葡萄糖對熱帶假絲酵母菌株SFX-Y9木糖醇發酵的影響

趙祥穎，張立鶴，韓延雷，楊麗萍，田延軍，劉建軍

(山東省食品發酵工業研究設計院，山東省食品發酵工程重點實驗室,山東 濟南，250013)

葡萄糖對熱帶假絲酵母菌株SFX-Y9木糖醇發酵的影響

趙祥穎*，張立鶴，韓延雷，楊麗萍，田延軍，劉建軍

(山東省食品發酵工業研究設計院，山東省食品發酵工程重點實驗室,山東 濟南，250013)

以熱帶假絲酵母SFX-Y9為研究對象，考察葡萄糖添加對木糖醇發酵的影響。研究發現，菌株SFX-Y9以葡萄糖為碳源培養種子，不僅可以提高菌體濃度、縮短培養時間，而且對木糖的轉化基本沒有影響；發酵培養基中添加少量葡萄糖可以提高木糖消耗速率、縮短發酵周期。采用5 L發酵罐通過精準控制過程溶氧和低流速流加葡萄糖可以進一步提高木糖消耗速率，同時可以提高木糖轉化率約15%。在最佳供氧和葡萄糖為輔助碳源的條件下，菌株SFX-Y9木糖醇最大生產速率可達5.0 g/(L·h)以上，轉化率可達80%以上，生產成本可以與化學加氫競爭，具有非常好的工業開發應用前景。

熱帶假絲酵母；木糖醇；葡萄糖；耗糖速率；轉化率

木糖醇是一種五碳的多元醇甜味劑，甜度與蔗糖相當，具有抗齲齒、吸濕性好、生物穩定性高、甜度與蔗糖相當等優點，被廣泛地應用在食品工業中[1]。同時，木糖醇在醫療、制藥、化工、涂料等行業也有廣泛用途[2]。

木糖醇目前主要是以木糖為原料采用化學加氫法生產。生產用木糖主要來源于半纖維素水解，如果采用水解液直接加氫，因為水解液中其他糖類物質的存在會造成木糖醇分離困難。所以，工業生產一般是先精制木糖，然后以純木糖為原料經化學加氫制備木糖醇?；瘜W加氫生產木糖醇轉化率高、提取收率高，但加氫需要的氫氣為易燃易爆物質，廠區安全級別要求高，具有較大的安全隱患。木糖醇也可以通過生物轉化生產，有許多酵母可以轉化木糖生成木糖醇。生物轉化的優點是條件溫和，生產過程安全，但生物轉化轉化率偏低，轉化周期長，生產成本與化學加氫相比沒有競爭力。為了降低原料成本，人們多寄希望于直接采用半纖維素水解液為原料進行木糖醇發酵[3]。半纖維素原料在水解過程中會產生糠醛、香草醛等對酵母菌體生長有害的化學物質，水解液需經預先脫毒處理才能用于生物轉化[4]，并且因為原料中的其他糖、醇成分的干擾，同樣會造成后續木糖醇分離純化困難[5]。因此，采用水解液為原料不但不能降低成本反而會增加生產成本，用水解液作原料進行木糖醇生物轉化并不可取[6]。從生產實際考慮，采用純凈木糖為原料進行生物轉化仍是最佳選擇，但如果和化學加氫形成競爭力，必須進一步提高木糖轉化效率，降低原料成本；同時提高菌株發酵效率、縮短轉化周期，降低轉化成本[7]。

酵母轉化木糖生成木糖醇的轉化率一般只能達到理論值的65% ～ 85%，主要原因是菌體消耗了一部分木糖醇提供木糖還原所需NADPH。為了提高木糖的轉化率，降低木糖的消耗，可以通過添加低成本輔助碳源提供NADPH，提高木糖轉化率，葡萄糖是理想的選擇。葡萄糖同化速率快，有利于菌體生長，并且來源豐富、價格便宜，只有木糖的1/5。但葡萄糖的存在對木糖的利用有阻遏作用[8]，添加葡萄糖可能會延滯木糖的消耗，從而使發酵周期延長，同樣會增加生產成本。

通過添加少量的葡萄糖提高木糖轉化率最初是由日本YAHASHI等[9]提出來的。他們通過控制適當的葡萄糖濃度消除了葡萄糖對木糖的阻遏作用，提高木糖轉化率約20%。韓國OH等[10]曾通過流加控制合適的葡萄糖濃度，使木糖轉化率得到較大幅度提升，最高達93%。而VANDESKA[11]等人報道，在發酵培養基中添加葡萄糖為木糖的1/10時，菌體量增加2倍，但木糖醇轉化率和產率卻有所降低。KASTNER等研究結果顯示，添加葡萄糖發酵過程中會積累乙醇，反而抑制了菌體的后續生長降低了轉化率[12]。

