TLR4在炎性癌癥中的研究現狀①

羅曉曦 陳國棟 焦 揚 桑雄波 鄭冰蓉

(云南大學醫學院，昆明 650091)

TLR4在炎性癌癥中的研究現狀①

羅曉曦 陳國棟 焦 揚 桑雄波 鄭冰蓉

(云南大學醫學院，昆明 650091)

炎性癌癥是指由炎癥引發的癌癥。大多數癌癥的發生往往與炎癥有著密不可分的聯系[1]，例如：長期的宮頸炎提高了宮頸癌變的可能性；幽門螺旋桿菌所致的胃炎被普遍認為是胃癌的始發原因；嚴重的潰瘍性結腸炎可能會導致結腸癌的發生[2]；慢性肝炎則是造成肝纖維化、肝硬化、最終形成肝癌的罪魁禍首之一[3]。

TLR4是Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)家族中發現最早、研究最深入的成員，它在體內的分布廣泛，既表達于樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)、巨噬細胞等免疫細胞的細胞膜上，也表達于細胞內的核內體小泡上。它可參與包括自身免疫疾病、炎性癌癥、神經變性疾病、心腦血管疾病等在內的多種炎癥性疾病的發生[4-8]。尤其在炎性癌癥中，TLR4往往表達異常，且被認為具有雙重作用：一方面，TLR4的激活會產生促炎因子、趨化因子和干擾素，激活免疫系統，發揮抗腫瘤作用；另一方面，TLR4既是上皮間質轉化的誘發因子，也能誘發抗凋亡蛋白、血管生成因子的產生，促進癌細胞存活，出現免疫抑制。因此，了解TLR4在炎性癌癥發生發展過程中的作用及其機制，是有效利用TLR4進行免疫治療的前提。

1 TLR4概述

1.1TLR4的結構和配體 TLR家族是一種模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRR)，因其胞外段與一種果蠅蛋白Toll同源而得名[9]，目前，在哺乳動物中已發現13種TLR。TLR4是該家族中的重要一員，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，它由胞外的氨基端、跨膜區以及胞內的羧基端三部分組成。其氨基端是24個富含亮氨酸的重復序列，決定了它與配體結合位置的特異性，羧基端則與人IL-1R的胞內區結構相似，稱為TIR(Toll/IL-1 receptor homologous region)[10]，TLR4正是通過TIR與各種胞內接頭蛋白相互作用誘發下游通路。

當外源病原體感染機體時，TLR4可以被病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)激活，如：細菌、真菌、病毒等[11]，其中脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是TLR4的主要配體，通過LPS刺激可顯著增加TLR4的表達。除此之外，TLR4還可以識別一些機體自身釋放的內源性配體，即損傷相關分子模式(Danger/damage-associated molecular patterns，DAMP)，如：熱休克蛋白(Heat shock proteins,HSP)、透明質酸(Hyaluronic acid)、高速遷移族蛋白1(High mobility group box-1 protein,HMGB1)，脂肪酸(Fatty acid，FA)等[5，12,13]。

1.2TLR4信號轉導途徑及其調節 TLR4介導的信號通路可分為MyD88依賴途徑和MyD88非依賴性途徑[13]。MyD88依賴途徑是指通過髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)誘發下游信號通路，反之，MyD88非依賴性途徑是指由非MyD88的其他接頭蛋白誘發下游信號通路，如圖1所示。

