WH706-CLL樹脂對白及多糖脫色工藝的研究△

車向前，常明泉，陳芳，江蓉敬

(1.湖北房縣人民醫院，湖北 房縣 442100；2.湖北醫藥學院附屬太和醫院，湖北 十堰 442000；3.湖北醫藥學院 藥學院,湖北 十堰 442000)

·中藥工業·

WH706-CLL樹脂對白及多糖脫色工藝的研究△

車向前1，常明泉2*，陳芳2，江蓉敬3

(1.湖北房縣人民醫院，湖北 房縣 442100；2.湖北醫藥學院附屬太和醫院，湖北 十堰 442000；3.湖北醫藥學院 藥學院,湖北 十堰 442000)

目的考察WH706-CLL樹脂對白及多糖提取液的脫色效果，建立最佳脫色工藝。方法以提取液濃度、溫度、pH值、流速為觀察因素，以脫色率、多糖保留率作為考察指標。結果在提取液質量濃度為1 mg·mL-1、溫度為50 ℃、pH值為6、流速為1 mL·min-1的條件下，WH706-CLL樹脂對白及多糖的脫色率為93.7%，多糖保留率為87.3%。結論在設定工藝條件下WH706-CLL樹脂對白及多糖的脫色效果良好，適用于白及多糖的脫色。

白及多糖；色素；脫色；WH706-CLL樹脂

白及為蘭科植物白及Bletillastriate(Thumb.)Reichb.F.的干燥塊莖，具有收斂止血、清熱利濕、消腫生肌的功能，常用于咯血、吐血、外傷出血、肺結核出血和治療手足皸裂[1-2]，白及的主要活性成份是一種直鏈多糖，主要由β-1，4-甘露糖和β-1，4-葡萄糖組成[3]，隨著對其藥理研究的深入，揭示白及所含多糖除具有上述作用外，也具有抗胃潰瘍、抗腫瘤作用[4]，還可用于介入放射的診斷治療、腫瘤的栓塞治療[5-6]、藥物制劑的助懸劑、食品添加劑等，市場前景可觀。為了獲得優良的制劑原材料，本實驗研究用WH706-CLL樹脂對白及多糖脫色，以脫除其提取液中的植物色素。

1 儀器與材料

TU1901型雙光束紫外/可見分光光度計(北京普析通儀器有限責任公司)；DHG-9023A型鼓風干燥烘箱(天津市順諾儀器科技有限公司，300×300×270)；FA 2004分析天平(天津天才精密儀器廠，精度：0.000 1 g)；WGA-UNI-10型超純水器(功率：300 W，北京普析通儀器有限責任公司)。

無水葡糖糖對照品(天津市科密歐化學試劑開發中心，批號：200120728)；WH706-CLL樹脂(西安維華科技有限公司，批號：20150712)；層析柱(上海亞榮生化儀器廠，50 cm×3 cm)；蒽酮(上海葉緣生物有限公司，批號：20150222)；SSW型電熱恒溫水浴槽(上海博訊實業有限公司醫療器械廠，700 W)；純化水(湖北醫藥學院附屬太和醫院新鮮制備)；硫酸、鹽酸、氫氧化鈉為分析純。

白及購自湖北神農本草公司，經湖北醫藥學院附屬醫院葉立紅教授鑒定為蘭科植物白及。

2 方法與結果

2.1 白及多糖提取液的制備

取白及飲片，在60 ℃烘箱中干燥，粉碎，過10目篩，稱取粗粉50 g，加入純化水(藥液比1∶15)750 mL，浸泡60 min，煎煮提取45 min，過濾，收集濾液，藥渣加入純化水(1∶10)500 mL，煎煮提取90 min，過濾，集中濾液，藥渣加入純化水(1∶10)500 mL，煎煮提取90 min，過濾，集中濾液，稀釋至2000 mL，混勻，使成含多糖為1 mg·mL-1的提取液。

2.2 WH706-CLL層析柱脫色

取WH706-CLL樹脂，用純化水浸泡24 h，洗至澄清，傾去水后加2～3倍量濃度為2 mol·L-1的HCl，混勻，浸泡2 h，傾去HCl，加純化水洗至中性，加4～5倍量2 mol·L-1NaOH溶液，混勻，浸泡2 h，水洗至中性；取層析柱，將處理好的樹脂濕法裝柱，裝柱量占層析柱內容量的2/3，加蓋墊，用純化水透析至澄清，層析柱(帶恒溫套的層析柱)恒溫至50 ℃，取適宜白及多糖提取液加入層析柱中，以1 mL·min-1的流速收集脫色液，對收集液用α-萘酚濃硫酸法[7]動態監測，顯陽性反應時則可收集脫色液，脫色完畢，以pH為6的稀鹽酸溶液為洗脫液洗脫，收集洗脫液至用α-萘酚濃硫酸法動態監測顯陰性反應時終止，集中脫色液和洗脫液，即得。

