電針“百會”“涌泉”穴對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬β淀粉樣蛋白及載脂蛋白E水平的影響*

張學婷，張 磊，周英奕，裴亞妮，薛衛國

(北京中醫藥大學，北京 100029)

電針“百會”“涌泉”穴對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬β淀粉樣蛋白及載脂蛋白E水平的影響*

張學婷，張 磊，周英奕，裴亞妮，薛衛國△

(北京中醫藥大學，北京 100029)

目的：觀察電針對4月齡APP/PS1雙轉基因小鼠海馬載脂蛋白E(ApoE)及β淀粉樣蛋白(Aβ)水平的影響，探討針刺防治AD的機制。方法：將12只雄性4月齡APP/PS1雙轉基因陽性小鼠隨機分為模型組和電針治療組，以6只同月齡背景小鼠C57BL/6設為正常對照組，電針“百會”“涌泉”或同等條件束縛作為干預手段，每次持續15 min，每日1次，療程為2周。以酶聯免疫吸附測定法(ELASA)測定海馬Aβ1-42的含量、ApoE2、ApoE4以及膽固醇-24S-羥化酶(CYP46)的含量。結果：模型組海馬Aβ1-42的含量高于正常對照組(P<0.01)；電針治療組Aβ1-42的含量低于模型組(P<0.01)。模型組海馬ApoE2、ApoE4的含量與正常對照組相比，差異無統計學意義，電針治療組ApoE2、ApoE4的含量均高于模型組(P<0.05)。電針治療組和模型組的CYP46含量均高于正常對照組，但其差異無統計學意義。結論：電針可降低APP/PS1小鼠海馬Aβ1-42水平，其機制有可能是通過影響海馬ApoE的水平從而實現的。

電針；阿爾茨海默??；β淀粉樣蛋白；載脂蛋白E；膽固醇代謝

阿爾茨海默病(Alzheimer’s diseases,AD)是一種漸進性的中樞神經系統退行性疾病，目前尚未發現有效的治療手段。中醫針灸治療腦病已有數千年的歷史。β淀粉樣蛋白(beta amyloid protein,Aβ)級聯學說是當今比較公認的AD發病機制學說 。此學說認為AD發病的關鍵點是腦內Aβ水平的升高[1]。Aβ是由淀粉樣前體蛋白(Amyloid protein precursor,APP) 水解產生的，病理狀態下產生過量的Aβ，形成以Aβ沉積為核心的老年斑而致病，不僅如此，它的寡聚體和纖絲體形式還直接或間接的對神經元產生毒性作用[2]，其中Aβ1～42是構成淀粉樣斑塊的核心蛋白[3]。

ApoE是1973年由Shore等[4]首先發現的一種富含精氨酸的堿性蛋白，人類ApoE基因位于19號染色體，含有299個氨基酸，分為3個亞型，即ε2、ε3和ε4[5]。流行病學和遺傳學研究發現[6]ApoE4等位基因是目前公認的晚發性和散發性AD發病的重要危險因子[7]。目前大量研究表明，人體內淀粉樣前體蛋白的分解與代謝即Aβ的產生受到ApoE基因多態性的影響，但ApoE作為一種可以在腦內合成的重要的載脂蛋白，它的一項重要的功能就是參與腦內膽固醇的轉運，在腦內膽固醇代謝和神經系統發育及損傷修復過程中起著重要作用[8]。

腦是ApoE的第二大合成器官，ApoE在腦內負責腦內膽固醇和脂質蛋白的轉運，實現細胞間的物質交換[9]。有研究表明ApoE結合脂質的部位與ApoE結合Aβ的部位相同，二者存在競爭關系[10]。實際上，大腦清除Aβ主要依靠的是腦實質細胞即星型膠質細胞和神經元細胞上的受體介導，因為腦內的Aβ大多數都是先與ApoE的受體相結合，然后再轉運至細胞溶酶體內由蛋白水解酶進行降解，最后通過血腦屏障或細胞間液排出[11]。

