膽甾醇基γ-聚谷氨酸負載阿霉素納米膠束的制備與體內外釋藥性能評價

姚 俊，肖 港，徐 寧，曹 新，徐 虹

(1. 南京醫科大學 基礎醫學院 生物技術系，江蘇 南京 211166；2. 南京工業大學 食品與輕工學院 材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211800)

膽甾醇基γ-聚谷氨酸負載阿霉素納米膠束的制備與體內外釋藥性能評價

姚 俊1，肖 港1，徐 寧1，曹 新1，徐 虹2

(1. 南京醫科大學 基礎醫學院 生物技術系，江蘇 南京 211166；2. 南京工業大學 食品與輕工學院 材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211800)

筆者制備了膽甾醇基γ-聚谷氨酸負載阿霉素納米膠束(DOX/NPs)，并考察了該載藥納米膠束體系的形態與粒徑、載藥量、包封率以及體內外釋藥的特性。結果表明：DOX/NPs的最佳載藥量為22.4%，包封率為90.2%，平均粒徑為(312.3±7.2) nm，電鏡下觀察呈現明顯的核殼結構。體外釋藥結果顯示，DOX/NPs能延緩阿霉素的釋放，并具有pH敏感的釋藥特性。小鼠體內釋藥結果表明：阿霉素經包埋后其消除半衰期(t1/2)、藥時曲線下面積(AUC)、平均滯留時間(MRT)均明顯大于游離阿霉素，達到了藥物緩釋的目的。

納米膠束；γ-聚谷氨酸；阿霉素；釋藥；藥代動力學

天然聚氨基酸是目前除多糖外研究較多的一種重要的功能高分子材料，因其具有良好的組織親和性、非免疫原性和生物可降解性，應用于生物醫用材料領域極具優勢。γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)是一種由微生物發酵合成的生物高分子材料，其主鏈由D,L-谷氨酸單體經γ-酰胺鍵結合形成Nylon-4結構，在機體內可被降解、吸收、代謝和排泄，不易產生積蓄和毒副作用[1-2]，其側鏈游離的羧基使之具有優于天然多糖的水溶性和化學改性性能，初步研究已顯示出γ-PGA在藥物傳輸領域的應用潛力，特別是采用兩親性嵌段/接枝γ-PGA衍生物以自組裝方式獲得功能性納米載藥膠束是目前的研究熱點[3-6]。本課題組在前期研究中成功構建了兩親性膽甾醇基γ-PGA衍生物(cholesterol-bearingγ-PGA，γ-PGA-graft-CH)及其自組裝膠束(γ-PGA-graft-CH NPs)系統[7-8]，本研究中，筆者將進一步考察γ-PGA-graft-CH NPs對阿霉素(doxorubicin，DOX)的負載性能以及體內外釋藥特性，以期為其作為抗腫瘤藥物的控緩釋載體提供初步參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

γ-PGA-graft-CH NPs(筆者實驗室自制，粒徑(299.6±5.4) nm，粒徑多分散系數為1.2)[8]；鹽酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride，DOX·HCl，浙江海正藥業有限公司)。其余試劑均為市售分析純。

JEM-1010型透射顯微鏡(日本JEOI公司)、Beckman Coulter N4PLUS型粒徑分析儀(美國)、SCIENTZ-IID型超聲波勻質儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)、LGJ-10D型低溫冷凍干燥機(北京四環公司)、高效液相色譜儀(HPLC)/色譜柱(Agilent 1200/Li Chrosphere C18，美國安捷倫公司)、Model 680型酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 γ-PGA-Graft-CH NPs對DOX的負載與表征

兩親性γ-PGA-graft-CH衍生物的合成與γ-PGA-graft-CH NPs的制備參見文獻[7-8]。在超聲條件下向空白γ-PGA-graft-CH NPs懸液(5 mg/mL)中緩慢滴加1.0 mg/mL DOX·HCl溶液，50 r/min下避光振蕩12 h，移至透析袋內，12 h更換去離子水1次，24 h后將透析液過膜超濾(截留分子量1×104)，即得負載DOX的γ-PGA-graft-CH NPs(DOX/NPs)溶液，4 ℃保存；透射電鏡下觀察膠束形態，采用粒徑分析儀測定其粒徑及粒徑分布；通過測量480 nm處的吸光度，對照DOX·HCl標準曲線計算DOX濃度。包封率和載藥量的計算見式(1)～(2)。

