小麥低聚肽和谷氨酰胺對大鼠胃腸黏膜損傷的保護作用

劉文穎，楊賢，曹珂璐，谷瑞增，潘興昌，孫桂菊*

1(中國食品發酵工業研究院，北京，100015) 2(東南大學公共衛生學院，江蘇 南京，210009)

小麥低聚肽和谷氨酰胺對大鼠胃腸黏膜損傷的保護作用

劉文穎1，楊賢2，曹珂璐1，谷瑞增1，潘興昌1，孫桂菊2*

1(中國食品發酵工業研究院，北京，100015) 2(東南大學公共衛生學院，江蘇 南京，210009)

觀察灌胃小麥低聚肽和谷氨酰胺對非甾體類藥物(NSAIDs)致大鼠胃腸黏膜損傷的保護作用。挑選70只SD大鼠隨機分為空白對照組、損傷組及低、中、高劑量小麥低聚肽組[灌胃劑量分別為20、100、500 mg/(kg·d)]和小麥蛋白組、谷氨酰胺組[灌胃劑量均為20 mg/(kg·d)]。每天灌胃1次，連續灌胃30 d。大鼠處死前，用非甾體類藥物灌胃損傷大鼠胃腸2次。取大鼠血清、胃和小腸黏膜組織，觀察血清細胞因子、胃腸病理切片、小腸黏膜抗氧化酶和阿片受體mRNA表達的變化。結果顯示非甾體類藥物可以顯著增加小腸黏膜的氧化應激水平，小麥低聚肽能上調小腸黏膜中GSH-Px的活力，具有一定的抗氧化功能，能夠減輕胃腸黏膜損傷。小麥低聚肽還可以顯著降低了血清中TNF-α含量，下調mu-阿片受體mRNA的表達。說明非甾體類藥物可以誘導大鼠胃腸黏膜損傷的模型，小麥低聚肽可以有效減少大鼠胃腸黏膜損傷。低劑量小麥低聚肽組作用最強，效果優于谷氨酰胺組。

小麥低聚肽；谷氨酰胺；非甾體類藥物；胃腸黏膜損傷

非甾體類藥物(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)如阿司匹林、吲哚美辛等，是有效的鎮痛藥物,多用于關節炎、滑囊炎、肌腱炎、扭傷、勞損以及其他的損傷等[1]。然而，NSAIDs會導致胃腸道損傷，引起胃腸道不適、胃腸道潰瘍等[2]。小麥低聚肽是以小麥谷朊粉為原料，經生物酶法生產的分子質量在1 000u以下的小分子肽混合物，具有較高的谷氨酰胺含量(谷氨酰胺含量占22%左右)，并且水溶性好，易于消化吸收，可作為一種優良的谷氨酰胺補充劑。作為一種天然安全的蛋白肽類物質，小麥低聚肽具有多種生理活性，如抗氧化、降血壓、降膽固醇、增強免疫力等[6]。小麥低聚肽中富含谷氨酰胺，谷氨酰胺對胃腸黏膜的生長與健康有著重要的積極作用。目前國內外對小麥低聚肽保護胃腸黏膜損傷方面的研究較少，有待進行深入和系統的研究。

本研究以谷氨酰胺為對照，通過NSAIDs誘導胃腸損傷的大鼠動物模型，來觀察小麥低聚肽對胃腸損傷的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 試驗動物

清潔級SD大鼠70只，雄性，體重180～200 g，購于浙江省實驗動物中心(許可證號：SCXK(浙)2008-0033)；標準鼠糧，購于南京市江寧區青龍山實驗動物繁殖場；大鼠飼養于東南大學環境醫學工程教育部重點實驗室動物房。

1.1.2 主要試劑

小麥低聚肽，由中國食品發酵工業研究院提供，平均分子質量小于1 000 u的低分子肽混合物，比例達到92%，基本上是由2～6個氨基酸構成；谷氨酰胺，Waters公司；考馬斯亮藍蛋白濃度測試盒、SOD、CAT、GPx、MDA測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α放免試劑盒，北方生物技術研究所；反轉試劑盒，南京百斯凱科技有限公司；引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成；PCR試劑盒，生工生物工程(上海)有限公司。其他均為國產分析純。