對于正常人來說，24S-羥膽固醇可以穿過血腦屏障進入外周循環，是腦內膽固醇分解代謝的主要代謝產物[12]，腦內膽固醇主要經膽固醇-24S-羥化酶(CYP46)轉化為24S-羥膽固醇的形式轉移至肝臟代謝排出體外，所以觀察海馬CYP46的水平可以反映海馬的膽固醇的降解代謝[13]。

本課題組前期研究表明電針“百會”“涌泉”可以降低APP/PS1雙轉基因鼠海馬Aβ水平，ApoE可以影響Aβ水平,所以猜測電針干預有效降低Aβ水平是通過影響海馬ApoE的水平、調節膽固醇代謝、增加海馬內Aβ的清除從而降低了Aβ的水平。因此本實驗將觀察電針“百會”“涌泉”對學習記憶中心-海馬的ApoE、Aβ以及膽固醇的水平，探討電針防治阿爾茨海默病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物模型及分組 本實驗以SPF級APPswe/PS1dE9雄性4月齡小鼠為動物模型，在滿4月齡時稱重排序，運用隨機數字表進行完全隨機分組，將12只雄性APPswe/PS1dE9小鼠分為兩組：電針組和模型組，每組6只，6只同月齡C57BL/6雄性小鼠為正常對照組。本實驗通過北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 試劑和儀器 人Aβ42 ELASA試劑盒(美國，invitrogen,KHB3544);CYP46 試劑盒(MM-0667M1，酶免公司);ApoE2試劑盒(MM-0675M1，酶免公司);ApoE4試劑盒(MM-0676M1酶免公司);韓氏(HANs)LH202H型穴位神經刺激儀(北京華衛產業開發公司);一次性使用無菌針灸針(0.25 mm×13 mm,北京中研太和醫藥有限公司)。

1.2 治療方法

電針組：以自制鼠袋將小鼠固定于實驗操作臺，按照小鼠標準針灸穴位圖譜及動物解剖學方法，在小鼠頂骨正中取“百會”穴，在小鼠兩足足底前、中1/3交界處取“涌泉”穴。本實驗針具選用由北京中研太和醫藥公司生產的一次性針灸針，規格為0.25 mm×13 mm，穴位與針具進行常規消毒，進行針刺，針刺深度為2～3 mm，“百會” 穴運用手針，雙“涌泉” 穴在小幅度捻轉后接HANs電針儀，采用頻率為1/50 Hz，強度0.5 mA的疏密波，以小鼠保持安靜不掙扎嘶叫，針柄震顫為度。每次針刺持續15 min，每日1次，共治療2周。

模型組以及正常對照組：以相同方法用自制鼠袋束縛15 min，每日1次，共束縛2周。

1.3 腦組織取材及相關指標ELISA檢測

1.3.1 腦組織取材及ELISA樣品制備 將每只小鼠予0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，脫頸后斷頭。開顱后，在冰上取海馬，分別稱取各組實驗動物腦組織后放入各自的勻漿器中并進行編號，放置于冰上；按比例配制蛋白提取液：RIPA：PMSF=100∶1，按照10 mg組織加入100 μL提取液的比例進行配制，每次配制1 500 mL提取液；每個樣品中需加入500 μL的蛋白提取液到勻漿器中；Aβ1-42ELASA樣品制備需要在PMSF中加入8倍體積的5 mol鹽酸胍、50 mmol Tris鹽酸(pH 8.0)。在冰上進行勻漿器操作，將腦組織徹底研磨，在冰上孵育30 min，使組織細胞徹底裂解；4℃低溫下離心5 min，轉速為16000 rpm，離心后取上清液即所提取的蛋白轉移至-80℃的冰箱保存。

