乙酰水楊酸姜黃素酯對血管緊張素II誘導的血管平滑肌細胞增殖的影響及相關機制

孫四玉，楊冬梅，戴 娜，夏伯候，庹勤慧*

（1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410208）

乙酰水楊酸姜黃素酯對血管緊張素II誘導的血管平滑肌細胞增殖的影響及相關機制

孫四玉1，楊冬梅1，戴 娜2，夏伯候1，庹勤慧2*

（1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410208）

目的探討乙酰水楊酸姜黃素酯（curcumin acetylsalicylate，CA）對血管緊張素II（Angiotensin II，AngII）誘導的血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）增殖的抑制作用及其相關機制。方法建立AngII誘導的VSMC增殖模型。采用MTT法、流式細胞術觀察CA干預對細胞活力和周期的影響。Western blot檢測其對第10號染色體同源缺失性磷酸酶張力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN）、磷酸化 AKT（p-AKT）、AKT 蛋白表達的影響。結果1、3、10 μmol/L CA可以顯著抑制AngII誘導的細胞活力，其中3 μmol/L為最佳濃度(P＜0.05)。在CA的干預下，與AngII組比較，流式細胞術顯示VSMC G0/G1期細胞數量明顯增加，S期明顯減少；Western blot顯示其可以促進PTEN蛋白表達，從而抑制AKT激活(P＜0.05)。結論 CA可以抑制AngII誘導的VSMC增殖，其機制與阻滯VSMC G0/G1期向S期轉化，以及調節PTEN/AKT信號通路有關。

乙酰水楊酸姜黃素酯；血管緊張素II；血管平滑肌細胞增殖；PTEN；AKT

經皮冠狀動脈介入治療（PCI）是治療心血管疾病的主要方法之一，但術后6個月內膜增生發生率卻高達30%～50%，給臨床帶來新的難題。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）異常增殖與遷移是內膜增生的特征之一[1]。第10號染色體同源缺失性磷酸酶張力蛋白 （phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN）可以抑制VSMC的增殖與遷移，還可以抑制血管損傷后的內膜增生，主要通過介導磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（AKT）信號通路實現其功能[2]。

乙酰水楊酸姜黃素酯 （curcumin acetylsalicylate，CA）是乙酰水楊酸和姜黃素的酯化衍生物，目前動物實驗已經證實其可以通過抑制核轉錄因子（NF-KB）信號通路而抑制高脂喂養的APOE鼠的動脈粥樣硬化的形成[3]，但其作用機制需要進一步探討。本研究擬通過AngII刺激的VSMC增殖模型[4]，觀察CA對體外培養VSMC活力的影響，并探討其機制是否與PTEN有關。

1 材料

1.1 細胞與藥物

大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞株(VSMC)購自中南大學湘雅細胞庫，乙酰水楊酸姜黃素酯由湖南中醫藥大學藥學院提供 （質量分數＞98%），溶于DMSO 中（終濃度小于 0.1%）。

1.2 試劑與儀器

胎牛血清（FBS）來自PAN公司；培養基DMEM、0.25%Trypsin-EDTA、磷酸鹽緩沖液(PBS)來自 Hyclone公司，兔單克隆抗體PTEN，兔單克隆抗體p-AKT、兔單克隆抗體AKT均來自Cell signaling公司；兔多克隆抗體Beta Actin來自proteintech公司；Ang II溶于 PBS 中，0.22 μm 膜濾過，-20 ℃保存。其他試劑購自于Sigma公司。LX800酶聯免疫儀（美國伯騰儀器有限公司）；流式細胞分析儀（BD公司）；凝膠成像分析系統（美國Alpha Innotech公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

VSMC用含10%FBS的高糖培養基（DMEM）于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養箱中培養。細胞培養至80%～90%進行傳代操作。所有實驗選擇對數期細胞。

2.2 細胞分組

為檢測CA對細胞活力的影響，實驗分組為：對照組， 1 μmol/L AngII組， 含 1 μmol/L AngII的不同濃度 CA 藥物處理組（0.1，0.3，1，3，10 μmol/L），含1 μmol/L AngII的姜黃素（10 μmol/L）組。確定最佳濃度后，后續實驗將細胞分為：（1）對照組；（2）1 μmol/L AngII組；（3）3 μmol/L CA+1 μmol/L AngII組；（4）3 μmol/L CA 組。