包封率(EE)=(投藥DOX的質量-游離DOX的質量)/投藥DOX的質量×100%

(1)

載藥量(LC)=載藥膠束中DOX的質量/載藥膠束總質量×100%

(2)

1.3 體外釋藥實驗

取1.2節制備的DOX/NPs溶液2 mL置于透析袋中，密封后分別放入裝有48 mL不同磷酸緩沖液(PBS)(pH 4.0、7.4、9.0)的錐形瓶中，37 ℃、50 r/min條件下振蕩孵育，定時取3 mL透析介質(同時補入3 mL新鮮介質)，檢測DOX的含量，方法同載藥量測定，每個樣本重復測定3次。體外釋藥率計算見式(3)。

體外釋藥率=DOX釋放量/DOX總質量×100%

(3)

1.4 體內釋藥實驗

清潔級8周C57BL小鼠(體質量20～25 g)，雌雄各半，由南京醫科大學實驗動物中心提供。將小鼠隨機分為2組(每組18只)，尾靜脈注射給藥，DOX劑量均為0.2 mg(以每只小鼠100 g計)：對照組采用DOX·HCl注射劑，實驗組采用DOX/NPs混懸液。給藥后，分別于5、10、20、40、80、160、240和320 min時從每組各取3只老鼠，摘眼球取血約0.5 mL于肝素抗凝管，3 000 r/min離心10 min，取上清血漿4 ℃保存。精確吸取100 μL待測血漿加入1 000 μL甲醇，充分搖勻后，5 000 r/min離心5 min，取上清液，HPLC法測定DOX濃度，色譜條件：流動相為乙腈-水(體積比32∶ 68)，檢測波長233 nm，流速1 mL/min，進樣5 μL。藥代動力學數據采用Kinetica v5.0軟件進行統計處理。

2 結果與討論

2.1 DOX/NPs的制備與表征

前期研究表明：γ-PGA-graft-CH衍生物具有兩親性和自組裝膠束的能力，采用超聲探頭法可制備得形態規則、粒徑均一且熱力學穩定的納米膠束[8]。載藥量對γ-PGA-graft-CH NPs負載DOX性能的影響如圖1(a)所示。由圖1(a)可知：隨載藥量增加，γ-PGA-graft-CH NPs的載藥量逐漸增加；DOX與載體膠束的藥載比小于1/10，包封率處于較高水平(>90%)；藥載比大于1/10時，載藥量雖略有提高，但包封率出現顯著下降，說明γ-PGA-graft-CH NPs對DOX的負載已達到飽和。從載藥量和包封率綜合考慮，1/10為最佳藥載比(載藥量22.4%，包封率90.2%)。

選取藥載比為1/10的DOX/NPs，透射電鏡下觀察其形態規則，結果如圖1(b)所示。由圖1(b)可知：膠束界面清晰，粒徑較為均一(250～350 nm)，且膠束呈明顯的核殼結構，可見藥物負載主要集中于核區。粒度分析結果顯示，DOX/NPs的平均粒徑在(312.3±7.2) nm，與電鏡測定結果相近，粒徑分布多分散系數(PDI)為0.23。

圖1 DOX/NPs的制備及性能Fig.1 Preparation and performace of DOX/NPs

2.2 體外釋藥實驗結果

圖2 DOX/NPs體外釋藥曲線Fig.2 Release profiles of DOX from DOX/NPs in vitro

采用不同pH的釋藥介質考察DOX/NPs的釋藥性能，結果如圖2所示。由圖2可知：DOX/NPs在pH 7.4的PBS中釋藥速率較慢，12 h的釋藥率僅為23.9%，72 h的釋藥率為32.9%；在pH 4.0與9.0的PBS介質中，釋藥速率相對較快，這主要是由于γ-PGA-graft-CH的親水區域含有大量游離羧基。在偏酸性介質中，γ-PGA-graft-CH親水段側鏈呈質子化趨勢，分子內和分子間氫鍵加強，二級結構以α-螺旋為主，其分子柔性較差，自組裝性能以及藥物負載能力減弱；在偏堿性介質中，親水區域因游離羧基電離為—COO-而荷負電，同種電荷相斥使得γ-PGA-graft-CH NPs內部結構吸水溶脹，對包封藥物的通透性增加。此外，因藥物突釋主要與鑲嵌或吸附于膠束表面或近表面的藥物在短時間內的快速釋放有關，而圖2顯示，DOX經γ-PGA-graft-CH NPs負載后無明顯突釋現象，說明DOX是包載于γ-PGA-graft-CH NPs核內，與電鏡觀察結果一致。DOX/NPs釋藥特性也見于其他pH敏感的凝膠體系中[3-6]，由于人體內各組織的環境pH各有差別，特別是腫瘤組織的微環境pH一般低于正常組織。因此，針對這一特性對設計靶向腫瘤組織或特定器官的給藥系統具有重要應用價值。

