鈣離子非依賴電壓依賴分泌模型(CiVDS)的分子機制

經典的囊泡分泌模型是由動作電位激活細胞膜上的電壓門控鈣離子通道，介導鈣離子內流從而引發鈣離子依賴的分泌(CDS)。在大鼠初級感覺神經元(DRG)，研究者發現了一種特殊的囊泡分泌模型—鈣離子非依賴電壓依賴分泌模型(CiVDS)，其分子機制為：電壓門控N型鈣離子通道(Cav2.2)與囊泡分泌所必須的SNARE蛋白偶聯在一起，當發生動作電位時Cav2.2發生構象變化通過SNARE蛋白介導囊泡與質膜融合，從而釋放ATP。實驗結果（一）：CiVDS的分子結構單元包含3個組成部分：電壓感受器(Cav2.2)，囊泡融合必需的SNARE蛋白復合體，以及前兩者之間的連接器（synprint區域，位于Cav2.2第二個domain和第三個domain之間的胞內連接區域）。證據如下：（1）使用細胞膜電容(Cm)記錄等方法，發現特異性Cav2.2阻斷劑芋螺毒素(ω-conotoxin GVIA)能有效抑制CiVDS；（2）CiVDS在3天培養的DRG神經元中會顯著降低，降低的CiVDS能被Cav2.2過表達所恢復；（3）在體水平敲低Cav2.2表達水平能顯著阻斷CiVDS；（4）Cav2.2電壓感受區域對于CiVDS很關鍵，而Cav2.2離子通透區域對于CiVDS作用有限；（5）使用電鏡(EM)和TIRF成像方法，我們觀察到在CiVDS的刺激條件下DRG神經元中小而清亮的囊泡發生了量子化釋放；（6）3天培養的DRG神經元中CiVDS的顯著降低能被SNAP-25的過表達恢復；（7）破傷風毒素和肉毒桿菌毒素破壞SNARE蛋白復合體能顯著阻斷CiVDS；（8）在DRG神經元中，Cav2.2的synprint區域介導Cav2.2和SNAP-25的直接相互作用；（9）全細胞灌注synprint多肽阻斷Cav2.2與SNARE蛋白的相互作用，并能有效抑制CiVDS ；（10）synprint截斷的Cav2.2失去了恢復CiVDS的能力。實驗結果（二）：ATP是CiVDS的囊泡分泌物，證據如下：（1）在CiVDS刺激條件下，通過熒光素酶法能檢測到大量ATP的釋放；（2）EM成像顯示在CiVDS刺激條件下質膜上?？康哪遗輸盗繙p少；（3）TIRF實時熒光成像顯示Spy/NPY-pHluorin標記的囊泡在CiVDS過程中發生了胞吐。與CDS相比，CiVDS在DRG神經元靜息條件下（動作電位發放＜ 4 Hz）占主導地位，提示CiVDS介導的ATP釋放可能在維持本體感覺過程中發揮重要的作用。

（Chai,et al.Neuron, 2017, 96: 1317-1326.陳曉曦 譯 柴祖映 劉風雨 校）