MTHFRC677T基因多態性及血漿同型半胱氨酸與高血壓合并缺血性腦卒中的相關性研究

劉 宇,隋小芳*,王鳳玲,黃佳濱,范巧菊,董天崴,蘇亞楠,費秀斌,楊 澤

(1.佳木斯大學附屬第一醫院 老年病科，黑龍江 佳木斯154002;2.佳木斯大學附屬第一醫院 心內科;3.佳木斯大學附屬第一醫院 科研科;4.北京醫院老年醫學研究所)

MTHFRC677T基因多態性及血漿同型半胱氨酸與高血壓合并缺血性腦卒中的相關性研究

劉 宇1,隋小芳1*,王鳳玲1,黃佳濱1,范巧菊1,董天崴2,蘇亞楠3,費秀斌1,楊 澤4

(1.佳木斯大學附屬第一醫院 老年病科，黑龍江 佳木斯154002;2.佳木斯大學附屬第一醫院 心內科;3.佳木斯大學附屬第一醫院 科研科;4.北京醫院老年醫學研究所)

目的探討亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因多態性的基因型和等位基因頻率及血漿同型半胱氨酸與高血壓合并缺血性腦卒中的相關性。方法首先采用病例-對照研究，隨機選取425例研究對象分為對照組(n=104)、高血壓組(n=116)、缺血性腦卒中組(n=110)、高血壓合并缺血性腦卒中組(n=95)。其次用基因組DNA試劑盒提取DNA，通過聚合酶鏈反應-高分辨率溶解曲線(PCR-HRM)方法進行基因分型，最后通過統計學方法分析基因型在不同組間的分布情況，并探索影響血漿同型半胱氨酸(Hcy)的因素。結果各實驗組C/T、T/T基因型均高于對照組(54.31%-55.45% vs.46.15%)、(27.59%-30% vs.20.19%),差異具有統計學意義(prange=0.001-0.0082)，高血壓合并缺血性腦卒中組分別與高血壓組以及缺血性腦卒中組比較，CT、TT基因型分布無差別(Prange=0.7-0.8)，年齡因素在和疾病的共同影響下對Hcy的影響并不顯著(P=0.88)。結論MTHFRC677T基因型C/T或T/T會增加患高血壓病、缺血性腦卒中以及高血壓合并缺血性腦卒中的風險，基因型C/T或T/T比增齡對Hcy增高的影響更顯著。

高血壓合并缺血性腦卒中；易感基因；亞甲基四氫葉酸還原酶；血漿同型半胱氨酸

(ChinJLabDiagn,2017,21:2056)

高血壓(hypertension，HTN)是一種常見的慢性非傳染性疾病，是多基因、多因素引起的高度異質性疾病[1-3]。血壓(blood pressure，BP)升高在2001年造成全球約760萬例高血壓患者的死亡，占所有死亡者的13.5%[4-8]。據統計，2008年有9.78億成年人(占世界成年人口的28%)的高血壓患者未得到控制[8]。在北美成年人群中，高血壓的發病率大約為34%[8]，來自美國和歐洲的流行病學數據表明，只有38.8%的歐洲高血壓患者和50.1%的美國人達到了治療目標[9,10]，到2025年全球高血壓患病率將超過15億[8]。HTN始終被認為是心血管疾病和腎臟疾病的主要危險因素[7,8]。

缺血性腦卒中(Ischemic stroke，IS)是世界上導致死亡或殘疾的主要原因，是中國人群的主要死亡原因，也是世界人群第二大死因[11]。世界衛生組織(WHO)報告，全世界每年有1500萬人患有卒中，其中500多萬人死亡，另有500萬人因殘疾而死亡[11]。MTHFR是Hcy代謝中的重要酶[11]，而MTHFR C677T多態性(rs1801133)導致丙氨酸被纈氨酸(A222V)取代，這種錯義突變導致酶的活性降低和Hcy水平升高。Hcy的升高不僅與高血壓有關，而且也會增加卒中的風險[12]。近年來，已經報道了許多有關基因多態性與高血壓或卒中相關的研究[13]，但缺乏全面和綜合的研究來探討MTHFR基因多態性與高血壓合并缺血性腦卒中的關系，此外并沒有深入的探索影響Hcy水平的因素。因此，我們旨在探討MTHFR基因多態性的基因型和等位基因頻率與高血壓合并缺血性腦卒中的相關性，并進一步探索影響Hcy的因素。