1.3.2 ELASA檢測 Aβ1～42檢測：采用ELISA實驗方法，用人Aβ1～42ELISA超敏試劑盒(96T,美國，invitrogen,KHB3544)對海馬組織樣品的Aβ1～42含量進行檢測，具體操作步驟按照說明書操作，最后在450 mm處檢測吸光度。將標準品按試劑盒的要求用標準稀釋液稀釋，制備標準曲線樣品。標準品稀釋后，立即置于冰上，待實驗使用。根據樣品稀釋濃度計算小鼠海馬組織的Aβ1～42濃度。

ApoE2水平的檢測：采用ELISA雙抗體夾心法，用小鼠ApoE2試劑盒(MM-0675M1酶免公司),具體操作步驟按照說明書操作，設置樣品孔和標本孔。最后在450 mm處檢測吸光度，根據樣品稀釋濃度計算小鼠海馬組織ApoE2的濃度。

ApoE4水平的檢測：采用ELISA雙抗體夾心法，用小鼠ApoE4試劑盒(MM-0676M1酶免公司),具體操作步驟按照說明書操作，設置樣品孔和標本孔。最后在450 mm處檢測吸光度，根據樣品稀釋濃度計算小鼠海馬組織的ApoE4的濃度。

CYP46水平的檢測:采用ELISA雙抗體夾心法，用小鼠CYP46試劑盒(MM-0667M1，酶免公司),具體操作步驟按照說明書操作，設置樣品孔和標本孔。最后在450 mm處檢測吸光度，根據樣品稀釋濃度計算小鼠海馬組織的CYP46的濃度。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 電針對4月齡APP/PS1小鼠海馬Aβ1～42水平的影響

見圖1和表1。模型組海馬Aβ1～42的含量顯著高于正常對照組(P<0.01)；電針組Aβ1～42的含量顯著低于模型組(P<0.01)。

圖1 電針對4月齡APP/PS1小鼠海馬Aβ1～42水平的影響只小鼠/組)注：與模型組比較,▲▲P<0.01;與正常對照組比較,**P<0.01

組別nCYP46Aβ1～42正常對照組(C)6623.63±107.0611.93±5.02模型組(M)6567.65±130.7974.62±12.01▲▲電針組(EA)6583.11±145.5141.12±2.76**

注：與正常對照組比較，▲▲P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

2.2 電針對4月齡APP/PS1小鼠海馬ApoE2水平的影響

見圖2和表2。模型組海馬ApoE2的含量與正常對照組相比無統計學差異。電針組ApoE2的含量顯著高于模型組(P<0.01)，電針組ApoE2的含量顯著高于正常對照組(P<0.01)。

圖2 電針對4月齡APP/PS1小鼠海馬ApoE2水平的影響只小鼠/組)注：與正常對照組比較，**P<0.01；與電針組比較，▲▲P<0.01

組別nApoE2ApoE4正常對照組(C)6144.37±12.75116.66±33.06模型組(M)6136.26±28.56▲▲94.96±38.19▲▲電針組(EA)6208.16±31.86**161.26±19.01*

注：與電針組比較，▲▲P<0.01；與正常對照組比較，**P<0.01，*P<0.05

2.3 電針對4月齡APP/PS1小鼠海馬ApoE4水平比較

如圖3和表2所示，模型組的ApoE4的含量低于正常對照組，但差異無統計學意義(P>0.05),電針組ApoE4的含量高于模型組的含量(P<0.01),電針組ApoE4的含量高于正常對照組(P<0.05)。

圖3 電針對4月齡APP/PS1小鼠海馬ApoE4水平的比較只小鼠/組)注：與電針組比較，**P<0.01;與正常對照組比較,▲P<0.05

2.4 4月齡APP/PS1小鼠海馬CYP46水平的比較

如圖4和表1所示，3組的CYP46水平，3組對比差異無統計學意義(P>0.05)。

圖4 4月齡APP/PS1小鼠海馬CYP46水平的比較只小鼠/組)