2.3 脫色率的測定

分別取脫色前后的樣品溶液，以相應試劑為空白，用紫外分光光度計在450 nm波長處測定吸光度值，取3次測定的平均值，計算脫色率[8]。

脫色率(%)=(A前-A后)/A前×100%

(1)

A前為脫色前提取液的吸光度值，A后為脫色后提取液的吸光度值。

2.4 多糖保留率的測定

2.4.1 溶液的制備 密稱精取在105 ℃干燥至恒重的無水葡糖糖對照品適量，加純化水溶解，制備成質量濃度為0.051 5 mg·mL-1的對照品儲備液，分別精密吸取該對照品溶液、白及多糖脫色液、純化水各2 mL于3支10 mL的刻度試管中，各加入0.2%蒽酮-硫酸試液6 mL，靜置30 min使反應充分，溫度降至室溫，即為對照品溶液、供試品溶液和空白溶液。

2.4.2 方法學的建立

2.4.2.1 標準曲線方程 取質量濃度為0.150 mg·mL-1的對照品溶液0.1、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL于10 mL刻度試管中，各加純化水至2 mL，再分別加入0.2%的蒽酮-硫酸試液6 mL，靜置30 min使反應充分，溫度降至室溫，搖勻，既得每mL含無水葡萄糖對照品1.88、5.63、11.25、16.88、22.50、28.12、33.75 μg的對照品溶液，以2.4.1項下空白溶液校儀器零點，在589 nm波長處測定吸收度，以吸收度值為縱坐標，濃度為橫坐標，得標準曲線方程Y=0.022X-0.002(r=0.999)，無水葡萄糖在1.88～33.75 μg·mL-1線性關系良好。

2.4.2.2 精密度 取2.4.1項下的對照品溶液，在589 nm處測定吸收度5次，結果RSD為0.79%。

2.4.2.3 穩定性 取2.4.1項下的對照品溶液在589 nm處于0.5、1、3、6 h測定吸收度，結果RSD為1.07%。

2.4.2.4 重復性 按2.4.1項下方法平行制備供試品溶液5份，在589 nm波長處分別測定吸收度，結果RSD為1.51%。

2.4.2.5 回收率 精密吸取已測含量的白及多糖脫色液1 mL于10 mL刻度試管中，共9份，每3份1組，分別按供試液含量的120%、100%和80%加入適宜對照品溶液，加純化水至2 mL，各加入0.2%蒽酮-硫酸試液6 mL，靜置30 min使反應充分，溫度降至室溫，搖勻，在589 nm波長處測定吸收度，計算多糖含量，結果平均回收率為96.3%，RSD為1.61%。

2.4.3 測定 取2.4.1項下的供試品溶液在589 nm波長處測定吸收度，計算多糖保留率[7-8]。

多糖保留率(%)=M后/M前×100%

(2)

M前為脫色前提取液中多糖的含量，M后為脫色后提取液中多糖的含量。

2.5 脫色影響因素的考察

分別考察WH706-CLL樹脂在脫色時提取液濃度、溫度、pH值、流速對脫色率、多糖保留率的影響，比較各因素條件下的脫色效果。

2.5.1 濃度的影響 取白及多糖提取液分別配制成含糖量為0.5、1、2、3、4 mg·mL-1的溶液，每份樣品配制100 mL，用稀鹽酸調pH值為6，將樣品溶液在50 ℃水浴中加溫，按2.2項下的方法在50 ℃條件下以1 mL·min-1流速收集脫色液，分別按2.3、2.4項下的方法測定脫色率和多糖保留率。結果，當多糖含量在0.5～1 mg·mL-1時脫色率比在2～4 mg·mL-1時平均高23.2%，多糖保留率差異則不顯著，取1 mg·mL-1為最佳脫色濃度，見表1和圖1。

表1 不同濃度、溫度、pH值、流速對白及多糖提取液脫色率和多糖保留率測定結果

圖1 濃度因素圖

2.5.2 溫度的影響 取白及多糖提取液配制成多含糖為1 mg·mL-1的溶液，共5份，每份樣品配制100 mL，用稀鹽酸調pH值為6，分別將樣品溶液上于設定溫度為30、40、50、60、70 ℃的層析柱(帶恒溫套的層析柱)中恒溫30 min，使樣品溶液達到設定脫色溫度。然后按2.2項下方法以1 mL·min-1流速收集脫色液，分別按2.3、2.4項下的方法測定脫色率和多糖保留率，結果，當脫色液溫度在50～70 ℃時，脫色率趨于穩定，平均比30～40 ℃時高9.3%，多糖保留率在此溫度范圍也趨于穩定，取50 ℃為最佳脫色溫度。見表1和圖2。

圖2 溫度因素圖

2.5.3 pH的影響 取白及多糖提取液配制成含糖為1 mg·mL-1的溶液，共5份，每份樣品配制100 mL，分別用稀鹽酸及氫氧化鈉溶液調pH為4、5、6、7、8，將樣品溶液在50 ℃水浴中加溫，按2.2項下的方法在50 ℃條件下以1 mL·min-1流速收集脫色液，分別按2.3、2.4項下的方法測定脫色率和多糖保留率，結果，當pH在6～8范圍時脫色率平均比pH在4～5時高9.6%，多糖保留率高8.0%，取pH 6為最佳脫色pH值，見表1和圖3。