1 材料與方法

1.1研究對象

本項病例對照研究共納入425例受試者，為2016年10月至2017年3月在佳木斯大學附屬第一醫院就診的患者，分別包括健康對照組104例，高血壓病組116例、缺血性腦卒中組110例和高血壓合并缺血性腦卒中組95例。健康對照組的納入標準為佳木斯大學附屬第一醫院經相關檢查除外高血壓、卒中及其它慢性疾病的健康人群，同時滿足無相關疾病的家族史。其中男性53例、女性51例，平均年齡55.65±11.39歲。高血壓病組納入標準符合2014年高血壓防治指南，缺血性腦卒中納入標準參照2014年《中國腦血管病防治指南》中華醫學會神經科學分會制定的《各類腦血管疾病診斷要點》中有關腦梗死診斷標準為依據，高血壓合并腦卒中納入標準同時滿足高血壓和腦卒中的納入標準。以上研究對象是我國佳木斯地區無血緣關系的漢族人，本項研究已通過佳木斯大學附屬第一醫院倫理委員會批準并取得受試對象的知情同意書。

1.2主要實驗儀器和試劑

基因組 DNA 提取試劑盒、限制性內切酶 MIu I、聚合酶鏈反應引物(北京擎科生物有限公司)、LC-green PLUS 飽和熒光染料、HRM Light Scanner TMHR-I 96 儀 (美國 Idaho 公司)、Nanodrop ND-1000 分光光度計(美國 Thermo 公司)、PCR 擴增儀 c-1000。

1.3樣本的采集和DNA的制備

記錄所有受試者的性別、年齡等，清晨空腹后測血漿同型半胱氨酸、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、空腹血糖、尿酸及肌酐，天門冬氨酸氨基轉移酶，丙氨酸氨基轉移酶。留取5mlEDTA抗凝靜脈血用DNA提取試劑盒提取DNA，質控后將所有樣本的DNA 濃度用ddH2O標化至90-120 ng/μl 之間，4 ℃保存備用。

1.4MTHFR的HRM基因分型

1.4.1設計引物 使用NCBI數據庫下載MTHFRC677T SNP所在的DNA序列信息，結合使用Primer Premier5.0和Oligo6.0進行引物設計，上游引物：GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG；下游引物：CAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGA。送由北京擎科生物有限公司合成后溶解待用。

1.4.2PCR反應 擴增條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性20 s，64.1 ℃復性20 s，72 ℃延伸4 s，再重復第2-4步45個循環；最后再72 ℃延伸1 min，95 ℃變性1 min，復性1 min，重復第7-9步2個循環。最后2個循環是進行HRM分析之前的變性復性處理，使異源雙鏈形成。

1.4.3PCR產物的HRM分析 將PCR產物移入經Light Scanner儀專用96孔掃面班中，8 000 rpm離心5 min后放入Light Scanner儀中進行高溫信號采集。用Light ScannerCall IT軟件對采集后的曲線進行數據分析。

1.5統計學處理

使用SPSS 19.0軟件進行統計學處理，用Hardy-Weinberg平衡檢驗驗證樣本的群體代表性，P>0.05為符合HWE。研究樣本均值的組間比較使用成組t檢驗，分類變量用頻數代表，不同基因型之間比較采用χ2檢驗，通過多元線性回歸分析影響Hcy的因素。

2 結果

2.1對照組、高血壓組、缺血性腦卒中組以及高血壓合并缺血性腦卒中組在性別比例、年齡組成方面無差異，具有可比性(P>0.0083)(見表1)。與對照組比較，高血壓組、缺血性腦卒中組和高血壓合并缺血性腦卒中組的Hcy、TG、TC、LDL、FBG、ALT、AST、CR、SBP、DBP均高于對照組，而HDL實驗組低于對照組， CR、SBP、DBP在高血壓組中高于對照組，差異具有統計學意義。TG、FBG在腦卒中組較對照組中高，差異有統計學意義。其他臨床指標無顯著性差異(P>0.05/6≈0.0083)。

表1 受試對象一般臨床基本指標在對照組和病例組(高血壓組、缺血性腦卒中組和高血壓合并缺血性腦卒中組)間的比較

注：M：男性，F：女性， Hcy：血漿同型半胱氨酸，TG：甘油三酯，TC：總膽固醇，LDL：低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇，FBG：空腹血糖，UA：尿酸， CR：肌酐，ALT：丙氨酸氨基轉移酶， AST：天門冬氨酸氨基轉移酶，SBP：收縮壓，DBP：舒張壓，PP：脈壓差。*表示對照組和病例組之間的比較，差異具有統計學意義，P<0.0083有統計學差異。