作者等前期從自然界分離到1株高產木糖醇的熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)SFX-Y9[13]，經條件優化后，木糖消耗速率最高可達6 g/(L·h)，但轉化率卻只有70%左右。本項目以菌株SFX-Y9為研究對象考察葡萄糖添加對木糖醇發酵的影響，探討利用輔助碳源提高木糖轉化效率的可能性。

1 材料和方法

1.1材料與試劑

1.1.1 菌種

菌株candidatropicatisSFX-Y9，山東省食品發酵工程重點實驗室篩選并保藏。

1.1.2 培養基

種子培養基(g/L)：木糖(或葡萄糖)50，酵母膏 5，玉米漿 5，MgSO4·7H2O 1，KH2PO42，NaCl 2，pH自然。

發酵培養基(g/L)：木糖150～200，酵母膏5，玉米漿 5，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 2，KH2PO42，NaCl 2，pH自然。

所有培養基中的木糖均與其他成分分開滅菌。

1.2培養方法

1.2.1 種子培養

用接種針從斜面培養基上取1環接種到裝有50 mL發酵培養基500 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養8～12 h。

1.2.2 搖瓶發酵

培養好的種子液按10%接種量接種到發酵培養基中，裝液量為50 mL/500 mL，30 ℃、180 r/min搖床培養。

1.2.3 5 L發酵罐實驗條件

發酵培養基，初始木糖質量濃度約為150 g/L，另外添加10 g/L葡萄糖。接種10%種子液(用50 g/L葡萄糖為碳源的種子培養基，斜面接種后培養8 h)。接種培養4～6 h后開始流加葡萄糖，流加速率為1 g/(L·h)；當木糖濃度降至50 g/L左右分兩次補加木糖80 g/L。發酵過程中，0～8 h控制相對溶解氧濃度為20%～30%，8 h后逐步將相對溶氧水平降至0～5%。發酵過程中定時取樣分析木糖、木糖醇、葡萄糖、菌體濃度、pH等參數。

1.3分析方法

1.3.1 木糖、木糖醇、乙醇定量分析

將發酵液離心取上清液，稀釋適當的倍數，采用HPLC分析木糖、木糖醇、乙醇含量，采用外標法進行定量。

HPLC分析條件：

色譜儀：戴安UV3000，檢測器：示差檢測器，色譜柱：Carbomix Ca-NP5:8%，流動相：超純水，流速：0.8mL/min，進樣量：20 μL，柱溫：80 ℃。

1.3.2 葡萄糖測定

采用SBA-40D葡萄糖測定儀測定。

1.3.3 蛋白含量的測定

參照BRADFORD的考馬斯亮藍法[14]，以牛血清蛋白為標準品。

1.3.4 生物量測定

發酵液稀釋10倍，在600 nm下測定吸光度。

1.3.5 pH值測定

利用PSH-2C精密型酸度計對發酵液進行測定。

1.4計算方法

(1)

(2)

2 結果和討論

2.1葡萄糖對菌株SFX-Y9生長的影響

分別以木糖和葡萄糖為碳源種子培養基培養菌株SFX-Y9，培養過程中糖的消耗速率與菌體生長曲線如圖1所示。結果顯示以葡萄糖為碳源SFX-Y9糖消耗速率(圖1-A)和菌體生長速率(圖1-B)明顯比以木糖為碳源快。種齡10 h，葡萄糖為碳源的種子液菌體濃度是木糖的1.45倍，說明SFX-9同化葡萄糖的能力更強，葡萄糖更有利于菌株的生長快，與文獻[9-10]報道一致。

圖1 碳源對菌株SFX-Y9底物消耗和生長速率的影響Fig.1 Effect of carbon on the growth of strains SFX-Y9

2.2種子培養基碳源對菌株SFX-Y9木糖醇發酵的影響

葡萄糖雖然有利于菌株的生長，但木糖醇發酵是以木糖為底物轉化的，以葡萄糖為碳源培養菌種，接種后因為碳源的轉換可能會造成菌體生長和木糖消耗延滯。分別以葡萄糖和木糖為碳源培養的菌株SFX-Y9種子液，然后接種進行木糖醇發酵，發酵過程木糖的消耗、木糖醇的積累、菌體生長以及過程pH 變化如圖2所示。

—■—木糖培養菌種 —□—葡萄糖培養菌種(A)木糖消耗；(B)木糖醇的積累；(C)菌體濃度；(D)發酵液pH圖2 不同種子培養基對菌株SFX-9木糖醇發酵的影響Fig.2 Effect of different seed media on the xylitol fermentation of SFX-9