1.2.1TLR4介導的MyD88依賴性途徑 MyD88由N端的死亡結構域(Death domain，DD)、C端的TIR和一個短的連接序列三部分組成。LPS進入體內后， 首先被LPS結合蛋白(LPS-binding protein，LBP)捕獲，二者形成LPS-LBP復合物，之后由LBP將LPS傳遞給位于細胞膜上的 LPS高親和力受體(CD14)，LBP隨之釋放。同時，在TLR4識別LPS所必需的輔助分子——髓樣分化蛋白-2(Myeloid differentiation protein-2，MD-2)的協助下，TLR4與LPS結合后自身二聚化，并通過其胞內段TIR與MyD88的TIR相結合，再通過MyD88募集IL-1受體相關激酶1(IL-1R associated kinase，IRAK1)、IRAK4、腫瘤壞死因子相關受體6(Tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)，IRAK4磷酸化IRAK1，隨后磷酸化的IRAK1和TRAF6與受體解離。IRAK1-TRAF6復合物與胞膜的TAK1(Transformation growth factor-β-activated kinase 1)、TAB(TAK1-binding protein)1、2形成復合物，TRAF6自身泛素化后使TAK1活化，進而激活TAK1/TAB1/TAB2復合體，開啟MAPK和NF-κB信號通路、促炎癥因子和共刺激分子的表達。所有TLR都有MyD88依賴途徑。

圖1 TLR4信號轉導途徑Fig.1 TLR4 signal transduction pathway

1.2.2TLR4介導的MyD88非依賴性途徑 MyD88非依賴性途徑是一些TLR所特有的，主要指通過TRIF(TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β)等接頭蛋白，在TRAF3的幫助下，使干擾素調節因子3(IFN regulatory factor 3，IRF-3)磷酸化，進而介導Ⅰ型干擾素的表達，激活caspase。同時，TRIF也能通過TRAF6激活TAK1，開啟NF-κB信號通路。

1.2.3TLR4信號轉導的調節 TLR4作為病原微生物及組織損傷產物的感受器，它的激活可以活化與炎癥密切相關的中性粒細胞，促進細胞間黏附分子以及炎癥趨化因子的表達，誘導中性粒細胞向炎癥部位黏附、聚集，進而放大炎癥反應。同時，TLR4還對B細胞、T細胞和DC細胞的成熟、遷移以及活化有顯著影響。由此可見，TLR4能調動自身免疫防御機制，有效保護機體免受外源微生物感染[14]。

但TLR4信號過強也會導致膿毒癥、自身免疫疾病等的發生。因此，機體存在減弱TLR4信號機制，以維持機體免疫穩態。例如：細胞可通過內吞作用回收位于細胞膜表面的TLR4，減緩內毒素引發炎癥反應[15]。經常暴露在大量微生物環境中的結直腸，可借助食物殘渣中的心磷脂占據LBP、CD14等與LPS的結合位點，有效降低TLR4通路的激活率，保持機體內穩態[16]。此外，機體還可以通過增強負調節蛋白的表達。如：IRAK-M和轉化生長因子β(Transforming growth factor,TGF-β)，IRAK-M可阻礙IRAK1-IRAK4復合物從MyD88解離，TGF-β可下調TLR4的表達，二者都能有效阻斷TLR4/MyD88信號通路?；蚴峭ㄟ^MyD88的DD招募接頭蛋白FADD(Fas-associating death domain-containing protein)，啟動caspase依賴的細胞凋亡，阻斷炎癥因子的釋放[17]。

