加味獨活寄生合劑促進膝骨關節炎軟骨修復療效及作用機制研究

張永輝++歐梁++鄺高艷++盧敏

摘要：目的 探討加味獨活寄生合劑促進膝骨關節炎（KOA）軟骨細胞增殖的臨床療效及其作用機制。方法 采用隨機數字表法將60例患者隨機分為治療組和對照組各30例。治療組予加味獨活寄生合劑，每次62.5 mL，每日2次，口服；硫酸氨基葡萄糖膠囊，每次1粒，每日3次，口服。對照組予雙醋瑞因膠囊，每次1粒，每日2次，口服；硫酸氨基葡萄糖膠囊，用法用量同治療組。囑患者行股四頭肌舒縮功能鍛煉，注意保暖。連續治療6周。觀察2組治療前后視覺模擬評分法（VAS）評分、西安大略和麥克馬斯特大學骨關節炎指數（WOMAC），檢測患膝關節液白細胞介素-1（IL-1）、一氧化氮（NO）、Wnt5a、β-連環蛋白（β-catenin）、Sox9、膠原蛋白Ⅱ（CollagenⅡ）含量，監測不良反應。結果 與本組治療前比較，2組治療后IL-1、NO、Wnt5a、β-catenin含量明顯降低（P<0.05），Sox9、CollagenⅡ含量明顯升高（P<0.05），VAS評分、WOMAC明顯降低（P<0.05），以上指標2組治療后比較差異無統計學意義（P>0.05）。2組均未見明顯不良反應。結論 加味獨活寄生合劑可降低關節液中炎癥因子水平，抑制Wnt信號通路，通過調節通路中Sox9、CollagenⅡ表達促進KOA軟骨細胞的增殖分化，有效緩解疼痛并改善關節功能。

關鍵詞：加味獨活寄生合劑；膝骨關節炎；軟骨修復

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.007

中圖分類號：R274.94 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）01-0028-05

Clinic Efficacy and Action Mechanism of Promoting Repairment of Knee Osteoarthritiss Cartilage Corpuscle via Modified Duhuo Jisheng Mixture

ZHANG Yong-hui1， OU Liang1， KUANG Gao-yan1， LU Min2

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China；

2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China

Abstract： Objective To discuss the clinic efficacy and its mechanism of action in promoting the cell proliferation of knee osteoarthritiss cartilage corpuscle via modified Duhuo Jisheng Mixture. Methods Totally 60 cases were divided into treatment group and control group by random number table method， with 30 cases in each group. Treatment group was given modified Duhuo Jisheng Mixture， 62.5 mL each time， twice a day， orally， and sulfoglycan sulfate capsules， 1 capsule a day， three times a day， orally； while control group was given diacerein capsules， 1 pill a day， twice a day， orally， and sulfoglycan sulfate capsules， the same as treatment group. Patients were required to do quadriceps muscle systolic and functional exercise， and keep warm. The treatment lasted for 6 weeks. VAS score and WOMAC of the two group were observed before and after treatment. IL-1， NO， Wnt5a， β-catenin， Sox9， Collagen Ⅱ in knee joint fluid were detected. Adverse reactions were monitored. Results Compared with pre-treatment， the contents of IL-1， NO， Wnt5a and β-catenin in two groups were reduces （P<0.05）； while the contents of Sox9 and Collagen Ⅱ were raised （P<0.05）. The VAS scores and WOMAC were reduced in two groups after treatment （P<0.05）. There was no statistical significance between the two group in the above indexes （P>0.05）. There were no obvious adverse reactions in both groups. Conclusion Modified Duhuo Jisheng Mixture can reduceendprint

基金項目：國家自然科學基金（81574004）；湖南省中醫藥管理局課題（201408）

通訊作者：盧敏，E-mail：lumin6563@163.com

inflammatory factors of the joint fluid and inhibit the Wnt signal pathway through regulating the expression of Sox9 and Collagen Ⅱ in the pathway， which can promote the cell proliferation of knee osteoarthritis's cartilage corpuscle and benefit the repairment of cartilage corpuscle in order to relieve pains and improve functions of knee joint.

