米根霉α-淀粉酶保守區域組氨酸突變及功能性質

楊倩，湯斌,2，李松,2*，陳阿娜,2，湯文晶,2

1(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖，241000) 2(微生物發酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖，241000)

米根霉α-淀粉酶保守區域組氨酸突變及功能性質

楊倩1，湯斌1,2，李松1,2*，陳阿娜1,2，湯文晶1,2

1(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖，241000) 2(微生物發酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖，241000)

有關真菌α-淀粉酶的研究主要集中在酶的底物催化形式等生化性質方面，該類酶中的大量氨基酸殘基組成與酶功能性質之間的關系尚不明確。利用分子對接和同源比對等生物信息學分析方法發現米根霉α-淀粉酶中有3個特殊的組氨酸殘基(H120，H200和H286)，并利用定點突變的方法構建了系列突變體。性質研究表明，286位氨基酸殘基結構與該酶的最適反應溫度、最適反應pH、酸耐受性以及麥芽糖生成能力均有關聯；突變體H286L的酸耐受性和水解淀粉的麥芽糖生成能力得到顯著提高；120位和200位氨基酸殘基的變化不改變該酶的最適反應溫度和最適反應pH，而兩者的組合突變可顯著提升該酶的酸耐受性。此外，數據表明該酶的高麥芽糖生成能力與酶對麥芽三糖的親和力不直接相關。研究結果可為真菌α-淀粉酶高麥芽糖生成能力的原因及其定向進化提供一定理論參考。

真菌α-淀粉酶；分子對接；定點突變；結構與功能；麥芽糖

真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)指一類由真核微生物合成的在蛋白質結構和底物催化特征等方面比較相似的一類α-淀粉酶，廣泛來源于曲霉屬[1-3]、根霉屬[4-5]和酵母屬[6-7]等常見微生物菌種。與細菌α-淀粉不同，真菌α-淀粉酶可以水解淀粉和麥芽三糖，終產物中主要物質為麥芽糖及部分低聚寡糖和少量葡萄糖，在甜味劑、烘焙和啤酒釀造等領域具有廣泛的應用[8]。隨著糖化工藝的改進，真菌α-淀粉酶已逐漸替代β-淀粉酶作為糖化劑用于部分高麥芽糖漿(DE值：40～50)的生產，成為高麥芽糖漿生產過程中的關鍵酶制劑之一[9]。高麥芽糖漿品質的高低依據糖漿中麥芽糖的含量而定，所以在高麥芽糖漿的工業生產過程中真菌α-淀粉酶催化水解淀粉所生成的終產物中麥芽糖濃度的高低成為評價其應用性能的一個重要特征指標。因此，獲得具有高麥芽糖生成能力的真菌α-淀粉酶并弄清其高麥芽糖生成機制是該類α-淀粉酶研究的熱點問題之一。

近年逐漸發現部分細菌來源的α-淀粉酶也具有高麥芽糖生成能力，如Bacillusstearothermophilus[10]和B.lehensis[11]來源的麥芽糖淀粉酶，Pyrococcussp.[12]和Thermococcussp.[13]來源的熱穩定α-淀粉酶以及B.acidicola[14]和Lactobacillusplantarum[15]來源的耐酸α-淀粉酶等。雖然有關α-淀粉酶結構與功能關系的研究在酶催化效率、熱/酸/堿穩定性及底物特異性等方面有很多報道[8-9]，而有關α-淀粉酶高麥芽糖生成能力的研究則主要集中在酶的底物催化形式等生化性質方面，僅有MANAS等[11]在近期通過分子對接及分子動力學模擬等方法在蛋白質結構層面上對B.lehensis麥芽糖淀粉酶的高麥芽糖生成能力進行了研究。