2 TLR4在多種炎性癌癥中的作用及機制

大量研究證實，TLR4在多種腫瘤中表達，參與多種炎癥反應和免疫反應，與腫瘤的增殖、轉移和侵襲有著重要的關聯。

2.1TLR4與多種炎性癌癥發展的關聯性 越來越多的研究證實，TLR4不僅表達于多種免疫細胞，也表達于許多癌細胞系和腫瘤組織，如：肺癌、宮頸癌、乳腺癌、胰腺癌、結直腸癌、肝癌等[18-20]，且與大部分癌癥的發展情況正相關。Zhang等通過免疫組化、Western blot及RT-PCR三種方法，從蛋白質水平和mRNA水平，檢測TLR4在臨床肺癌組織和正常肺組織中的表達情況，發現TLR4在肺癌組織中高表達，之后對TLR4的表達情況和肺癌樣本的臨床病理特征進行關聯分析，發現TLR4的表達情況與肺癌的分化等級成正相關，而與肺癌患者的年齡、性別、腫瘤的組織學類型、淋巴結轉移及腫瘤轉移等級(TNM)無關，首次提出TLR4與惡性腫瘤的等級呈正相關性這一觀點[21]。用類似的辦法，黃喆等[22]和孫運良等[23]對胰腺癌手術切除標本及其癌旁組織，進行TLR4表達量與胰腺癌病理特征的關聯性分析，均發現TLR4在胰腺癌組織中高表達，且TLR4的表達量與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移及TNM分期密切相關。滿曉華等[24]進一步通過CD31抗體標記微血管內皮細胞，計算微血管密度(MVD)，發現胰腺癌中TLR4的表達量與癌組織中血管密度密呈顯著正相關。Chen等[25]在乳腺癌組織中也發現TLR4/MyD88的表達量顯著高于鄰近的正常組織，且TLR4的高表達與癌細胞發生遠端轉移顯著相關。Wang等[26]通過免疫組化檢測TLR4在正常宮頸上皮組織、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及ICC中的表達情況，發現TLR4的表達隨宮頸病變程度的加深逐漸增加，初步表明TLR4可能與宮頸癌的發生和惡化相關。在結直腸癌的研究中，同樣證明TLR4的表達與結直腸癌的分期發展正相關[27，28]。

但也有研究發現，TLR4在一些腫瘤中的表達情況是不相一致的，特別是在肝癌的研究中。Wang等[29]通過免疫組化實驗對53例肝癌(HCC)病例、其對應的癌旁組織及10例正常肝組織中TLR4的表達量進行分析，發現HCC組織中TLR4表達量最高，癌旁組織次之，正常組織最低。魏卓等[30]用同樣的方法比較了TLR4在正常對照組、慢性乙型病毒性肝炎組、肝硬化組、肝癌組中的表達情況，得出了類似的結果——肝癌組中TLR4的表達量高于正常對照組和慢性乙型病毒性肝炎組與肝硬化組比較無統計學差異。相反的，Xu等[31]在其所調查的84例HCC病例組織和對應的癌旁組織中發現，TLR4在癌細胞中的表達量顯著低于癌旁組織。類似的，在Jing等[32]的研究中發現，肝癌組織中TLR4表達量高的HCC患者無腫瘤存活期和總生存期，均顯著低于TLR4表達量低的HCC患者。這兩種實驗結果的不同，可能是由于TLR4在不同的癌癥病情中的作用機制不同，以及病例樣本個體存在差異造成的，這也為后續實驗提供了新的實驗思路和方向。

2.2TLR4在腫瘤增殖中的作用及機制 研究發現，TLR4可通過上調凋亡相關蛋白——Bcl-2(B cell lymphoma-2)家族的表達，誘導腫瘤細胞增殖，促進腫瘤存活。顏偉等[33]利用TLR4-siRNA，特異性抑制宮頸癌細胞系中TLR4的表達，發現癌細胞中p65和Bcl-2的表達量顯著下降，MTT和流式細胞術檢測發現癌細胞的細胞周期被阻滯于G1期，細胞凋亡率顯著升高，證明TLR4可以通過NF-κB信號通路上調抗凋亡蛋白Bcl-2促進癌細胞增殖。類似的，Liu等[34]利用siRNA特異性阻斷肝癌細胞系中TLR4信號通路后，發現ERK和JNK的表達顯著下調，細胞凋亡水平顯著上升，反向說明TLR4能通過ERK和JNK通路促進癌細胞增殖。Wang等[29]則使用LPS正向刺激兩種不同的肝癌細胞系，發現兩種癌細胞的增殖能力均增強，進一步檢測發現LPS刺激癌細胞后，p-JNK、p-ERK、p-IκBα表達上調，而Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax表達下調，且它在線粒體的數量下降，有效抑制了線粒體凋亡途徑，進一步證明了上一實驗的觀點，也說明TLR4能通過下調Bax的表達及其在線粒體中的分布，促進癌細胞存活。除此之外，TLR4還與腫瘤細胞逃避免疫監視，干細胞樣化有關。Zhang等[35]發現，在宮頸癌中TLR4的表達與輔助性T細胞(Regulatory T cells,Treg)的特異性標志物Foxp3的表達正相關，提示TLR4的激活與Foxp3表達的增加，可協同抑制特異性免疫，幫助腫瘤細胞逃避免疫監視Chen等[36]還發現TLR4過表達的細胞上，許多干細胞標志物的表達量增加，例如，TLR4過表達的細胞，CD133表達量增加85%，而這類細胞大多具有增殖能力強、易出現化療抵抗和凋亡抑制的特點。

