼠抓起虛握大鼠軀干，拇指和食指環抱位于大鼠前肢腋下。用刷子輕刷大鼠的后肢第1、2趾間位置。發生接觸后，正常大鼠會出現后肢的抓持反應，計1分；無反應代表有損傷存在，計0分。每只大鼠檢測3次，記錄總分。雙側后肢測試滿分為6分。②觸須誘發前肢定位試驗(Vibrissae-evoked forelimb placing)將大鼠軀干及后肢固定。然后使大鼠觸須與板狀平臺邊緣相接觸，以誘發前肢前伸的定位反應。在5 s內出現反應，表示反射良好，計1分；沒有反應或定位失敗，計0分。同樣對每只大鼠檢測3次，滿分為6分。③側向墊步試驗(Lateral stepping)檢測大鼠全部肢體功能，將大鼠置于圓形桌面上中央，讓大鼠以肢體觸碰感知其位置變化。沿每個肢體活動相反方向緩慢推動大鼠使之側向移動，觀察其步態調整情況。正常大鼠能夠重復的步態調整，計1分；反之，計0分。對全部肢體測試3次，滿分為12分。以上滿分為24分，分別記錄對照組、模型組、BMSCs治療組分值后進行統計學分析。

1.2.6Morris水迷宮測試 對照組、模型組、治療組大鼠分別于傷后第6、7、8、9天進行水迷宮測試。檢測時，把安全島采取隨機的方式放到水迷宮四個象限(N、S、E、W)中的一個象限中，加水，高過安全島1 cm，水的溫度維持在22～24℃，攝像機及計算機會自動追蹤大鼠的活動路線，以及尋找時間。180 s內仍沒找到安全島，則潛伏期時間為180 s。

1.2.7礦場實驗 實驗需要在相對安靜隔音的房間開展，每次檢測，都應該是相同的時間點。大鼠輕輕放到中心方格內，然后運用實驗分析軟件進行檢測，檢測內容有大鼠的行走總路程，中央活動時間，站立次數，修飾行為。每一只大鼠檢測結束后都要用75%的酒精對礦場進行清洗，確保下次實驗正常進行。

2 結果

2.1BMSCs的形態學觀察 原代BMSCs在48 h之內貼壁，以分散的克隆聚集方式增殖，細胞形態基本為均勻星形或梭形，核居中，偶有寬大扁平的多邊形細胞。經過BMSCs純化，其他非貼壁細胞，通過換液逐漸減少。2 周后原代細胞 95% 融合，進行傳代。傳代后細胞呈現漩渦狀和放射狀集落生長傾向，隨著傳代次數增加，細胞形態更為均一，為梭形成纖維細胞樣，見圖1。

2.2HE染色組織形態學改變 HE染色結果顯示，在對照組中腦組織結構沒有發生改變，血管管腔中沒有發現異常，血管的管壁平整，神經細胞形態規則；在創傷后24 h，模型組神經元細胞胞體出現形狀改變，胞漿染色降低，細胞核出現深度染色，能夠看到在細胞之間出現了明顯的間隙，并且伴有壞死的神經元細胞出現，治療組與模型組比較病理改變明顯減輕，見圖2。

2.3腦組織含水量測定結果 在對照組中，大鼠腦創傷后腦組織水含量在各時間點基本沒有差異。模型組大鼠腦組織水含量隨時間變化呈現出升高趨勢，明顯高于對照組(P<0.05)，這說明在腦創傷后的腦組織出現了明顯的腦水腫；治療組中各時間點含水量與模型組相比都有所下降，但均明顯高于對照組的表達(P<0.05)。見圖3，表1。

圖2 HE染色結果(×200)Fig.2 Pathological change of tissue in HE(×200)Note: A.Control group;B.Model group;C.BMSCs treatment group.