已知真菌α-淀粉酶核心催化區域具有α-淀粉酶13家族所共有的一個(α/β)8TIM桶狀結構、3個關鍵催化位點Asp206，Glu230和Asp297(米曲霉)和4個保守區域[16]。在真菌α-淀粉酶中除了上述3個關鍵催化位點的功能得到研究之外，其他亞位點氨基酸尤其是保守區域內的氨基酸與蛋白質結構及其功能關系則鮮有報道，且絕大部分氨基酸殘基的功能是未知的，為該類酶的結構與功能的定向進化帶來了較大困難。本研究在前期工作中發現在米根霉α-淀粉酶結構的催化區域內有3個保守的組氨酸殘基(H120，H200和H286)，同時這些殘基在其他部分真菌α-淀粉酶的氨基酸序列中也高度保守，可能與真菌α-淀粉酶家族的催化性質有密切關系。因此，本研究對該3個組氨酸殘基進行了定點突變并對突變體的性質進行了分析，以期為真菌α-淀粉酶結構與功能關系研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌種和質粒

含有米根霉α-淀粉酶(ROAmy)及其C末端His-tag標簽編碼基因的重組質粒pUC57-ROAmy為本實驗室在前期研究工作中構建。其中，ROAmy(GenBank：HM234170)克隆自菌株米根霉(Rhizopusoryzae)F0071(中國高校工業微生物資源與信息中心，CICIM—CU)。菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109和克魯維乳酸酵母(Kluyveromyceslactis)GG799以及質粒pUC57和pKLAC1為本實驗室保藏。

1.1.2 工具酶、試劑盒及引物

實驗中DNA操作所涉及的各種工具酶、DNA聚合酶、T4 DNA連接酶以及質粒抽提、PCR產物純化和膠回收等試劑盒分別購于寶生物工程(大連)有限公司或生工生物工程(上海)有限公司。PCR引物由生工生物(上海)有限公司合成，具體信息如表1所示。

表1 本研究所用引物

注：下劃線表示酶切位點，斜體表示組氨酸標簽編碼序列。

1.1.3 培養基

YEPD培養基(g/L)：酵母粉10，胰蛋白胨20，葡萄糖20，自然pH；YEPG培養基(g/L)：酵母粉10，胰蛋白胨20，半乳糖20，自然pH；YCBA培養基(g/L)：酵母碳基10，乙酰胺0.3，瓊脂粉15，自然pH；活性篩選培養基(g/L)：酵母粉10，胰蛋白胨20，葡萄糖10，可溶性淀粉5，自然pH。

1.1.4 試劑

酵母碳基(YCB)，英國OXOID公司；麥芽寡糖標準品：日本林原生化研究所公司(Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc)；其他試劑均為國產或進口的生化或分析純試劑。

1.2方法

1.2.1 生物信息學分析

利用Blast/blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)在線分析和DNAMAN軟件(version 8)分別對ROAmy進行同源序列比對和氨基酸保守性分析。通過在線分析軟件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對ROAmy(成熟肽序列)進行比對分析并以相似度較高的2taa.1.A(SMTL id, identity 43.16)為模板對ROAmy進行結構建模。所得3D模型進一步利用軟件Molegro Virtual Docker(MVD)與麥芽三糖配體(3D Conformer, PubChem CID: 192826，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)進行分子對接模擬和分析。

1.2.2 突變體設計及重組菌構建

依據ROAmy保守氨基酸分析結果，分別設計引物(表1)并利用Overlapping PCR方法[17]對ROAmy進行定點突變，PCR反應中使用引物ROAmy-F和ROAmy-R擴增基因全長序列，分別使用對應的引物引入單位點突變。PCR產物經膠回收、純化處理后使用SalI和NotI進行雙酶切并與采用同樣酶切方式的質粒pKLAC1相連接并轉化大腸桿菌，重組質粒經酶切和序列測定驗證正確后使用SacII線性化并利用電穿孔轉化法導入K.lactis，重組酵母經YCBA培養基篩選和分離純化后分別點種活性篩選培養基，于30 ℃靜置培養48 h后使用盧戈氏碘液染色，出現透明圈的菌落即為陽性重組酵母。