1.1.3 試驗儀器

722N可見光分光光度計，上海精密儀器有限公司；FMJ-182放射免疫γ-計數器，上海原子核研究所日環儀器一廠；PCR儀，德國eppendorf公司。

1.2實驗方法

1.2.1 動物分組和樣品采集

70只SD大鼠隨機分為7組，分別是空白對照組(用Con表示)、損傷組(用P Con表示)、低劑量小麥低聚肽組(灌胃劑量為20 mg/kg，用LWP來表示)、中劑量小麥低聚肽組(灌胃劑量為100 mg/kg，用MWP來表示)、高劑量小麥低聚肽組(灌胃劑量為500 mg/kg，用HWP來表示)、小麥蛋白組(灌胃劑量為20 mg/kg，用WPro來表示)和谷氨酰胺組(灌胃劑量為20 mg/kg，用Gln來表示)。低、中、高劑量小麥低聚肽組每天用不同濃度的小麥低聚肽溶液1 mL灌胃，小麥蛋白組和谷氨酰胺組每天用小麥蛋白溶液和谷氨酰胺溶液1 mL灌胃，空白對照組和損傷組大鼠每天按等體積蒸餾水灌胃，灌胃共30 d。

30 d末次灌胃后30 min，損傷組，低、中、高劑量小麥低聚肽組、小麥蛋白組和谷氨酰胺組大鼠以非甾體類藥物損傷劑(阿司匹林0.6 g/kg及吲哚美辛50 mg/kg混合)灌胃，45 min后重復給損傷劑1次。在末次給損傷劑后2 h，股動脈采血后頸部脫臼處死所有大鼠，取血清，-20 ℃保存備用；剪取小塊胃體、十二指腸，浸泡于10%中性甲醛固定液固定，備用；取胃、小腸黏膜組織，-70 ℃保存備用。

1.2.2 胃、十二指腸病理組織學觀察

取大鼠的胃、十二指腸組織(每只動物的取材部位相同)，用甲醛固定，石蠟包埋，切片，H.E.染色，進行病理組織學觀察。

1.2.3 小腸黏膜超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、丙二醛(MDA)的測定

樣本前處理：準確稱取小腸黏膜組織50 mg，加入生理鹽水450 μL制成10%的勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清再用生理鹽水按1∶4稀釋成2%的勻漿待測。SOD、CAT、GPx、MDA的測定按試劑盒說明書進行。

1.2.4 血清細胞因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的測定

細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的測定按放免試劑盒說明書進行。

1.2.5 小腸黏膜RT-PCR阿片受體mRNA表達分析

1.2.5.1 總RNA提取

取約50 mg的大鼠小腸黏膜組織，用電動勻漿機徹底勻漿后，采用TRIzol一步抽提法提取胰臟的總RNA。

1.2.5.2 反轉錄

分別取1 μg/μL各樣品的總RNA 2 μL進行反轉錄。反轉錄反應體積為25 μL，其中含Oligo dT(18)5μmol/L引物，4 mmol/L dNTP，加DEPC水至10 μL，70 ℃變性5 min，冰上冷卻。再加入8 U RNA酶抑制劑，100 U反轉錄酶，5 μL 5×RT Buffer(含250 mmol/L Tris-HC1 pH 8.3，150 mmol/L MgCl2，375 mmol/L KC1，50 mmol/L DTT)，補充DEPC水至25 μL，37℃反應60 min，95 ℃變性5 min，反轉錄產物(RT Products)-20 ℃保存備用。

1.2.5.3 阿片受體mRNA的RT-PCR分析

阿片受體引物序列見表1。

表1 mu阿片受體、delta阿片受體、kappa阿片受體和β-actin引物參數

1.2.6 統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。數據以(平均值±標準差)表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較用t檢驗。plt;0.05為差別有顯著性意義。