2.4神經運動功能評分結果 對照組評分為24分，模型組評分在7～9分之間，治療組評分在15～18分之間。和對照組相比，模型組中，大鼠在后肢抓持反射、觸須誘發前肢定位以及側向墊步的測試中都有不正常的表現，導致功能評分降低，具有統計學意義(P<0.05)；治療組和模型組相比，各項的功能評分有顯著的升高，這也就是說明大鼠的運動功能得到了一定改善(P<0.05)，見圖4，表2。

2.5Morris水迷宮結果 因為在腦創傷后，大鼠的運動能力會受到一定的影響，所以設置的實驗時間在每組創傷后的第6、7、8、9天進行Morris水迷宮檢測。實驗結果顯示，模型組在傷后第8天和第9天搜索安全島潛伏期明顯要比對照組時間增加，差異有統計學意義(P<0.05)。治療組在創傷后第8天以及第9天搜索安全島潛伏期要比對照組有顯著的縮短，說明大鼠的記憶功能得到了一定的恢復，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5A～C、圖6、表3。

表1腦組織含水量測定結果(%)

Tab.1Resultsofdeterminationofwatercontentinbraintissue(%)

GroupsTime1d7d14d28dControl69.21±1.7968.19±2.0169.23±1.8270.12±1.90Model74.42±1.6175.79±1.791)79.03±1.901)79.69±2.021)Treatment73.23±1.7274.63±1.872)75.11±1.832)75.75±1.982)

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs model group.

圖3 腦組織含水量測定百分比Fig.3 Brain water content was determined as percentage of dry/wet ratioNote: *.P<0.05 vs control group;**.P<0.05 vs model group.

TimeGontrolgroupModelgroupTreatmentgroup48h24.00±0.009.51±0.571)17.97±0.482)

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs model group.

2.6礦場實驗結果 對照組大鼠的行走的總路程、中央格活動的時間、直立的次數和修飾行為次數最少，模型組大鼠行走的總路程、中央格活動的時間、直立的次數和修飾行為次數少于對照組(P<0.05)；治療組和模型組比，總路程、中央格活動的時間、 直立的次數和修飾行為次數有所下降，但高于對照組(P<0.05)，見圖7、表4。

圖4 神經功能評分結果Fig.4 Comparison of neurologic function scoresNote: *.P<0.05 vs control group;**.P<0.05 vs model group.

圖5 水迷宮運動軌跡Fig.5 Moving track in morris water mazeNote: A.Control group;B.Model group;C.Treatment group.

表3水迷宮運動變化數據

Tab.3Movementdataofwatermaze

GroupsTime6d7d8d9dControlgroup20.5543±3.679216.6654±4.90059.3462±1.46215.1363±1.3531Modelgroup177.6284±3.0027123.7643±4.262746.2567±3.48491)30.7922±3.17731)Treatmentgroup106.8819±5.002091.0743±4.421930.5633±3.78492)8.4433±1.75612)

Note：1)P<0.05 vs control group；2)P<0.05 vs model group.

表4大鼠礦場結果

Tab.4Resultsoffieldtrialsinrats

GroupsCategoryTotaldistance(m)Centraltime(s)StandingtimesGroomingbehaviorControlgroup61.52±7.7631.06±5.7119.10±2.7611.70±1.68Modelgroup40.82±5.211)16.65±4.371)10.11±2.651)6.09±1.881)Treatmentgroup50.013±5.182)21.03±4.692)13.03±2.782)7.79±1.752)

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs model group.

圖6 各組水迷宮比較Fig.6 Comparison of delitescence in water maze among groups after injuryNote: *.P<0.05 vs control group;**.P<0.05 vs model group.

圖7 大鼠礦場軌跡示意圖Fig.7 Locus diagram of open field test of ratsNote: A.Control group;B.Model group;C.Treatment group.*.P<0.05 vs control group;**.P<0.05 vs model group.