Keywords： modified Duhuo Jisheng Mixture； knee osteoarthritis； repairment of cartilage corpuscle

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是中老年常見疾患，隨著病情逐漸加重，嚴重影響患者的生活質量。近年來，中醫藥治療KOA取得了良好療效[1-3]，但發病機制尚不明確，缺乏特異性療法。目前基礎研究主要針對中醫藥對KOA中軟骨的細胞因子某一基因層面的干預作用，多局限于補腎活血類或補腎類藥物對KOA的干預作用，尚未系統闡明補腎活血、祛痹止痛中藥治療KOA的作用靶點基因和調控通路。本研究采用自擬加味獨活寄生合劑，治療肝腎虧虛、風寒濕痹型KOA，觀察其療效及對關節液內Wnt信號通路相關蛋白含量的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年10月-2017年3月湖南中醫藥大學第一附屬醫院骨傷科門診患者60例，采用隨機數字表法分為治療組和對照組各30例。治療組男性8例，女性22例，平均年齡（59.2±3.5）歲，平均病程（3.6±1.8）年；對照組男性11例，女性19例；平均年齡（58.1±3.4）歲，平均病程（3.7±1.6）年。本研究無脫落、退出病例。2組患者年齡、性別、病程、視覺模擬評分法（VAS）評分及西安大略和麥克馬斯特大學骨關節炎指數（WOMAC）比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經湖南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會審查批準。

1.2 西醫診斷標準

參照《骨關節炎診治指南（2007年版）》[4]制定診斷標準。①近1個月內反復膝關節疼痛；②X線片示關節間隙變窄，軟骨下骨硬化和/或囊變，關節緣骨贅形成；③關節液透明、黏性，檢查示白細胞<2000個/mL；④年齡≥40歲；⑤晨僵時間≤30 min；⑥活動時感覺有骨摩擦音。具備上述①②或①③⑤⑥或①④⑤⑥即可明確診斷。

X線分級采用骨關節炎Kellgren-Lawrance分級標準[5]。0級：正常；Ⅰ級：輕微骨贅；Ⅱ級：明顯骨贅，關節間隙可疑變窄；Ⅲ級：關節間隙中度變窄，軟骨下骨硬化；Ⅳ級：大量骨贅，關節間隙明顯變窄，嚴重軟骨下骨硬化及明顯畸形。

1.3 中醫辨證標準

參照《中醫病證診斷療效標準》[6]風寒濕痹、肝腎虧虛證進行辨證。主癥：關節酸痛或部分肌肉酸重麻木，遷延日久可致肢體拘急，甚則關節腫大。次癥及舌脈：肢體關節走竄疼痛，痛無定處，有時兼有寒熱，舌苔黃膩、脈??；遍身或局部關節疼痛，痛有定處，得熱稍緩，遇冷則劇，苔白，脈弦緊；關節酸痛、肌膚麻木、痛有定處，陰雨風冷可使其發作，苔白膩，脈濡緩。脈沉細或沉弱無力。具備主癥，參照次癥及舌脈即可辨證。

1.4 納入標準

①性別不限，年齡50～65歲；②符合上述西醫診斷標準及中醫辨證標準者；③X線分級為0～Ⅱ級者；④無嚴重心、肺及肝、腎功能障礙者；⑤近2個月內未服用相關藥物或采用相應治療方案者；⑥患者自愿參加本研究并簽署知情同意書，依從性良好者。

1.5 排除標準

①對本研究藥物過敏者；②X線分級為Ⅲ、Ⅳ級者；③慢性結腸炎、腹瀉、服用改善腸道轉運和/或腸道內容物性質的藥物、服用含有氫氧化鋁和/或氫氧化鎂的藥物者；④創傷性膝關節炎者；⑤有嚴重的心、肺及肝、腎功能障礙者；⑥近期擬懷孕、妊娠期及哺乳期患者。

1.6 治療方法

治療組予加味獨活寄生合劑。藥物組成：獨活6 g，桑寄生18 g，制天南星6 g，黃芩6 g，木瓜12 g，威靈仙12 g，杜仲12 g，牛膝6 g，細辛3 g，秦艽6 g，茯苓12 g，肉桂3 g，防風6 g，川芎6 g，黨參12 g，甘草3 g，當歸12 g，白芍10 g，熟地黃15 g。湖南中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，批號201601。每次62.5 mL，每日2次，口服；硫酸氨基葡萄糖膠囊（浙江海正藥業股份有限公司，批號7108197，0.314 g/粒），每次1粒，每日3次，口服。