2 結果

2.1胃、十二指腸病理學變化

非甾體類藥物損傷劑造成的胃損傷性病變主要表現為胃黏膜上皮細胞輕微或輕度變性、壞死，固有層和黏膜下層有少量嗜酸性粒細胞浸潤。病理學檢查發現，低劑量組的損傷比較輕微，其次是中劑量組，高劑量小麥低聚肽組、小麥蛋白組和谷氨酰胺組基本一致，損傷稍微重一些。損傷組的損傷最重，出現較嚴重的胃黏膜上皮細胞變性、壞死，炎性細胞浸潤。具體病變狀況見圖1。

圖1 大鼠胃體組織形態學觀察(200×)Fig.1 Histologic observation of stomach body in rats (200×)注：A=空白組，B=損傷組，C=低劑量小麥低聚肽組，D=中劑量小麥低聚肽組，E=高劑量小麥低聚肽組，F=小麥蛋白組，G=谷氨酰胺組A=control group, B=damage group, C=low dose of wheatoligopeptide group, D=medium dose of wheat oligopeptide group, E=high dose of wheat oligopeptide group, F=wheat gluten group, G=glutamine group。圖2同。

非甾體類藥物損傷劑造成的十二指腸黏膜損傷主要表現為絨毛輕微或輕度水腫。病理學檢查發現，低劑量組大鼠十二指腸損傷較輕，其次是中劑量組，高劑量小麥低聚肽組、小麥蛋白組和谷氨酰胺組基本一致，損傷稍微重一些。損傷組的損傷最重。具體病變狀況見圖2。

圖2 大鼠小腸形態學觀察(200×)Fig.2 Histologic observation of small intestine in rats (200×)

2.2小麥低聚肽對大鼠小腸黏膜SOD、CAT、GPx的活性及MDA的影響(表2)

灌胃后，藥物損傷組大鼠胃腸道后，其小腸黏膜氧化應激加劇，表現為小腸黏膜SOD、CAT、GPx的活力顯著下降。與空白對照組相比，損傷模型組動物小腸黏膜SOD、CAT和GPx的水平均明顯降低(t=2.518,plt;0.05；t=2.798,plt;0.05；t=2.264,plt;0.05)，而MDA含量則明顯高于空白對照組(t=2.801，plt;0.05)。

灌胃給予低、中劑量小麥低聚肽組動物小腸黏膜GPx活性明顯回升，高于損傷模型組(t=2.347,plt;0.05；t=2.855，plt;0.05)；低劑量小麥低聚肽組動物小腸黏膜MDA含量明顯低于損傷模型組(t=2.549，plt;0.05)。

表2 小麥低聚肽對大鼠小腸黏膜SOD、CAT、GPx的活性及MDA的影響(n=10)

注：*表示與空白對照組相比差異顯著(plt;0.05)，#表示與損傷模型組相比差異顯著(plt;0.05)。

2.3血清細胞因子的變化

灌胃后，與空白組相比，損傷組血清中IL-1β、IL-6含量無變化。與損傷組相比，灌胃小麥低聚肽、小麥蛋白和谷氨酰胺組血清中IL-1β、IL-6含量無變化。但是與空白組相比，損傷組血清中TNF-α含量要顯著升高(t=2.651，plt;0.05)；與損傷組相比，低劑量小麥低聚肽組血清TNF-α含量要顯著降低(t=2.279，plt;0.05)，其他處理組血清中TNF-α含量無變化(見表3)。

表3 血清中細胞因子的變化(n=10) 單位：ng/L

注：*表示與空白對照組相比差異顯著(plt;0.05)，#表示與損傷模型組相比差異顯著(plt;0.05)。

2.4小腸黏膜阿片受體mRNA表達的變化

通常在小腸黏膜，delta、kappa阿片受體是不轉錄的。通過RT-PCR的方法來觀察大鼠小腸黏膜阿片受體的轉錄發現，非甾體類藥物損傷大鼠小腸黏膜后，損傷模型組的大鼠小腸黏膜mu阿片受體轉錄高于空白組。中、低劑量小麥低聚肽干預30 d后再藥物損傷，發現小麥低聚肽能顯著下調小腸黏膜mu阿片受體的轉錄(t=2.367，plt;0.05；t=2.448，plt;0.05)。