從結果來看，以葡萄糖為碳源培養菌種，接種后沒有觀察到菌體生長和木糖消耗的延滯現象?？赡苁且驗槠咸烟菫樘荚捶N子液，菌體濃度比木糖為碳源的高，相對接種量大的原因，接種后木糖的耗糖速率(圖2-A)、菌體生長(圖2-B)、木糖醇生成速率(圖2-C)反而比木糖培養的種子液略快。以葡萄糖為碳源培養菌種，不僅生長速度快，并且對木糖醇發酵也沒有影響，工業生產中用葡萄糖代替木糖培養菌種可以節省原料成本。

2.3葡萄糖添加對菌株SFX-Y9木糖醇發酵的影響

酵母轉化木糖生產木糖醇的代謝機制為：木糖在木糖還原酶(XR)的作用下以加氫生成木糖醇，木糖醇在木糖醇脫氫酶(XDH)的作用下氧化成木酮糖進入磷酸五糖途徑(HMP)[1]。XR輔酶是NADPH，XDH輔酶為NAD+，在限制供氧的條件下，NAD+再生受到限制，抑制了XDH 的活性，從而導致木糖醇積累。酵母轉化木糖生成木糖醇的轉化率一般只能達到理論值的65%～85%，主要原因是菌體消耗了一部分木糖醇提供木糖還原所需輔酶NADPH。以葡萄糖為輔助碳源進行木糖醇發酵的目的就是希望菌種可以利用葡萄糖提供輔酶NADPH，減少木糖的消耗。本研究在菌種培養實驗的基礎上，考察了在發酵培養基中添加葡萄糖對菌株SFX-Y9木糖消耗速率和轉化率的影響。實驗結果顯示(表1)，葡萄糖添加量在5～30 g/L之間時木糖消耗速率隨著葡萄糖添加量的增加逐漸加快，當葡萄糖添加量增加至40 g/L時，木糖消耗速率開始出現下降趨勢。研究在發酵培養基中添加葡萄糖最初目的是為了降低木糖消耗，提高木糖/木糖醇轉化率，但實驗結果并沒有預期的木糖轉化率提高，只有添加量為10～20 g/L時木糖轉化率略有增加。

表1 初始葡萄糖濃度對菌株SFX-Y9木糖醇發酵的影響

注：發酵培養基木糖質量濃度按190 g/L配制，不添加葡萄糖實驗組，接種木糖為碳源的種子液，添加葡萄糖的實驗組，接種葡萄糖為碳源的種子液，接種量均為10%，為了保持接種量一致性，種子液培養時間略有不同。

為了進一步探討葡萄糖添加對菌株SFX-Y9木糖消耗的影響機制，選取30 g/L葡萄糖添加對其發酵進程進行了考察。實驗分為2組，一組在發酵培養基中添加30 g/L葡萄糖，對照組不添加葡萄糖，均接種10%葡萄糖為碳源的種子液，實驗發酵進程如圖3所示。

A-木糖消耗；B-木糖醇的積累；C-菌體濃度；D-發酵液pH圖3 葡萄糖添加對菌株SFX-Y9木糖醇發酵進程的影響Fig.3 Effect of glucose on the xylitol fermentation progress of SFX-Y9

實驗結果顯示，發酵培養基中添加葡萄糖，發酵前期菌體生長速率明顯高于對照組，培養前8 h發酵液的OD比對照組提高30%，培養20 h以后菌體濃度差距縮小，發酵結束時菌體濃度差距并不明顯(與表1結果相似)。培養前8 h，對照組的木糖消耗速率略高于葡萄糖添加組，但8 h以后葡萄糖添加組木糖消耗速率明顯加快，并迅速超過未添加組，最終發酵周期比對照組縮短8 h以上。添加葡萄糖轉化率70.8%，未添加組轉化率為69.2%，差距不明顯。所以葡萄糖添加主要作用是促進菌體生長，對轉化率貢獻率較低。對添加葡萄糖木糖醇發酵液中有少量乙醇積累(約10 g/L)，而純木糖發酵發酵液中基本檢測不到乙醇(圖4)，因此推測菌株SFX-Y9對葡萄糖消耗可能更多是經糖酵解途徑，然后進一步在乙醇脫氫酶的作用下還原生成乙醇，同時再生了NAD+，這樣可能促進木糖醇的進一步代謝，抵消了葡萄糖對轉化率的貢獻。

圖4 葡萄糖添加對菌株SFX-9代謝產物的影響Fig.4 Effect of glucose on the products(metabolites)of SFX-Y9