然而，Xu等[31]提出了不同的看法——TLR4/NF-κB信號通路可通過PTPRO抑制癌細胞增殖。他們發現在TLR4在84例肝癌病例組織中的表達量顯著低于在癌旁組織中的表達量，且TLR4與一種腫瘤抑制因子PTPRO(Protein tyrosine phosphatase receptor O,PTPRO)表達正相關，當用LPS刺激，通過基因改造讓PTPRO高表達的HuH7細胞系后，癌細胞的增殖率受到了顯著抑制，之后通過熒光素酶報告實驗證明，PTPRO對癌細胞的抑制作用是建立在TLR4/NF-κB信號通路上的。在Wang等[29]的研究中也發現，低表達TLR4的正常肝細胞或弱表達TLR4的肝癌細胞系，受低濃度的LPS刺激后會引起細胞凋亡，但抑制NF-κB信號通路后，癌細胞的生存能力得到了提升。由此可見，TLR4/NF-κB信號通路在癌癥中的作用機制還需要進一步研究。

2.3TLR4在腫瘤侵襲轉移中的作用及機制 上皮-間充質細胞轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞逐漸消失，間充質細胞逐漸增加，是癌細胞侵襲和轉移的分子基礎[37]。多項研究發現，TLR4可通過下游的MAPK/JNK通路和轉錄因子Snail誘導EMT的發生。Li等[38]發現用LPS刺激肝癌細胞系HepG2后，TLR4表達量顯著升高，且癌細胞的轉移侵襲率提高，進一步檢測發現p-JNK的表達增加，同時，間充質細胞的標志物α-SMA(α-smooth muscle actin)的表達顯著增加，而上皮細胞的標志物E-cadherin的表達量顯著下調；相反，siRNA抑制TLR4的表達后，再用LPS刺激癌細胞系，發現p-JNK和α-SMA的表達量均減少，E-cadherin的表達量增加，表明，TLR4通過激活JNK，推進癌細胞EMT的進程，促進癌細胞的轉移和侵襲。類似的，Park等[39]發現LPS激活結直腸癌細胞上的TLR4后可增加α-SMA和半乳凝集素-1的表達，其中半乳凝集素-1可介導ADMA10(a disintegrin and metalloproteinase 10)和ADMA17(a disintegrin and metalloproteinase 17)的活化，進而促進基質金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinases，MMP2)、MMP9及黏附分子的表達，推進EMT，使得腫瘤細胞具有侵襲轉移的能力。Jing等[32]在HCC中發現，LPS還可通過TLR4/NF-κB通路促進轉錄因子Snail的表達，誘導EMT，提高癌細胞的轉移、侵襲能力。除此之外，Li等[40]將乳腺癌細胞系皮下注射到不育的小鼠中，營造體內環境，發現TLR4還可以通過PI3K/Akt/GSK3β通路，促進β-catenin進入細胞核與轉錄因子作用，上調下游基因MMP7、MMP9、血管內皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的表達，降解細胞外基質，促進微血管生成，而異常的血管通透性會引起組織間隙高壓，進一步促進缺氧環境的形成，低氧環境又可以誘導HMGB1的釋放，不斷促進腫瘤侵襲、轉移。

TLR4的內源性配體增加也能促進腫瘤細胞的侵襲轉移。500例上皮卵巢癌病例調查分析發現，HSP60、HSP70、HMGB1等TLR4內源性配體高表達的癌細胞，都具有強侵襲性和低臨床治愈率的特點[41]。Yan等[42]在HCC肺轉移的小鼠模型中，敲除HMGB1的表達后，發現癌細胞的轉移和侵襲能力明顯下降。