對照組予雙醋瑞因膠囊（TRB Pharma S.A.，昆明積大制藥股份有限公司，批號69577，50 mg/粒），每次1粒，每日2次，口服；硫酸氨基葡萄糖膠囊，用法用量同上。

囑患者行股四頭肌舒縮功能鍛煉，注意保暖，勿進行加重膝關節負重的活動。均連續治療6周。

1.7 觀察指標

1.7.1 視覺模擬評分法評分

于治療前后對2組患者行VAS評分[7]。在設定好的評分表上劃一條10 cm的線，橫線的一端為0，表示無痛，另一端為10，表示劇痛，患者根據疼痛感覺進行評分。endprint

1.7.2 西安大略和麥克馬斯特大學骨關節炎指數

參考文獻[8]于治療前后評價WOMAC，包括疼痛、僵硬和關節功能3個部分，共24個項目（包括疼痛5個、僵硬2個、關節功能17個）。WOMAC越高，表示關節炎越嚴重。<80分為輕度，80～120分為中度，>120分為重度。

1.7.3 患膝關節液相關指標

2組于治療前后行關節腔穿刺抽取關節液?；颊哐雠P位，膝下墊枕，取髕骨外上方入路，定位準確后碘伏消毒，抽取關節液1 mL，置于無菌管。ELISA檢測IL-1、NO、Wnt5a、β-catenin、Sox9、CollagenⅡ含量，嚴格按照試劑盒（DG biotech公司，批號分別為E-EL-H0149c、A013-2、E-EL-H1038c、E-EL-H0666c、E-EL-H1349c、E-EL-H0787c）說明進行操作。

1.7.4 不良反應

觀察2組治療期間有無腹瀉、腹脹等不良反應并記錄。

1.8 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料以

—x±s表示，組間比較采用t檢驗及非參數檢驗；計數資料組間比較采用卡方檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 視覺模擬評分法評分及西安大略和麥克馬斯特大學骨關節炎指數比較

與本組治療前比較，2組治療后VAS評分、WOMAC均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）；2組治療后VAS評分、WOMAC比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 2組患膝關節液白細胞介素-1、一氧化氮含量比較

與本組治療前比較，2組患膝關節液IL-1、NO含量明顯降低（P<0.05），2組治療后比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 2組患膝關節液Wnt5a、β-連環蛋白、Sox9、膠原蛋白Ⅱ含量比較

與本組治療前比較，2組治療后患膝關節液Wnt5a、β-catenin含量明顯降低（P<0.05）；2組治療后比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。與本組治療前比較，2組治療后Sox9、CollagenⅡ含量明顯升高（P<0.05）；2組治療后比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

2.4 不良反應

對照組輕度腹瀉2例；治療組輕度腹脹、消化不良1例。2組均無明顯不良反應。

3 討論

KOA屬于中醫“痹證”范疇，稱之為“膝痹”?！端貑枴け哉撈氛J為“風寒濕三氣雜至，合而為痹”，“骨痹不已，復感于邪，內舍于腎”?！稄埵厢t通》認為：“膝者筋之府，膝痛無不因肝腎虧虛者，虛則風寒濕氣襲之?！敝嗅t對該病的病機認識以腎虛邪實為主，治以補虛瀉實。

本研究選用獨活寄生湯加黃芩、木瓜、威靈仙、制南星，制成加味獨活寄生合劑。本方重用善治久痹伏風的獨活，加大桑寄生、杜仲、牛膝用量以補益肝腎；木瓜、威靈仙祛風散寒除濕，二藥配伍剛柔相濟，入腑通絡，善治濕邪久病入絡、病變位置較深者；制南星善入經絡，辛溫散寒燥濕止痛，黃芩取反佐之意，苦寒清熱，制約全方溫燥之性。諸藥合用，共奏補益肝腎、祛風除濕、散寒止痛之功。