3 討論

Aβ級聯學說認為Aβ的神經毒性以及沉積是AD發病的重要事件，正常情況下，Aβ在腦內的產生和清除存在動態平衡[14]。體外研究表明ApoE可以與Aβ結合，且結合具有型差異性：E2>E3>E4,并且Aβ的沉積量與ApoE成劑量依賴關系，在apoE(-/-)的老年性癡呆小鼠中轉入人的apoE后，腦內 Aβ的沉積量減少，其機制可能是在LRP-1的參與下與ApoE結合的Aβ由于構型的改變，毒性下降，攝取和降解增多[15]。關于ApoE影響Aβ水平的機制， ApoE可以和Aβ結合成可溶性的復合物，從而調節Aβ的代謝、聚集和沉淀[16]，ApoE在Aβ形成與清除過程中充當載體或分子伴侶，ApoE在細胞外與Aβ相互作用，從而導致Aβ的清除[17，18]。本研究結果電針能夠增加APP/PS1小鼠海馬組織內ApoE的水平，ApoE2和ApoE4相比都有提高，提高的含量沒有體現分型差異；電針降低Aβ水平，提示電針能夠促進ApoE和Aβ結合成可溶性復合物，從而促進Aβ的清除，減少其沉積。模型組ApoE和CYP46的水平與正常對照組相比沒有統計學差異，提示該模型在進行基因雙轉后，暫時沒有發現對4月齡小鼠ApoE和腦內膽固醇的水平造成影響。

近年研究提示腦內膽固醇的水平與Aβ水平密切相關，神經元膜膽固醇水平的改變和膽固醇在亞細胞結構中的分布被認為與Aβ的形成、異常聚集、神經毒性以及降解有著潛在聯系[19-20]。最近的研究表明AD病人腦內出現膽固醇代謝紊亂，ApoE在脂蛋白顆粒和膽固醇代謝中起重要的作用，由于完美的血腦屏障阻止外周的膽固醇進入腦內，絕大多數腦內的膽固醇都是自身合成的[21]。大多數突觸生成需要的膽固醇來自星形膠質細胞的大量合成，并且由含ApoE的脂蛋白運輸到神經元，由ApoE介導的膽固醇回收功能受損會導致膽固醇在溶酶體的積累和降低質膜膽固醇的回收效率[22]。有研究表明[23]腦內膽固醇水平的增加提高了β和γ分泌酶的活性，促進Aβ的生成以及沉積。腦組織中如果膽固醇代謝出現紊亂，膽固醇會在組織內堆積，從而刺激β-分泌酶、γ-分泌酶活性以至于β-淀粉樣蛋白的大量產生[24]。本研究結果并未體現電針對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬組織內膽固醇含量及代謝水平的影響，造成的原因可能是樣本量小或者電針不能影響海馬膽固醇水平。

ApoE在神經元修復和再生中起重要作用，于是越來越多的專家學者開始致力于研究ApoE蛋白亞型與ApoE受體的聯合作用對淀粉樣前體蛋白分解過程產生的影響[25]。有實驗證明ApoE與APP的代謝有直接關系，培養基加入ApoE后，可引起Aβ分泌的減少[15]。ApoE通過競爭性結合Aβ，與LRP1、其他受體/轉運體的結合，阻斷Aβ的細胞攝取和轉運的過程，從而降低腦內Aβ的水平[26]。近年針灸治療老年癡呆的臨床報告均顯示出了針灸療法對于防治AD的肯定療效，本課題組研究阿爾茨海默病在以腎精虧虛為本，瘀血、毒邪、痰濁三濁互結為標的病理機制指導下，以“益腎、醒腦、祛濁”為治療準則，運用電針治療，取“百會”“涌泉”穴，兩穴合用，既可補腎益髓，又可行氣活血、化瘀祛濁通絡、開竅醒神[27]。