2.4TLR4在腫瘤微環境形成中的作用及機制 腫瘤微環境是一個復雜的多因素環境，在腫瘤的出現和惡化過程中扮演著重要角色，主要包括：慢性炎癥、組織缺氧和大量蛋白水解酶的產生。其中大量細胞因子的產生是腫瘤微環境的主要特點。魏卓等[30]在HBV感染引起的肝癌組織中，發現TLR4和IL-6、IL-1β等炎癥因子，趨化因子CCL2和免疫抑制因子TGF-β表達顯著上調。TGF-β作為一種免疫抑制因子，一方面，有研究發現TGF-β通過轉錄后修飾的方式抑制VEGFA表達，抑制癌細胞發生侵襲[43]，另一方面，也有研究證實，TGF-β可通過Samd2/3和Samd4調節Snail/Slug、ZEB1/2和Twist(EMT誘導基因)的表達，還可以通過激活PI3K-Akt-mTOR通路和小GTP酶，誘導EMT的發生，增加癌細胞的侵襲性和能動性[44-46]。TLR4內源性配體的增加也為腫瘤的惡性發展提供了外在條件。Park等[39]在結直腸癌中發現，癌細胞糖酵解產生的乳酸鹽可增加VEGF和透明質酸的產生，進而誘導血管的生成，增加癌細胞的能動性。大量臨床數據統計也發現，TLR4的內源性配體——熱休克蛋白家族在前列腺癌、乳腺癌等多種癌癥中表達上調，與癌癥患者的生存期、預后負相關，且能在血清中檢出，可以作為一種癌癥診斷的潛在標志物[47]。此外，NO的氣體環境對炎性癌癥的發生發展也有著重要作用。王玎等[48]發現，TLR4在HPV陽性宮頸癌組織中的表達量，顯著高于其在HPV陰性和正常宮頸癌組織中的表達量，且高表達的TLR4可通過NF-κB增加誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表達，產生NO信號氣體，推進HPV致癌的病理過程。但魏雪敏等[49]通過向宮頸癌細胞系HeLa和宮頸鱗癌細胞系Caski的培養環境中加入硝普鈉營造NO氣體環境，發現高濃度的NO可顯著抑制癌細胞的增殖。表明NO的濃度可能是NO對癌細胞發揮作用的關鍵因素。豐富的蛋白酶微環境也是腫瘤微環境的一大特點[40,41]，柯星等[50]將分化誘導后的M2巨噬細胞與卵巢癌細胞SKOV3非接觸式共培養，發現TLRs信號通路蛋白MyD88、TRAF6、p-NF-κB和MMP-9表達均上調，癌細胞的侵襲轉移能力增強?？偠灾?，腫瘤的發生促進了微環境的形成，腫瘤的發展也離不開微環境的幫助，二者相輔相成，一旦微環境發生變化，腫瘤的生長情況也會發生改變。

3 TLR4作為一種炎性癌癥潛在治療靶點的應用及前景

多個實驗證明，TLR4在多種炎性癌癥的發生、發展過程中具有重要作用，且大數據統計發現，TLR4的單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNP)位點與特定地區人群患腫瘤的風險顯著相關[51]，由此可見，可將TLR4作為癌癥治療的潛在靶點，通過激活或者抑制TLR4信號通路，達到控制腫瘤生長，治愈腫瘤的目的。30年前，臨床上就用TLR2 和TLR4依賴性信號通路的蛋白激活劑——芽孢肝菌卡介苗，進行膀胱灌注治療膀胱癌，取得了較好的療效；OK-432，一種來源于鏈球菌的生物制劑，也已在宮頸癌、胃癌和口腔鱗狀細胞癌的治療中運用[52]。