2.2DNA試劑盒提取人全血基因組DNA經HRM分型后的基因型結果

MTHFRC677T基因多態性經PCR-HRM基因分型方法得到三種基因型見圖1，分別是：解鏈溫度最低的T/T純合子，解鏈溫度最高的C/C純合子以及解鏈溫度居中的C/T雜合子。

2.3MTHFRC677TSNP位點哈迪溫伯格平衡檢驗

將本研究中SNP分別在對照組、高血壓組、缺血性腦卒中組和高血壓合并缺血性腦卒中組進行了哈迪溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium HWE)檢驗(表2)，發現所有SNP位點的基因型頻率均符合HWE(P>0.05)，說明入選的研究人群具有群體代表性。

表2 MTHFRC677T基因多態性的哈迪溫伯格平衡分析

圖1 MTHFRC677T基因多態性經PCR-HRM基因分型的三種基因型及解鏈溫度

2.4MTHFRC677T基因型和等位基因頻率在各組間的分布比較

在顯性模型中，不同組間MTHFRC677T基因多態性的基因型和等位基因頻率分布見表3。和對照組相比，高血壓組中CC基因型頻率低于對照組(18.10% vs.33.65%)，而CT、TT基因型均高于對照組(54.31% vs.46.15%,27.59% vs.20.19%),差異具有統計學意義(P=0.0082)，等位基因T頻率高于對照組(54.74% VS.43.27)。缺血性腦卒中組和對照組比較，CT、TT基因型均較高(55.45% vs.46.15%,30% vs.20.19%)，差異顯著(P=0.001),T等位基因頻率顯著高于對照組(57.72% vs.43.27%,P=0.003)。在高血壓合并缺血性腦卒中組，CT、TT基因型比對照組高(54.74% vs.46.15%,29.47% vs.20.19%),P=0.004,T等位基因在高血壓合并缺血性腦卒中組56.84%高于對照組43.27%，差異顯著(P=0.007)。其他組間比較差異無統計學意義(Prange=0.46-0.8)。

表3 顯性模型中不同組中MTHFRC677T基因多態性的基因型和等位基因頻率分布

注：4個組間指標的兩兩比較，采用Bonferroni校正法，校正后的檢驗水準為α‘=0.05/6=0.0083。

2.5以Y=b0Xb1為模型，建立Hcy與年齡之間的冪函數關系，如圖2所示，隨著年齡的增長，Hcy表現出逐漸增高的趨勢。

2.6以Hcy為應變量，多元線性回歸的結果如表4所示，探究年齡、疾病以及基因型和Hcy之間的關系。在疾病和基因型等因素的作用下，增齡對Hcy的影響并不顯著。

3 討論

MTHFRC677T基因多態性與高血壓、缺血性腦卒中易感性有關，基因型C/T或T/T會增加患高血壓以及缺血性腦卒中的風險。眾所周知，高血壓是造成心血管疾病(CVD)和全球死亡率的主要危險因素，而降低血壓的因素被證明可以降低心血管疾病的風險[14,15]。來自全基因組關聯研究(genome-wide association study，GWAS)和流行病學研究的證據提出編碼高血壓中葉酸代謝酶亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)的基因，即MTHFR中常見的677C/T多態性不僅與高血壓風險增加有關，而且會導致CVD的高風險，尤其是腦卒中[15]。來自流行病學研究的證據表明，常見的MTHFR 677C /T多態性使CVD的風險總體上升到40%[14]。此外，不同地理區域之間的研究顯示與該遺傳變量相關的CVD風險程度差異很大;亞洲和中東人群早期的薈萃分析探討了這種多態性與心血管疾病的關系，顯示北美人群的遺傳風險并不顯著，而MTHFR 677TT基因型則顯著增加世界其他地方心血管疾病的風險[14]。隨后的Meta分析研究了卒中的風險，并表現出較強的相關性[15]。一項關于卒中風險薈萃分析提供了近60,000例卒中事件的數據，其中包括20885例卒中事件，其總體風險增加了37%[13]。