1.2.3 重組蛋白制備

分別接種陽性重組酵母單菌落于20 mL/250 mL YEPD培養基中，于200 r/min、30 ℃條件下培養18 h，取1 mL培養液接種于100 mL/500 mL YEPG培養基并繼續培養60 h。發酵結束后離心(5 000 r/min，10 min)收集上清液并通過硫酸銨(65%)沉淀、透析、鎳柱親和層析(HisTrapTMHP 1 mL column, GE Healthcare)和脫鹽(HiTrapTM5 mL column, GE Healthcare)等步驟對重組蛋白進行純化。蛋白質純度利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測，純化蛋白經冷凍干燥后置于4 ℃冰箱中備用，使用前根據需要使用相應的緩沖液溶解。

1.2.4 淀粉酶活力測定

以可溶性淀粉為底物測定α-淀粉酶活力，利用DNS[13]法對還原糖進行定量，以麥芽糖為標準物制作還原糖標準曲線。具體測定方法為：取1 mL可溶性淀粉(10 g/L)溶液與0.25 mL檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(0.2 mol/L, pH 5.0)混合，50 ℃溫浴5 min后加入0.1 mL酶液，繼續保溫10 min后立即加入0.1 mL HCl溶液(0.1 mol/L)終止反應。1個α-淀粉酶活力單位(U)定義為：在上述反應條件下，每分鐘生成1 mg麥芽糖所需要的酶量。

1.2.5 重組酶酶學性質分析

最適反應溫度測定：在標準酶活力測定過程中將反應溫度分別設定為45、50、55、60、65 ℃并測定酶活力，以最高酶活力為100%計算相對酶活力并定義最高酶活力所對應的溫度為最適反應溫度。

最適反應pH測定：在標準酶活力測定過程中將反應pH分別設定為4.0、4.5、5.0、5.5和6.0并測定酶活力，以最高酶活力為100%計算相對酶活力并定義最高酶活力所對應的pH為最適反應pH。

酸耐受性測定：分別使用pH4.0、4.5、5.0、5.5和6.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(0.1 mol/L)將酶液稀釋至5 U/mL并置于55 ℃水浴中保溫0～60 min后測定殘余酶活力。以相對殘留酶活力(Ar/Ai)的對數與保溫時間(t)作圖[18]，對曲線進行回歸擬合后按公式(1)計算酶失活速率常數k，按公式(2)計算酶失活半衰期t1/2。

(1)

(2)

其中：公式(1)中Ar為剩余酶活力，Ai為初始酶活力。

米氏常數測定：分別以4、10、15、20和40 mmol/L麥芽三糖為底物在標準酶活力測定條件下反應，以生成的麥芽糖為目標產物采用Lineweaver-Burk雙倒數法計算酶對麥芽三糖的米氏常數；采用相同方法，分別以0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 g/L可溶性淀粉為底物，以還原糖(以麥芽糖計)為目標產物計算酶對可溶性淀粉的米氏常數。

1.2.6 酶催化產物分析

使用檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(0.2 mol/L, pH 5.0)分別配置10 g/L的可溶性淀粉溶液與40 mmol/L的麥芽三糖溶液，在1.6 mL的底物溶液中加入0.4 mL酶液(10 U/mL)，于40 ℃反應8 h后使用等體積三氯乙酸(10%)終止反應。反應終止液于4 ℃靜置沉淀3 h后于7 000 r/min離心30 min，取上清液并用0.2 μm微孔濾膜過濾，濾液中糖組分及含量采用高壓液相色譜(HPLC)法分析。HPLC檢測條件：檢測設備為Waters 1525(BreezeTMHPLC系統)，色譜柱為Luna-NH2，流動相為10%甲醇(v/v)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為285 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。

1.2.7 數據分析

實驗中所有數據的測定均做3組平行，數據以平均值或平均值±標準差(如有需要)形式呈現。標準差計算以及顯著性分析(t-test)均利用軟件OriginPro 2015(OriginLab Corporation)完成。