2.3 MTT法檢測細胞活力實驗

細胞以5 000/孔接種于96孔板，待細胞融合度達到60%～80%時，1%FBS同步化處理24 h后，加入不同處理因素孵育24 h（藥物組提前加入不含AngII的不同濃度藥物孵育2 h）。加入0.5 mg/mL 100 μL MTT 孵育 4 h，棄上清，150 μL DMSO 溶解紫色結晶沉淀，450 nm波長處測OD值。

細胞活力=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

2.4 流式細胞術檢測細胞周期

VSMC細胞以4×105接種于60 mm皿中，待細胞融合度達到60%～80%時，1%FBS同步化24 h。然后用1 μmol/L AngII和含AngII的CA分別孵育24 h，收集細胞。PBS洗滌1～3次，用80%乙醇-20℃固定 24 h。離心棄乙醇，PBS洗滌 1次，50 ng/mL PI（含 200 g/mL RNase A）37 ℃避光染色30 min，染色細胞用流式細胞儀分析周期變化。

2.5 Western blot

取各組實驗處理后細胞，用預冷的PBS洗3次，加入RIPA裂解液和PMSF的混合液100 μL(比例為100∶1)置于冰上裂解30 min，用細胞刮刮下蛋白，4℃，12 000 r/min離心15 min，收集上清。BCA蛋白定量的方法測量蛋白濃度。每個樣取30 μg并加入5×SDS凝膠上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，使其變性。配制8%聚丙烯酰胺凝膠，進行電泳分離（濃縮膠 80 V， 分離膠 120 V），0.22 μm PVDF 膜 300 mA濕轉70 min，5%脫脂牛奶慢搖封閉1h，加入一抗PTEN（1∶1 000），p-AKT（1∶2 000），AKT（1∶1 000），β-actin（1∶3 000），4℃孵育過夜，TBST洗5次，每次5 min，按1∶5 000的比例加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，然后用TBST洗膜5次，每次5 min，用化學發光顯影法進行顯影，AlphaImager 2200分析光密度值。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 MTT檢測CA對AngII誘導的VSMC活力影響

如圖1所示，與對照組相比，1 μmol/L AngII刺激24 h后可以顯著增強VSMC的活力，說明模型組構建成功 （P＜0.05）。 經不同濃度 CA干預后，VSMC 活力逐漸下降，1、3、10 μmol/L CA 具有統計學意義，其中CA濃度為3 μmol/L時抑制效果最明顯，故選擇 3 μmol/L 作為后續實驗濃度（P＜0.05）。

圖 1 CA對 AngII誘導的 VSMC活力影響 （n=5，±s）

3.2 流式細胞術檢測CA對AngII誘導的VSMC周期影響

如表1所示，與對照組相比，AngII組S期細胞比例明顯增加（P＜0.05）。 而在 CA 的干預下，G0/G1期細胞比例明顯增加 （P＜0.05），S期細胞比例減少（P＜0.05）。結果表明 CA 抑制 AngII誘導的 VSMC 增殖，主要通過阻滯G0/G1期向S期轉化實現。

表1 CA對AngII誘導的VSMC增殖的周期影響 （n=3，±s）

表1 CA對AngII誘導的VSMC增殖的周期影響 （n=3，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與 AngII組比較，**P＜0.05。

組別 G0/G1期（%） S期（%） G2/M期（%）對照組 76.48±1.92 5.52±0.06 18.00±1.94 AngII組 69.24±7.90* 12.40±4.60* 18.82±3.39 CA+AngII組 78.91±1.11** 5.32±0.99** 15.23±1.24 CA 組 77.29±3.10 4.88±1.22 17.82±2.03

3.3 CA對AngII誘導的 VSMC的PTEN， p-AKT，AKT蛋白的影響

如圖2所示，與對照組相比，AngII組PTEN蛋白表達呈下降趨勢 (P＜0.05)； 與模型組相比，CA+AngII組PTEN蛋白表達顯著上升(P＜0.05)。如圖3所示，與對照組相比，AngII組p-AKT蛋白含量顯著上升 (P＜0.05)； 與模型組比較，CA+AngII組 p-AKT蛋白含量下降(P＜0.05)。