圖3 pH因素圖

2.5.4 流速的影響 取白及多糖提取液配制成含糖為1 mg·mL-1的溶液，共5份，每份樣品配制100 mL，分別用稀鹽酸調pH值為6，將樣品溶液在50 ℃水浴中加溫，按2.2項下的方法在50 ℃條件下分別以0.5、1、1.5、2、2.5 mL·min-1流速收集脫色液，分別按2.3、2.4項下的方法測定脫色率和多糖保留率，結果，當流速在0.5～1 mL·min-1時脫色率平均比流速處于1.5～2.5 mL·min-1時高19%，多糖保留率變化不明顯，取1 mL·min-1為最佳脫色流速。見表1和圖4。

圖4 流速因素圖

2.6 驗證試驗

根據上述試驗結果，為了驗證WH706-CLL樹脂層析柱對白及多糖脫色工藝的可靠性，取同一批次含白及多糖為1.0 mg·mL-1的提取液，將pH值調至6，在50 ℃條件下以1 mL·min-1的流速按2.2項下的方法收集脫色液，樣品溶液按2.3、2.4項下的方法測定脫色率與多糖保留率，結果脫色率為93.7%，多糖保留率為87.3%。該工藝為WH706-CLL樹脂層析柱用于白及多糖脫色的最佳工藝。

3 討論

白及多糖提取液濃度過高，在相對低的溫度環境下(室溫)粘性增強，脫色過程中會堵塞樹脂孔槽，而提高溫度有利于多糖溶解降低粘性，在實驗中當多糖濃度在1.5 mg·mL-1以上、脫色液收集至1/4時樹脂孔槽堵塞，幾乎沒有脫色液流出，當脫色液濃度在1 mg·mL-1以下、溫度達到40 ℃以上時脫色液流出順暢，脫色率和多糖保留率趨于穩定狀態。脫色液流速對脫色效果有明顯影響，1.5 mL·min-1是脫色效果的分界點，流速高于此時脫色率明顯下降，可能是流速過快色素未被樹脂充分吸附或脫吸附所致。由于植物色素與多糖結合形式不同，對于不同植物中的多糖，其色素和多糖含量也有差別，多糖提取液中如果存在結合性色素則難以脫除，將pH值調至6可能促使植物色素細胞破壁[9-10]，破壞與多糖的結合形態，有利于色素與多糖的分離，從而增強脫色效果。

筆者曾參考文獻[11]實驗，在提取液中加入1.5%～3%的活性炭對白及多糖進行脫色，但脫色率僅為62.5%，多糖保留率為75.7%，脫色后殘留活性炭難以完全去除，活性炭的吸附性是多糖損失率增多的原因；實驗用H2O2對白及多糖脫色[12]，結果脫色率為66.8%，多糖保留率為56.4%，H2O2氧化劑性在氧化色素時也氧化部分多糖，降低其保留率，兩者脫色效果均沒有WH706-CLL樹脂理想，WH706-CLL樹脂對多糖脫色是利用其對色素成分的選擇吸附性和篩分性而達到去除白及多糖中色素的目的，它用于白及多糖的脫色，較之活性炭和H2O2具有顯著的優越性能。WH706-CLL樹脂層析柱適用于白及多糖的脫色，所制定工藝可獲得良好的脫色效果，為白及精加工提供了可借鑒的方法。

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DecolorizationofBletillastriataPolysaccharidebyWH706-CLLResin

CHE Xiangqian1，CHANG Mingquan2*，CHEN Fang2，JIANG Rongjing3

(1.HubeiFangxianPeople’sHospital，Fangxian，Hubei，442100，China；2.TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiMedicalUniversity，442000，China；3.ThepharmacyinstituteofHubeiMedicalUniversity,442000，China)

Objective：To investigate the decoloring effect ofBletillastriatapolysaccharide extract by WH706-CLL resin，and establish the optimum process of decolorization.MethodsWith extract concentration，temperature，pH value，flow rate as observation factors，the decolorization rate and polysaccharide retention rate were examined.ResultsWhen the extract concentration was 1 mg·mL-1，the temperature was 50 ℃，the pH value was 6，and the flow rate was 1 mL·min-1，the decoloring rate of WH706-CLL resin reached 93.7% and the polysaccharide retention rate was 87.3%.ConclusionUnder the conditions of setting process，the WH706-CLL resin has good effect on the decolorization ofB.striatapolysaccharide，and is suitable for the decolorization ofB.striatapolysaccharide.

Bletilla striata polysaccharide；pigment；decolorization；WH706-CLL resin

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.018

太和科研基金資助項目(2013JJXM021)；湖北省科技廳鑒定成果(2014D150024000699)

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常明泉，副主任藥師，研究方向：藥物制劑；E-mail：907622985@qq.com

2016-11-18)