本課題組自2012年起對電針干預APP/PS1雙轉基因小鼠，APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠是目前國際公認的影響Aβ水平的有效評價動物模型[28]，現階段該動物模型廣泛運用于AD的治療藥物以及治療方式的科學研究[29]。對改善小鼠學習記憶能力的淀粉樣蛋白途徑作用機制進行研究，初步肯定電針“百會、涌泉”穴對APP/PS1雙轉基因小鼠腦組織內Aβ整體水平的降低具有調節趨勢。本次研究選用4月齡APP/PS1雙轉基因小鼠，進行為期2周的電針治療，電針干預的介入時間選擇未出現老年斑的AD早期，在小鼠4月齡時，早期電針干預可以降低海馬內Aβ1～42的水平，同時提高了海馬內ApoE2和ApoE4的水平，但CYP46的水平沒有發生改變。綜上所述在AD早期，Aβ生成增多，這時通過電針針刺“百會”“涌泉”使得小鼠海馬ApoE的水平升高。ApoE的水平升高可以增加腦內Aβ的清除，從而降低Aβ的含量。所以提高腦內ApoE的水平，調節ApoE受體和轉運體的水平和活性可能成為AD的防治手段。故ApoE可能為電針防治AD的一個靶點，本實驗為針刺“益腎祛濁法”防治AD提供科學實驗依據。

本研究下一步將擴大實驗樣本量，繼續探討不同的ApoE分型在AD中發揮的不同作用以及電針是否會對海馬膽固醇代謝水平產生影響，并且測定CYP46的同時直接測定海馬的總膽固醇水平。

4 結論

電針可降低4月齡APP/PS1雙轉基因小鼠海馬Aβ水平，其機制可能是通過影響腦內ApoE的水平從而實現的，但電針是否影響了海馬內的膽固醇代謝水平，還需進一步的實驗研究。

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EffectofElectro-acupunctureStimulationofGV20andKI1onExpressoinsofHippocampalAβandApoEinAPP/PS1TransgenicMice

ZHANG Xue-ting, ZHANG Lei, ZHOU Ying-yi, PEI Ya-ni, XUE Wei-guo△

(BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective：To observe the effect of electro-acupuncture on the levels of apolipoprotein E(ApoE) and Amyloid-β(Aβ) of hippocampus in 4-month-old APP/PS1 transgenic mice, and to explore the mechanism of acupuncture in the prevention of AD.Methods12 APP/PS1 transgenic mice (male, 4-month-old) were randomly divided into the model group and the electro-acupuncture group.Six C57BL/6 mice with same age were used as the blank control. In the electro-acupuncture group, the intervention was needling points of GV20 and KI1; whereas, in the control group, the mice were given equivalent constraint; the intervention was 15min per day for two weeks. The levels of Aβ1-42, ApoE2, ApoE4 and cholesterol-24S-hydroxylase(CYP46) in hippocampus were measured with ELASA method.ResultsIn terms of the content of Aβ1-42, it was higher in the model group than that in the blank control group(P<0.01); it was lower in the electro-acupuncture group than that in the model group(P<0.01). In terms of the the content of ApoE2 and ApoE4, there was no significant difference between the model group and the blank control group; they were highly increased in the electro-acupuncture group compared to those in the model group(P<0.05). In terms of the content of CYP46, it was higher both in the electro-acupuncture group and in the model group, compared to the blank control group; but the difference was not statistically significant.ConclusionElectro-acupuncture can reduce the level of hippocampal Aβ1-42 in APP/PS1 mice, and its mechanism may be associated with affecting the level of hippocampal ApoE.

Electro-acupuncture; Alzheimer’s diseases; Amyloid-β; ApoE; Cholesterol metabolism

R246.6

A

1005-0779(2017)12-0073-04

國家自然科學基金項目,編號：81273826;北京中醫藥大學研究生自主課題，編號：2017-JYB-XS-O49。

張學婷(1989-)，女，2015級針灸推拿學專業碩士研究生。

△通訊作者：薛衛國(1968-)，男，教授，主任醫師，博士研究生導師，主要從事阿爾茨海默病機制研究。

2017-08-03