3 討論

BMSCs是一種來源于骨髓的多功能細胞，具有很強的自我更新和多方向分化的能力，能夠在內環境的作用下遷移到受損傷的組織位置，對組織的結構和功能進行修復[6]；并且擁有較強的免疫調節功能，進行異體移植時能夠避免免疫排斥反應[7]。因此，BMSCs對臨床多種疾病的治療都起到了很大的作用。BMSCs 的旁分泌作用也逐漸受到研究者的關注，其以旁分泌的形式產生多種細胞因子，這些細胞因子在調節免疫、抗炎以及減輕纖維化等方面都起到了極其重要的作用[8,9]。

本實驗結果顯示：HE染色結果，模型組神經元細胞胞體發生明顯改變，胞漿染色降低，細胞核出現深度染色，并且伴有壞死的神經元細胞出現，治療組同模型組比較,病理性病變可以看到有明顯的減輕，這說明在一定程度上BMSCs對大鼠腦創傷后的恢復起到了一定的作用；大鼠的神經運動功能評分結果顯示，對照組評分為滿分，模型組評分在7～9分之間，治療組評分15～18分之間。實驗結果表明大鼠腦損傷發生后，大鼠的神經功能已經有了一定程度的破壞，而通過BMSCs治療組的干預治療，大鼠的神經運動功能得到了改善；Morris水迷宮結果顯示，在腦創傷后，模型組在搜索安全島所用的時間明顯要比對照組所用的時間多，治療組的搜索時間要比模型組有了明顯的好轉，這說明大鼠腦創傷后通過BMSCs的治療，大鼠的空間記憶功能有了一定程度的改善；同樣的，礦場實驗結果也能夠提示我們，大鼠在出現腦損傷后，神經功能有一定程度上的損傷，在給予BMSCs干預后，治療組的各項數據都有了一定的下降，進一步說明在BMSCs的干預下，大鼠在腦創傷后的空間記憶能力得到了恢復。

綜上所述，本研究證實了BMSCs對腦創傷后大鼠神經功能的恢復具有積極的治療效果，為BMSCs面向臨床的應用提供了有力的理論和實驗依據。

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[收稿2017-06-16 修回2017-07-11]

(編輯 倪 鵬)

Effectofbonemarrowmesenchymalstemcellsoncognitivefunctionaftertraumaticbraininjuryinrats

WANGYing-Jie,WANGJing,SHIXin.

ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China

Objective:To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on the cognitive function in hippocampus after traumatic brain injury in rats.MethodsBMSCs were isolated and cultured from male 3-week-old SD rats in vitro.60 female SD rats were randomly divided into 3 groups(n=20),control group,model group,BMSCs treatment group.After the establishment of brain trauma model of the model 1,7,14,28 d,BMSCs treatment group was given BMSCs(1×106ml-1)intervention.In addition,20 rats were tested by water maze,and each group was divided into four points:6,7,8 9 d after injury.The morphological changes of brain tissue was detected by HE staining;the water content of brain tissue was detected by dry wet method;Morris detection method, detection of spatial learning and memory ability in rats;nerve motor function score, neural function analysis detection;field test, detection of spatial learning and memory ability in rats.ResultsThe morphological changes of brain were observed by HE staining;the water content of brain tissue was detected by wet and dry gravity;the water maze test was conducted to examine the spatial learning ability,the motor function score,and the field experiment.The results of wet and dry gravity test showed that compared with the control group,the model group was significantly higher than the control group(P< 0.05),the water content of the treatment group at each time was significantly lower than the model group;the results of water maze test showed that the latency of safe island was significantly increased in the model group on the eighth and ninth day after injury,compared with the control group,and the difference was statistically significant(P<0.05).In the treatment group,the safe island latency was significantly shorter in the eighth day and ninth day after injury than in the control group;the neurological score results showed that compared with control group,model group,rats in the hind limb grasping reflex,vibrissae evoked forelimb positioning and lateral pad step tests were not normal performance,resulting in functional score decreased with statistical significance(P<0.05).The functional scores of the treatment group and the model group were significantly higher than those of the model group.ConclusionThrough the behavioral related tests,the data show that BMSCs can restore the neurological function to a certain extent after traumatic brain injury in rats.

BMSCs；Traumatic brain injury;HE;Morris water maze

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.014

R322

A

1000-484X(2017)11-1668-05

王英杰(1981年-)，男，碩士，講師，主要從事腦損傷方面的研究，E-mail：251684444@qq.com。