圖2 Hcy與年齡之間的冪函數關系

項目BSEtP95%CI常數項4．631．742．670．0081．22?8．04C/T4．780．746．472．73×10-103．33?6．23T/T13．20．8415．753．78×10-4411．53?14．82高血壓組4．340．805．439．68×10-82．77?5．91缺血性腦卒中組3．000．823．682．63×10-41．4?4．6高血壓合并缺血性腦卒中組7．650．868．931．41×10-175．96?9．33年齡0．0040．020．160．880．04?0．05

注：以Hcy為連續性變量，MTHFRC/T、T/T、疾病、年齡和Hcy的多元線性回歸分析。

此外，本研究結果表明Hcy水平和疾病存在顯著相關性，而年齡對Hcy的影響不顯著。我們通過建立Hcy與年齡之間的冪函數關系的結果顯示，隨著年齡的增長，Hcy表現出逐漸增高的趨勢。但通過多元線性回歸分析，年齡的因素在和疾病的共同結果下表現的并不顯著(P=0.88)。導致血漿Hcy增高的主要因素為疾病，年齡并不是主要的因素。在健康的人群中，也會表現出隨著年齡的增長Hcy升高的趨勢，增齡僅僅只是一小部分因素。隨著年齡的增長，高血壓、卒中的發生的風險會增加，而這種變化可能會讓我們誤以為是Hcy水平隨著年齡增長的原因，但實際疾病的因素和Hcy增高的關系更為密切。而對疾病的探討即對疾病易感基因的研究，導致Hcy增高的主要原因可以定位到增加疾病風險的易感基因上，即與MTHFR677CC基因型相比，C/T和T/T可導致Hcy水平升高。

相關研究[15]報道，與CC基因型相比，純合子TT和雜合子CT基因型分別具有約30%和65%的MTHFR酶活性。血漿Hcy水平可以用來作為診斷H型高血壓的標準，同時也是卒中的獨立危險因素。Hcy輕到中度升高與冠脈疾病、腦血管疾病、頸動脈內膜厚度等有關，與外周動脈疾病及靜脈栓塞等血管疾病相關。最近的一項研究[15]表明，對于高血壓患者，補充VitB2，可以有效降低MTHFR 677TT基因型患者的血壓。對于具有這種基因型的全球亞洲群體，適量的補充VitB2可以預防或延緩高血壓的發展。還需要進一步的研究探討具體劑量以及治療周期，為臨床診療提供更多的方案。

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RelationshipBetweenMTHFRC677TgenePolymorphismsaccompaniedplasmahomocysteineandHypertensionwithIschemicstroke

LIUYu,SUIXiao-fang*,WANGFeng-ling,etal.

(TheFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi154002,China)

ObjectiveThis study was to observe the genotypes and allelea frequencies distribution of MTHFRC677T in hyperyension with Ischemic stroke in a Northeast Han Chinese population.MethodsFirstly,a case-control study was performed in the contral group (n=104),the Hypertension group (n=116),the Ischemic stroke group (n=110) and the hypertension with Ischemic stroke group (n=95) from the First Affiliated Hospital of Jiamusi University between October 2016 and May 2017.Secondly,the genomic DNA was extracted from the peripheral blood by using Genomic DNA kit,and single nucleotide polymorphisms (SNPs) of MTHFRC677T was genotyped by PCR-HRM.Lastly,we applied SPSS19.0 software for data processing and statistical analysis to compare the allele and genotype distribution of SNPbetween the groups and to explore the risk factors of Hcy by using unconditional logistic regression model.ResultsThe genotypes of C/T or T/T in case group were higher than that in control group(54.31%-55.45% vs.46.15%),(27.59%-30% vs.20.19%),and the differences were statistically significant(prange=0.001-0.0082).Compared to Hypertension group,the genotypes distribution of C/T or T/T in hypertension with Ischemic stroke group and Ischemic stroke group were almost the same(Prange=0.7-0.8).The influence of aging on Hcy was not significant under the mixed factors of diseases(P=0.88).ConclusionOur study showed thatsingle polymorphism of CT or TT confer the risk of hypertension with Ischemic stroke.CT or TT can increase the level of Hcy higher than ageing.

Hypertension with Ischemic stroke;Gene polymorphism;MTHFR; Hcy

黑龍江省自然科學基金面上項目(H2015076);黑龍江省教育廳科學技術研究項目(2016-KYYWF-0593)

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2056-06

R544.1

A

劉宇(1992-)，女，老年醫學在讀碩士研究生;隋小芳(1976-)，女，主任醫師，碩士研究生導師，主要從事心血管疾病的臨床與基礎研究。

2017-05-13)