2.4葡萄糖低速流加對菌株SFX-Y9木糖醇發酵的影響

搖瓶實驗結果顯示，葡萄糖的添加雖然可以縮短菌株發酵周期，但對其木糖轉化率增加并不明顯，推測可能是因為葡萄糖代謝反而激發了木糖醇的進一步消耗造成的。搖瓶發酵由于條件所限，對過程參數和底物濃度的控制都不能進行調節，因此采用5 L罐發酵，通過過程參數的控制和對糖濃度的調節，繼續考察了葡萄糖對菌株SFX-Y9木糖醇發酵的影響。實驗發現采用一次添加葡萄糖的方式進行發酵，結果與搖瓶培養相似，添加葡萄糖只能縮短發酵周期，對木糖轉化率幾乎沒有貢獻。一次性添加葡萄糖，菌株優先利用葡萄糖，木糖消耗受到抑制，菌體葡萄糖和木糖代謝不同步，并且葡萄糖主要通過EMP途徑代謝，對木糖轉化率貢獻較低。葡萄糖對木糖的阻遏效應當葡萄糖濃度低于某一值時解除，可以實現木糖和葡萄糖同步利用。通過流加的方式控制發酵液中葡萄糖濃度，結果表明采用低速(1 g/(L·h))流加葡萄糖可以明顯提高木糖的轉化率。同時適當降低初始木糖濃度，可以減輕初始糖濃度對菌體生長的抑制。實驗采用初始木糖質量濃度為150 g/L，添加10 g/L葡萄糖，發酵4～6 h后，用每小時1 g/L的速率流加葡萄糖，當發酵液中木糖濃度降至50 g/L時，分2次補加木糖80 g/L，發酵進程如圖6所示。發酵結果顯示發酵過程中發酵液中基本檢測不到葡萄糖，平均木糖消耗速率達4.0 g/(L·h)以上，最高木糖消耗速率達7.0 g(L·h)以上，木糖醇平均生產速率達3.5 g/(L·h)以上，木糖醇最大生產速率可達5.0 g/(L·h)以上，木糖轉化率達82.4%，發酵液中幾乎檢測不到乙醇(圖5)。發酵過程中共計流加葡萄糖約40 g/L，對木糖轉化率的貢獻約10%。比一次添加葡萄糖發酵木糖轉化率提高約15%。

圖5 低速流加葡萄糖對菌株SFX-Y9代謝產物的影響Fig.5 The products of SFX-Y9 in low speed fed glucose

圖6 5 L發酵罐補料發酵進程Fig.6 The process of fed-batch fermentation in 5 L fermenter

3 結論

作者前期分離到1株木糖醇高產菌株SFX-Y9，經進一步優化后，木糖消耗速率最高可達6 g/(L·h)，是1株有工業應用潛力的菌株。文獻報道采用葡萄糖為輔助碳源可以提高木糖的轉化率。本項目研究了葡萄糖對該菌株生長及木糖醇發酵的影響。實驗結果顯示，用葡萄糖為碳源種子培養基培養種子，可以提高菌體濃度，縮短培養時間，并且對木糖醇發酵基本沒有影響，完全可以替代木糖用于菌種培養；發酵培養基中添加少量葡萄糖可以縮短發酵周期10%以上。采用5 L發酵罐，通過嚴格控制過程溶氧和采用低流速流加葡萄糖不僅可以進一步提高木糖消耗速率，同時可以提高木糖轉化率約15%。綜上，葡萄糖添加對菌株SFX-Y9木糖醇發酵效益的提高還是非常顯著的。在最佳供氧和葡萄糖為輔助碳源的條件下，菌株SFX-Y9木糖醇最大生產速率可達5.0 g/(L·h)以上，轉化率可達80%以上，生產成本可以與化學加氫競爭，具有非常好的工業開發應用前景。

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EffectofglucoseonxylitolfermentationbyCandidatropicalisSFX-Y9

ZHAO Xiang-ying*, ZHANG Li-he, HAN Yan-lei, YANG Li-ping, TIAN Yan-jun, LIU Jian-jun

(Shandong Provincial Key Laboratory of Food and Fermentation Engineering, Shandong Food Fermentation Industry Research amp; Design Institute, Jinan 250013,China)

The effects of glucose on xylitol fermentation byCandidatropicalisSFX-Y9 was studied in this paper. Results showed that strains SFX-Y9 with glucose as carbon source to cultivate seeds could shorten training time and improve the concentration of cells, and had little influence upon conversion of xylose. When the fermentation medium was supplemented with a small amount of glucose, it could increase the consumption rate of xylose and shorten the fermentation cycle. Through the control of dissolved oxygen and the glucose fed-batch could further increase the rate of xylose consumption in 5 L fermentor, and the conversion rate of xylose increased by about 15%. Under the condition of optimal oxygen supply and glucose as a secondary carbon source, the production rate of xylitol can reach 5.0 g/(L·h), and the rate of conversion can reach more than 80%. The production cost of xylitol by microbial conversion can compete with the chemical hydrogenation, and it has a bright application future.

Candidatropicalis;xylitol; glucose; sugar consuming rate;yield

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014898

碩士，研究員(趙祥穎研究員為通訊作者,E-mail:xyzhao68@126.com)。

山東省自主創新重大專項(2014XGC07001)

2017-06-07，改回日期：2017-07-18