2 結果與分析

2.1ROAmy結構建模及突變體設計

真菌α-淀粉酶的一種重要催化特征是除了可以水解淀粉外，還可以水解麥芽三糖。同時，酶對麥芽三糖的水解方式也是α-淀粉酶具有不同麥芽糖生成能力的重要原因之一[19-21]。因此，本研究以麥芽三糖為底物對ROAmy進行分子對接建模。對接結果表明麥芽三糖分子進入了ROAmy的催化反應中心區域[(α/β)8TIM-桶狀結構](圖1a)，發現有3個組氨酸(H120，H200和H286)出現在底物附近(圖1b)，其中H120可與底物形成相互的氫鍵作用(圖1c)。底物配體可與ROAmy中的多個保守氨基酸尤其是核心催化位點(Asp196和Glu220)之間形成氫鍵作用(圖1c)，表明分子對接模型具有較高的可信度。

上述3個組氨酸分別位于所知的真菌α-淀粉酶保守區域[16]Region I，Region II和Region V中，同時在真菌α-淀粉酶家族中高度保守(圖2)，因此初步選擇并將該3個保守組氨酸全部替換為亮氨酸，以研究相應位點氨基酸殘基組成在淀粉酶催化功能中可能存在的作用。研究中首先構建得到單突變重組體H120L，H200L和H286L，然后利用相同方法在單突變基礎上進一步進行組合突變并獲得重組體H120L/H200L，H200L/H286L，H120L/H286L和H120L/H200L/H286L。

圖1 ROAmy與麥芽三糖分子對接建模Fig.1 Molecular docking results of ROAmy with maltotriose(a) Second structure of the (α/β)8 TIM-barrel in ROAmy, as shown in the constraint (sphere) area. The substrate molecule is rendered as spacefill mode and the net structure represents modeling cavity; (b) Conserved histidine residues nearby the constraint (sphere) area, the cavity (net structure) and the substrate molecule (wireframe); (c) Ligand map with hydrogen bonds (dash lines) between ligand and ROAmy residues.

圖2 真菌α-淀粉酶保守區域多重比對Fig.2 Comparative analysis of various fungal α-amylases and three of the four conserved regions are labeled for ROAmyGenBank accession number of XP_001544535.1, α-amylase from Histoplasma capsulatum; BAD06002.1, α-amylase from A. awamori; XP_001271889.1, putative α-amylase from A. clavatus; EDP53736.1, putative α-amylase from A. fumigatus; XP_659622.1;α-amylase from A. nidulans; CAK44871.1, α-amylase amyA/amyB from A. niger; BAA00336.1, α-amylase from A. oryzae; ABS76467.1, α-amylase from Saitozyma flava; BAG69580.1, α-amylase from Trichoderma viride; XP_001394335.1, acid α-amylase from A. niger.

2.2重組酶酶學性質分析

與原酶(Wild-type)相比，突變體H120L和H200L的最適反應溫度沒有發生明顯變化(表2)，突變體H286L以及含有286位組氨酸突變的突變體最適反應溫度均提高了5 ℃，如H120L/H286L、H200L/H286L和H120L/H200L/H286L；同時可以發現最適反應pH也表現出了相似的規律，即突變體H286L以及含有286位組氨酸突變的突變體最適反應pH均向酸性范圍偏移了0.5，而突變體H120L和H200L的最適反應pH與原酶相同。由此可知，與H120和H200相比，H286在ROAmy維持一定的催化反應溫度和反應pH的過程中可能具有重要作用，但對酶的熱穩定性沒有影響(數據未顯示)。

表2 ROAmy及其突變體最適溫度和最適pH

酸耐受性研究顯示，單突變體H120L和H200L在不同pH條件下的穩定性與原酶相似，即在其最適反應pH條件下穩定性最好；其他突變體則在pH 5.0或pH 4.5條件下具有更好的穩定性(表3)。例如，在pH 5.0條件下，H286L的半衰期(47.8 min)約為原酶的2.4倍，表明286氨基酸殘基結構對維持ROAmy的pH穩定性具有重要影響。此外，在pH 4.5條件下，H200L/H286L的半衰期(66.65 min)約為原酶的6.4倍，而組合突變體H120L/H200L在pH 5.0條件下亦具有較好的穩定性，表明120和200位氨基酸殘基結構對維持ROAmy的pH穩定性同樣具有一定的作用。在總體趨勢上，突變體H286L、H120L/H200L、H120L/H286L以及H200L/H286L的耐酸性得到了不同程度的提高，但同時在較高pH(5.5和6.0)條件下的穩定性則出現了不同程度的下降。與上述組合突變不同的是，突變體H120L/H200L/H286L的酸耐受性趨勢與原酶相似，并沒有出現簡單的單位點突變效應累積的現象。