圖2 CA對AngII誘導的VSMC的PTEN蛋白的影響 （n=3，±s）

圖3 CA對AngII誘導的VSMC的p-AKT/AKT比值的影響 （n=3，±s）

4 討論

支架內血管再狹窄是PCI術后的主要并發癥，VSMC過度增殖，遷移至內膜是其發生的主要原因之一。目前研究發現，將抗血栓藥物和抗增殖藥物包被于支架內可以明顯降低血管再狹窄的發生率。因此，尋找特異性抗VSMC增殖藥物是治療血管再狹窄的方法之一[5]。姜黃素作為傳統中藥姜黃的主要成分，已經被證實具有調脂、保護血管內皮、抑制斑塊形成、穩定斑塊、保護心肌，抑制心肌重構、改善心功能等多重作用，但由于其生物利用度低等缺點限制了這一化合物的臨床應用[6-7]。乙酰水楊酸，即阿司匹林，是應用最早，最普遍的解熱鎮痛抗風濕藥，還具有抗血小板聚集，抗血栓等方面的藥理作用，發揮藥效迅速，藥效穩定。有文獻表明，姜黃素、阿司匹林和胡蘿卜素聯合應用小劑量即可抑制人胰腺癌細胞的增殖[8]。姜黃素和阿司匹林對VSMC增殖和遷移也都有抑制作用[9-11]。目前，為了改變姜黃素在應用中的吸收缺陷問題及提高藥物療效，國內外研究者對姜黃素進行酯化改善，發現其酯化物抗氧化、抗菌、抗腫瘤等效果明顯優于姜黃素[12]。為了改善姜黃素的生物利用度和加強療效，我們將姜黃素和乙酰水楊酸酯化得到CA，期望得到具有抗炎、抗血栓以及高效抑制VSMC增殖能力的藥物。本研究結果顯示1 μmol/L AngII能顯著增強VSMC活力，說明模型組構建成功。3 μmol/L CA可以顯著抑制AngII誘導的VSMC活力。進一步流式細胞術檢測周期發現，CA主要通過阻滯細胞由G0/G1期向S期轉換，從而抑制AngII誘導的VSMC增殖。

PTEN是至今發現的第一個具有雙重磷酸酶活性的抑癌基因，其對細胞的增殖、遷移、分化、黏附、凋亡等多種生物學行為有重要影響。最近實驗結果表明，PTEN可以抑制AngII和PDGF誘導的VSMC的增殖與遷移，還可以抑制血管損傷后的內膜增生，主要通過介導PI3K/AKT信號通路實現其功能[2,13]。因此，PTEN是影響VSMC增殖的重要靶點之一。本研究結果顯示，CA可能通過增加PTEN的表達，從而抑制AKT的激活，拮抗AngII誘導的VSMC增殖。

綜上所述，CA抑制Ang-II誘導的VSMC細胞增殖，其可能與上調PTEN蛋白表達，降低AKT活性有關，為CA應用于動脈粥樣硬化和血管狹窄等疾病的防治提供了一定的實驗依據。同時也說明姜黃素酯化衍生物有很大的發展空間，為姜黃素酯化衍物的臨床應用研究提供了一些科學依據。

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（本文編輯 蘇 維）

Effect and Mechanism of Curcumin Acetylsalicylate on Angiotensin II Induced Proliferation in Vascular Smooth Muscle Cells

SUN Siyu1,YANG Dongmei1,DAI Na2,XIA Bohou1,TUO Qinhui2*
(1.School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Medical School,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of curcumin acetylsalicylate (CA)on Angiotensin II(AngII)induced proliferation in vascular smooth muscle cells(VSMC).MethodsVSMC proliferation model was induced by AngII.Flow cytometry was used to observe the effect of CA on cell proliferation and cycle.The expressions of PTEN,p-AKT and AKT was detected by Western blot.Results1,3,10 μmol/L CA led to a significant inhibition of Ang II-induced proliferation of VSMCs and 3 μmol/L CA was proved to be an optimal inhibitory concentration (P ＜0.05).Flow cytometry showed that the number of cells in G0/G1 phase increased significantly and the number of S phase decreased significantly by the intervention of CA.Western blot showed that it could promote the expression of PTEN protein and inhibit the activation of AKT (P＜0.05).ConclusionCA can obviously inhibit the VSMC proliferation induced by AngII,and its mechanism is related to the inhibition of transformation from G0/G1 phase to S phase and the regulation of PTEN/Akt signaling pathway.

curcumin acetylsalicylate;angiotensin II;vascular smooth muscle cells proliferation;PTEN;AKT

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.11.013

本文引用：孫四玉，楊冬梅，戴 娜，夏伯候，庹勤慧.乙酰水楊酸姜黃素酯對血管緊張素Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞增殖的影響及相關機制[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（11）：1222-1225.

2017-05-25

國家自然科學基金項目（81673722）；湖南省杰出青年基金（14JJ1024）；省自然科學基金（2015JJ2117）；湖南省教育廳重點項目（16A156）。

孫四玉，女，在讀碩士研究生，研究方向：心血管藥理。

*庹勤慧，女，教授，博士研究生導師,E-mail:qhtuo@aliyun.com。