2.3 體內釋藥實驗結果

圖3為體內釋藥實驗結果。由圖3可知：除給藥后的前期(0～5 min)，在其余時間點對照組(DOX·HCl)的血藥濃度均低于實驗組(DOX/NPs)；給藥后5～40 min，對照組的血藥濃度迅速下降，而實驗組下降較慢，320 min的血藥濃度仍維持在一定水平。此結果表明，DOX經包埋后可有效降低血藥峰濃度，并顯著延長藥物在血液中的滯留時間。

圖3 DOX/NPs和DOX·HCl給藥后的藥時曲線Fig.3 Concentration-time curves of DOX/NPsand DOX·HCl

小鼠血藥濃度-時間數據經統計學分析后，主要的藥代動力學參數見表1。表1結果顯示：對照組小鼠體內DOX代謝極快，其消除半衰期僅66.87 min，這與文獻[9]報道的結果(12～100 min)相近；實驗組小鼠體內釋藥緩慢，其消除半衰期(t1/2)、血藥濃度-時間曲線下面積(AUC)、平均滯留時間(tMRT)均明顯大于對照組(p< 0.01)。此外，實驗組的藥物清除率(CL)較低，表明DOX/NPs可延長DOX在循環系統內的滯留時間，使得血漿中的藥物濃度能維持更長時間，這將有利于改善DOX的生物利用度以及治療指數。

表1 DOX在小鼠體內的藥代動力學參數

注：AUMC—一階矩曲線下面積；K—消除速率常數；Vss—穩態表觀分布體積；Cmax—藥峰質量濃度。

3 結論

本研究中，筆者制備的γ-PGA-graft-CH NPs負載DOX的最佳藥載比為1/10，對應的載藥量為22.4%，包封率達90.2%；獲得的載藥膠束粒徑分布較窄，且DOX主要包埋于γ-PGA-graft-CH NPs的核區。體外釋藥結果表明：DOX/NPs具有pH敏感的釋藥特性，且在體內外均顯示了良好的緩釋性能。綜上所述，γ-PGA-graft-CH NPs在抗腫瘤給藥領域將極具應用潛力。

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(責任編輯 管珺)

Preparationofdoxorubicin-loadednanoparticlesofcholesterol-bearingγ-polyglutamicacidanditsdrug-releaseinvivoandinvitro

YAO Jun1,XIAO Gang1,XU Ning1,CAO Xin1,XU Hong2

(1. Department of Biotechnology,School of Basic Medical Science,Nanjing Medical University,Nanjing 211166,China;2. State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Food Science and Light Industry,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

We prepared adoxorubicin (DOX) loaded nanoparticles of cholesterol-bearingγ-polyglutamic acid (DOX/NPs) and studied the properties of DOX/NPs,including drug loading,drug entrapment efficiency,drug releaseinvitroandinvivo.The optimum loading was 22.4% and entrapment efficiency was 90.2%.The mean size of DOX/NPs was (312.3±7.2) nm with narrow distribution,and a typical core-shell structure was observed via transmission electron microscope.A pH-sensitive sustainable drug-release was detectedinvitro,andinvitroexperiments confirmed the slow-releasing characteristic of DOX/NPs.Compared with DOX·HCl injections,DOX/NPs could significantly enhance the elimination half-life(t1/2),area under concentration-time curveand mean residence time to achieve the slow-release of loaded DOX.

nanoparticles;γ-polyglutamic acid;doxorubicin; drug-release; pharmacokinetics

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.06.009

2017-07-02

國家自然科學基金青年基金(51403103)；江蘇省高等學校大學生實踐創新訓練計劃(201710312065X)

姚 俊(1979—)，江蘇揚州人，博士，講師，研究方向：生物醫用材料；徐 虹(聯系人)，教授，E-mail:xuh@njtech.edu.cn

O636.9；R944.1+5

A

1672-3678(2017)06-0064-04