表3 不同pH條件下ROAmy及其突變體失活常數和半衰期

相比較而言，無論以麥芽三糖為底物還是以可溶性淀粉為底物，組氨酸的突變對該酶的底物結合常數(Km)影響較大，而對催化速率(Vmax)的影響相對較小，且突變體作用于麥芽三糖的Km和Vmax與作用于可溶性淀粉的Km和Vmax之間沒有直接關系(表4)。例如，作用于麥芽三糖時，突變體H120L/H286L和H120L/H200L/H286L的Km與原酶差異顯著，而所有突變體的Vmax與原酶則沒有顯著差異；作用于可溶性淀粉時，除了H200L之外的其他所有突變體的Km均與原酶具有顯著差異，而僅有H200L、H200L/H286L和H120L/H200L/H286L的Vmax表現出了顯著的差異性，同時也表明200位氨基酸殘基的結構類型對ROAmy水解淀粉的Vmax可能具有重要影響。

表4 ROAmy及其突變體水解麥芽三糖及可溶性淀粉米氏常數

注:表示在數據統計p值lt;0.05水平上顯著；**: 表示在數據統計p值lt;0.01水平上顯著。

2.3終產物分析

以麥芽三糖為底物時，突變體H286L及含有H286突變的突變體的終產物中麥芽糖含量略高于原酶的相應產物含量，但沒有達到顯著差異水平(表5)；當以可溶性淀粉為底物時，上述突變體的麥芽糖生成量顯著高于原酶的麥芽糖生成水平(表6)。突變體H120L、H200L和H120L/H200L作用于麥芽三糖和可溶性淀粉的麥芽糖產生量與原酶均沒有明顯差異(表5和表6)，表明286位氨基酸殘基結構與ROAmy的麥芽糖生成能力之間可能具有一定的關系。

表5 ROAmy及其突變體水解麥芽三糖的終產物分析

注a:G1-G5分別表示葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖；b: ND表示沒有檢測到。

表6 ROAmy及其突變體水解可溶性淀粉終產物分析

注a: G1-G5分別表示葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖；b: ND表示沒有檢測到；*: 表示在數據統計p-值lt;0.05水平上顯著。

3 討論

目前工業使用的真菌α-淀粉酶主要來源于曲霉屬和根霉屬微生物，其最適作用溫度和pH分別在50 ℃和pH5.5左右。在麥芽糖的實際生產中，為了在長時間的糖化中限制乳酸菌等微生物的生長及減少其對糖的消耗，較為有效的方法是將反應控制在pH5.0以下或將溫度升高到60 ℃以上[22]。然而，大多數市售的真菌α-淀粉酶在上述作用條件下均不穩定或催化活力低，在反應過程中必須添加更多的酶以達到生產要求，該方法顯著增加了酶的使用成本。因此，提高真菌α-淀粉酶在高溫或低pH條件下的穩定性或催化活力，對節約酶的用量和優化高麥芽糖漿生產工藝非常重要。本研究中發現突變體H286L及含有286位組氨酸突變的突變體在更高溫度或更低pH條件下具有較高催化活力，且部分突變體的酸耐受性得到了顯著提升，為真菌α-淀粉酶結構與功能的定向進化提供了一定參考。