IL-1、NO是關節液中炎癥因子，二者可引起關節液和滑膜的免疫炎癥反應，NO是促細胞凋亡的重要因子，IL-1β可依賴內源性NO誘導細胞凋亡，進一步促進關節軟骨的凋亡破壞，在KOA發病中具有重要作用。藥理研究表明，黃芪苷能夠明顯降低血清中IL-1含量，木瓜三萜可抑制RAW264.7細胞分泌IL-1等促炎因子而發揮抗炎作用，威靈仙水提取液可降低兔KOA局部IL-1β、TNF-α，大劑量制天南星可降低兔KOA關節液中IL-1含量，減輕滑膜炎癥[9-12]。鄺高艷等[13]認為，加味獨活寄生合劑可減少關節液中IL-1、IL-6、TNF-α及NO含量，抑制炎癥反應，改善臨床癥狀，這可能是加味獨活寄生合劑治療KOA的作用機制。

雙醋瑞因膠囊是目前臨床治療KOA的陽性藥物，研究表明，應用4～6周即能對膝關節的疼痛和臨床功能的改善取得良好效果，可降低IL-1含量，同時誘導關節軟骨的增殖分化。本研究表明，2組患者IL-1、NO及VAS評分、WOMAC在治療后均明顯降低，表明加味獨活寄生合劑可降低患膝關節液中炎癥因子含量，對KOA有良好的療效。2組比較差異無統計學意義，也在一定程度上表明加味獨活寄生合劑與雙醋瑞因膠囊療效相當。

KOA主要是由于關節軟骨退變磨損產生炎癥介質刺激所致，是力學和生物學因素共同作用的結果。KOA的嚴重程度與軟骨細胞凋亡密切相關?，F代研究表明，Wnt信號通路在骨骼發育、軟骨及骨生物學中起著關鍵作用，通過Wnt信號通路調節能夠促進軟骨細胞的增殖、分化，從而改善KOA的臨床癥狀。彭旭等[14]研究表明，Wnt3a/β-catenin信號阻斷后，CollagenⅡ、aggrecan、Sox9表達明顯恢復，細胞增殖能力和向軟骨誘導分化的能力有所恢復。Gurusinghe S等[15]提取8～12個月健康雄性犬的軟骨細胞進行隨機對照研究發現，Sox9組能恢復軟骨細胞表型的擴張，此外，軟骨細胞經Sox9和CollagenⅡ作用后，其特異性表達明顯增強。卓群豪等[16]研究也表明，Sox9轉染小鼠骨髓間充質干細胞對小鼠膝關節炎病變軟骨修復有促進作用。以上研究表明，Wnt信號通路在調節軟骨細胞增殖方面具有一定作用，而Sox9和CollagenⅡ在軟骨細胞的增殖分化中具有重要作用。

近年來，中醫藥在治療KOA方面取得了較好的療效，但其是否通過Wnt信號通路調節尚不明確。2組在評價臨床效果的同時，重點檢測了Wnt信號通路相關調節蛋白，尤其是Sox9基因蛋白和CollagenⅡ，以觀察加味獨活寄生合劑是否能夠通過調節該信號通路來促進軟骨細胞增殖修復。Wnt信號通路中Wnt5a、β-catenin蛋白較治療前明顯降低，Sox9和CollagenⅡ較治療前明顯增高，差異有統計學意義（P<0.05）。這說明應用加味獨活寄生合劑后Wnt信號通路被抑制，尤其是其關鍵蛋白β-catenin含量降低。有研究指出，β?catenin能與Sox9的C端轉錄激活域結合，從而抑制Sox9啟動目的基因的轉錄[17]，而β-catenin含量降低，相應能夠促使Sox9蛋白分泌增多，利于CollagenⅡ蛋白產生，誘導軟骨細胞的增殖和向軟骨組織分化，從而修復KOA磨損的軟骨組織。endprint

總之，本研究中加味獨活寄生合劑能降低關節液中的炎癥因子含量，且通過調節Wnt信號通路促進KOA軟骨細胞增殖，起到保護關節軟骨的作用。但本研究樣本量較小，觀察時間有限，仍有待進一步深入研究。

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（收稿日期：2017-05-18）

（修回日期：2017-06-05；編輯：季巍?。〆ndprint