圖3 小腸黏膜阿片受體mRNA表達Fig.3 mRNA expression of opioid receptor in small intestine mucosa

表4 小腸黏膜阿片受體mRNA表達的變化

注：*表示與空白對照組相比差異顯著(plt;0.05)，#表示與損傷模型組相比差異顯著(plt;0.05)。

3 討論

NSAIDs是一類常見的藥物，具有消炎、止痛、退熱和抗血小板的作用，主要用于炎性疾病、關節炎、疼痛、發熱、缺血性腦血管障礙等疾病的預防與治療。NSAIDs中不同種類藥物對胃腸道黏膜損害的危險程度不一致，安全劑量范圍也不一樣。例如，成人阿司匹林口服量約為1.0～2.0 g/d。很多臨床的結果顯示NSAIDs的大量使用對胃腸黏膜的損傷比人們預期的要大得多。

近年來研究發現，NSAIDs導致的消化道損傷與組織的氧化應激有重要關系[12]。有文獻報道大鼠灌胃NSAIDs之后消化道黏膜的MDA含量顯著增加[13]。而本研究發現低劑量的小麥低聚肽可以減少腸損傷大鼠的小腸黏膜的MDA含量，本結果提示小麥低聚肽可以降低組織的氧化應激水平。

SOD、CAT和GSH-Px是機體清除活性自由基的主要酶類。SOD可以把超氧自由基轉化為過氧化氫，體內的CAT和GSH-Px會立即將其分解為完全無害的水[14-15]?？寡趸割惖南嗷f作構成了機體自由基產生與清除的平衡。本研究發現NSAIDs的急性損傷會導致小腸黏膜中SOD活性的下降，這個結果是與NAIR的研究結論相一致的[16]。CAT是一種酶類清除劑，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結合酶。它可促使過氧化氫分解為分子氧和水，清除體內的過氧化氫，從而使細胞免于遭受過氧化氫的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一。本研究發現灌胃大劑量NASIDs后大鼠小腸黏膜CAT活性會下降，這與NAIR的研究結果一致[16]。GSH-Px是減少氧化應激的關鍵酶，能催化GSH變為GSSG，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時促進過氧化氫的分解，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害。本研究的結果顯示灌胃大劑量的NSAIDs后小腸黏膜的GSH-Px活性顯著下降，而小麥低聚肽卻能提高腸損傷大鼠腸黏膜GSH-Px的活性。

以上結果提示小麥低聚肽可以增加部分抗氧化應激酶的活力，從而減少了腸損傷情況下黏膜的氧化應激。同時也進一步加深了本研究對于NSAIDs致氧化應激損傷的這方面的認識。SUETSUNA等報道小麥低聚肽在體外有很強的抗氧化活性[17]，而本研究的結果進一步證實小麥低聚肽在體內也能發揮抗氧化作用。

在NSAIDs介導的胃腸道損傷的病理過程中，TNF-α是主要的致炎細胞因子，同時它也加劇了機體和組織中ROS的產生[8]。IL-6和IL-1β是炎癥反應中其他的重要介質[9]。本研究中灌胃高劑量的NSAIDs后，大鼠血清中TNF-α的含量顯著上升，這個結果與MURAKAMI的研究一致[10]。而低劑量的小麥低聚肽能顯著降低大鼠血清中TNF-α的含量，這可能因為小麥低聚肽有一定的消炎抗感染作用[11]。TNF-α、IL-6和IL-1β是胃腸道損傷過程中重要的致炎因子，因此，抑制一些炎癥因子可能是一個有效減少胃腸道損傷的重要手段。