隨著表觀遺傳學的發展，Zhu等[53]發現通過對TLR4啟動子DNA和組蛋白的修飾也可調節TLR4的表達，達到對腫瘤細胞的控制。Jiang等最近發表的研究發現，來源于大腸桿菌的MBP與BCG兩種分子，可作為TLR4/MyD88的激動劑，有效誘導DC細胞上共刺激分子的表達及IL-12的分泌，促進DC細胞的成熟和活化，可運用于細胞療法中DC細胞疫苗的制備[54]。另一種TLR4的配體——紫杉醇，被廣泛運用到癌癥的治療中，但它對不同的腫瘤療效不一，甚至對患同類腫瘤的不同患者的療效也不同。Volk-Draper等[55]發現在TLR4陽性的腫瘤中，紫杉醇的使用會出現癌細胞轉移等抗藥現象，而在TLR4陰性的腫瘤中紫杉醇具有較好的療效。Haricharan等進一步發現，針對TLR4的靶向治療取決于TP53基因：在TP53突變的癌細胞中，活化的TLR4可通過調節趨化因子CXCL1促進癌細胞增殖；在TP53野生型細胞中，活化的TLR4可通過IFN-γ產生p21抑制癌細胞增殖[56]。此外，多項研究發現，腸道益生菌可防治結直腸癌等消化系統腫瘤[57]。Roomi等[58]對注射了Hela細胞的母鼠分別喂食混合營養食物和常規食物后，發現喂食混合營養食物的小鼠體內的腫瘤生長速度受到了顯著抑制。間接反映了腸道益生菌的抗腫瘤功效。2015年11月刊登在《Science》上的研究結果也印證了這一觀點，他們在不同環境下飼養同一種屬的小鼠，讓它們擁有不同的腸道菌群，當向這些小鼠注入黑色素瘤細胞后，發現其中一組小鼠的腫瘤生長速度明顯慢于另一組，而將這一組小鼠的糞便移植給另一組小鼠后，使后者擁有前者的腸道菌群，后者的腫瘤生長速度明顯減緩。通過分析兩組小鼠糞便中的組分，發現增強抗腫瘤反應的有效成分是長雙歧桿菌和短雙歧桿菌。此外，當小鼠的腸道菌群中含有雙歧桿菌屬的益生菌時，檢查點抑制劑可以將小鼠體內的腫瘤完全清除，反之，藥物在小鼠體內的效果大不如前者。由此可見，這些益生菌的存在，可以顯著增強免疫反應，甚至還能決定“檢查點抑制劑”類腫瘤免疫藥物的作用效果[59]。李世超等[60]發現，酪酸梭菌培養的上清液也能通過TLR4/MyD88信號通路，抑制結腸癌細胞的增殖。龔家順等構建的回腸炎模型小鼠中，雙歧桿菌能夠有效下調TLR4的表達，進而緩解炎癥，對組織起到一定的保護作用[61]。猜想雙歧桿菌對結腸癌的抑制作用可能與TLR4有關。

4 結語

近幾年對TLR4/NF-κB信號通路的研究日益深入，發現TLR4與多種炎性癌癥均有較強的聯系。目前，已通過多種方法研發TLR4信號通路的中西藥阻滯劑或其配體，用于治療相關疾病，但臨床上運用較少。為了更好地治療疾病，TLR4作用機制中內源性配體的產生及作用，TLR4在炎癥性腫瘤中的雙向作用機制，不同細胞TLR之間、同類細胞不同TLR之間的相互交流機制以及如何控制TLR配體或阻滯劑的量，阻滯劑是否存在過度抑制免疫機能等副作用等問題需要更深入的研究。因此，更透徹地了解TLR4信號通路，可以為研發特異性藥物，治療癌癥提供新的策略和方法。

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[收稿2017-03-20 修回2017-06-06]

(編輯 張曉舟)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.030

①本文受國家自然科學基金(81560043)資助。

R735.7

A

1000-484X(2017)11-1735-06

羅曉曦(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事醫學遺傳學研究，E-mail:924782225@qq.com。

及指導教師：鄭冰蓉(1969年-)，女，教授，博士生導師，主要從事人類遺傳學研究，E-mail: zhengbr@ynu.edu.cn。