真菌α-淀粉酶的一個重要催化特征在于具有高麥芽糖生成能力。有關α-淀粉酶高麥芽糖生成機制的研究主要集中在酶的底物催化形式等生化性質研究階段，其中一種研究觀點認為α-淀粉酶對麥芽三糖的不同親和力可能對麥芽糖的形成和終產物中麥芽糖的含量具有重要影響，如COLLINS等[19]和MCMAHON等[20]認為α-淀粉酶對麥芽三糖的低親和力可能是Thermomonosporacurvataα-淀粉酶和Streptomycessp. α-淀粉酶具有高麥芽糖生成能力的原因之一，而DOYLE等[21]在分析了Penicilliumexpansumα-淀粉酶和A.oryzaeα-淀粉酶的麥芽糖生成能力之后則認為α-淀粉酶的高麥芽糖生成能力是由其對麥芽三糖的高親和力所致，上述兩種研究結論相悖，因此并不能確定真菌α-淀粉酶對麥芽三糖親和力的高低是否與高麥芽糖生成能力有關；另一種研究觀點認為真菌α-淀粉酶具有高麥芽糖生成能力是由于該淀粉酶可以催化低濃度麥芽三糖發生轉糖基化反應，如DOYLE等[21]研究結果表明P.expansumα-淀粉酶可以在低濃度麥芽三糖(2 mmol或20 mmol)存在的條件下發生轉糖基化作用，而A.oryzaeα-淀粉酶(終產物中麥芽糖含量極限值約為60% (w/w))只有在高濃度麥芽三糖(200 mmol)存在條件下才發生轉糖基化作用，從而認為在低濃度麥芽三糖存在條件下能夠發生轉糖基化作用或在催化麥芽三糖生成麥芽糖過程中轉糖基化作用為主導作用形式是P.expansumα-淀粉酶具有高麥芽糖生成能力的主要原因。

通過比較表5和表6數據中麥芽糖的生成規律可以看出，突變體以可溶性淀粉為底物時生成的麥芽糖量與以麥芽三糖為底物時生成的麥芽糖量成正比，表明該酶的麥芽糖生成能力與該酶對麥芽三糖的作用方式相關。但是，通過比較ROAmy及其突變體性質發現各突變體的麥芽糖生產能力(表6)與其對麥芽三糖的親和力(表4)之間并沒有必然聯系，如突變體H286L與麥芽三糖的親和力約是突變體H120L/H200L/H286L與麥芽三糖親和力的2.8倍，但是兩個突變體的麥芽糖生成能力則無顯著差異，這在一定程度上解釋了研究中為什么會出現上述有關麥芽三糖親和力論述的兩種相悖的假設，因為真菌α-淀粉酶對麥芽三糖親和力的高低與其高麥芽糖生成能力之間可能并不直接相關。

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MutationandfunctionalpropertiesofthehistidineresiduesexistedintheconservedregionsofRhizopusoryzaeα-amylase

YANG Qian1，TANG Bin1,2，LI Song1,2*，CHEN A-na1,2，TANG Wen-jing1,2

1(School of Biological and Chemical Engineering, Anhui Polytechnic University, Wuhu 241000, China) 2(Anhui Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation, Wuhu 241000, China)

The research on fungal α-amylase mainly focused on the biochemical properties such as the substrate catalytic mechanism, and the relationship between the composition of amino acids residues and the functional properties of this enzyme is unclear. In this paper, three special conserved histidine residues (H120, H200 and H286) that existed in the catalytic domain ofRhizopusoryzaeα-amylase were identified by bioinformatics analysis methods of molecular docking and comparative analysis. A series of mutants were constructed on the basis of above three identified sites using site-directed mutagenesis. The results showed that the structure of the amino acid residue at position 286 had been proved to be related with the optimum temperature, optimum pH, acid resistance and maltose-forming ability of the enzyme. The acid resistance and maltose-forming ability on soluble starch of the mutant H286L were significantly improved. Changes of amino acid residues at position 120 and position 200 exhibited no effects on the optimal temperature, optimum pH and maltose-forming ability, but the combined mutations at both sites of 120 and 200 could improve its acid resistance. The results indicated that the high maltose-forming ability of the enzyme was not directly related to its affinity on maltotriose, which might provide a theoretical reference for study on the mechanism of high maltose-forming ability of fungal α-amylase and its directed evolution.

fungal α-amylase; molecular docking; site-directed mutagenesis; structure and function; maltose

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015008

碩士研究生(李松副教授為通訊作者，E-mail：lisong￣8211232@126.com)。

國家自然科學基金青年項目(31401630)；安徽省自然科學基金(1708085QC63)

2017-06-22，改回日期：2017-07-09