阿片受體可以細分為三類：mu、delta和kappa阿片受體。腦啡肽和強啡肽各自是delta和kappa阿片受體內源性配體。HUEBNER和FUKUDOME發現一些來源小麥蛋白的肽具有很高的阿片樣活性[18-19]。已有研究發現mu阿片受體與小腸運動有確定的聯系[20-21]。藥理學的研究也顯示無論是體內還是體外試驗阿片受體激動劑都會影響小腸的運動，這與阿片受體激動劑能影響神經遞質的釋放從而影響腸蠕動的反射有關[22-23]。另外ROY等人觀察mu阿片受體敲除的小鼠時發現mu阿片受體的存在延長了食物的胃腸通過時間[24]。但是，阿片受體對于小腸黏膜的作用研究比較少。本研究結果顯示灌胃小麥低聚肽會顯著降低小腸黏膜mu阿片受體的轉錄，這可能是小麥低聚肽發揮其生物學功能的一個可能途徑。本實驗的研究結果發現低、中劑量的小麥低聚肽比高劑量的小麥低聚肽有更好的小腸保護作用，推測小麥低聚肽可能是通過抑制受體表達、受體的過飽和等途徑來影響機體的生理功能。本研究將開展進一步的機制研究。

本研究明確了谷氨酰胺對胃腸黏膜的保護與修復作用，但游離的谷氨酰胺不穩定，小麥低聚肽中的谷氨酰胺以低聚肽形式存在，比游離的谷氨酰胺穩定，低劑量小麥低聚肽組對胃腸黏膜的保護與修復作用更強，可在一定程度上作為谷氨酰胺的替代品使用。

4 結論

灌胃一定量的小麥低聚肽、小麥蛋白、谷氨酰胺30 d后，能減少非甾體類藥物對胃腸黏膜的損傷。低、中劑量小麥低聚肽處理組的大鼠胃腸組織損傷的程度要比模型組低，低劑量小麥低聚肽組作用最強，效果優于小麥蛋白組和谷氨酰胺組。其作用機制可能與小麥低聚肽能夠上調小腸黏膜谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的活力，降低小腸黏膜的脂質過氧化水平有關。通過對分子機制進行初步探討，發現小麥低聚肽能減少非甾體類藥物對小腸黏膜的損傷可能與其能調控mu阿片受體的轉錄有關。

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Protectiveeffectofwheatoligopeptidesandglutamineagainstgastrointestinalmucosadamageinrats

LIU Wen-ying1, YANG Xian2, CAO Ke-lu1, GU Rui-zeng1, PAN Xing-chang1, SUN Gui-ju2*

1(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100015, China) 2(School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, China)

Purpose: The present study was aimed to investigate the effect of wheat oligopeptide and glutamine on non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) which induced gastrointestinal mucosa damage in rats. Method: 70 SD rats were randomly divided into control group, damage group, low, medium and high doses of wheat peptide group (the doses were 20, 100 and 500 mg/(kg·d), wheat gluten group and glutamine group (the doses were both 20 mg/(kg·d)). The rats were administered once a day for 30 days. Before sacrificing, NSAIDs were infused into the digestive tract twice. Serum, stomach and small intestine mucosa samples were collected to observe the changes in serum cytokine, pathological section of stomach and small intestine, as well as enzyme activity of small intestinal antioxidase and opioid receptor mRNA expression. Results: Wheat oligopeptides administration reduced gastrointestinal mucosa damage, and significantly decreased the level of TNF-alpha in serum. Oxidative stress was significantly increased after NSAID infusion.. Wheat oligopeptides increased GSH-Px activity in mucous membrane of small intestine. Mu opioid receptor mRNA expression decreased more significantly in wheat oligopeptides treated rats than in the control group. Conclusion: Non-steroidal anti-inflammatory drugs can induce small intestinal damage in rats and wheat oligopeptides administration can protect gastrointestinal tissue against NSAID-induced gastrointestinal damage and oxidative stress. Lower doses of wheat peptide group showed the strongest effects, even better than glutamine group.

wheat oligopeptides; glutamine；non-steroidal anti-inflammatory drugs; gastrointestinal mucosa damage

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013679

碩士，工程師(孫桂菊教授為通訊作者,E-mail：gjsun@seu.edu.cn)。

國家十三五重點研發計劃(2016YFD0400604)；國家高技術研究發展計劃(863計劃)項目(2013AA102205-02)；國家自然科學基金面上項目(31671963)；北京市科委專項(Z161100005016030，Z171100001317006)

2016-12-27，改回日期：2017-05-10