應用東鄉野生稻回交重組自交系群體分析糙米礦質含量QTL

胡標林 黃得潤 肖葉青 何強生 萬勇,* 樊葉楊,*

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應用東鄉野生稻回交重組自交系群體分析糙米礦質含量QTL

胡標林1,2黃得潤1肖葉青2何強生3萬勇2,*樊葉楊1,*

(1中國水稻研究所 國家水稻改良中心/水稻生物學國家重點實驗室, 杭州 310006;2江西農業科學院 水稻研究所/國家水稻改良中心南昌分中心, 南昌 330200;3江西興安種業有限公司, 江西上饒 334300;*通訊聯系人, E-mail: wanyong025@163.com, fanyeyangcnrri@163.com)

強化糧食作物的必需礦物質有利于緩解人們礦質營養缺乏癥。從協青早B//協青早B/東鄉野生稻BC1F5群體中挑選到1個單株A58，與協青早B回交，構建了BC2F4:5群體。采用電感耦合等離子體原子發射光譜儀ICP-AES測定132個BC2F4:5株系的糙米Mg、Ca、Zn、Fe、Mn和Cu含量，應用Windows QTL Cartographer 2.5進行糙米礦質QTL分析。共檢測到17個糙米礦質含量QTL，分別位于第1、4、6、8、9和11等6條染色體上，包括Mg含量1個、Ca含量4個、Zn含量4個、Fe含量2個、Mn含量2個和Cu含量4個。這些QTL解釋表型變異的5.0%~47.2%，其中8個QTL的增效等位基因來自東鄉野生稻。12個QTL聚集于5條染色體上的5個QTL簇，表明不同礦質營養元素涉及到共同遺傳生理機制，可通過分子標記輔助選擇方法將有利等位基因應用于稻米營養品質改良。

東鄉野生稻；糙米；礦質含量；QTL定位

礦質元素在人體內具有很多細胞代謝和生理生化功能，參與人體內的多種酶結構和激活[1]。隨著人們膳食結構和生活方式的變化，礦質營養失衡日漸凸顯，已成為影響人類健康的重要因素。在人類流行的鎂(Mg)、鈣(Ca)、鋅(Zn)、鐵(Fe)、錳(Mn)和銅(Cu)等元素缺乏癥中[2]，以Zn和Fe缺乏最為普遍[3]。由于礦質元素不能在體內合成，過去主要依靠保健品和藥物補充等方法補充人體缺乏礦質元素以緩解礦質元素缺乏癥[4]。然而這些傳統方法覆蓋面小、費用高，由此主食被認為是一種經濟有效的礦質元素補充途徑。因此，通過生物強化方法提高糧食作物可食用部位中的礦質含量日益受到研究者們的關注。

水稻作為超過50%全球人群賴以生存的主要糧食之一，是礦質元素生物強化的重要對象[5]。研究表明不同基因型水稻的稻米礦質含量存在廣泛的遺傳變異，且遺傳成分在決定稻米礦質含量中起主要作用[6]，這為篩選和選育富含礦質元素的水稻品種提供了可能性。

水稻傳統育種方法主要通過表型間接對基因型進行選擇，需要豐富的育種經驗和較長時間；同時如稻米礦質含量等特殊性狀的選擇受到很多因素限制，選擇效率低下。QTL分析是解析稻米礦質含量等數量性狀的有效方法，廣泛應用于作物數量遺傳研究。小麥[7]、玉米[8]和水稻[9]等禾谷類作物中已有大量籽粒礦質含量QTL的研究報道。就水稻而言，已檢測到稻米Mg、Ca、Zn、Fe、Mn和Cu含量QTL分別有23、24、64、52、41和29個，分布于水稻的12條染色體上，其中Mg含量QTL熱點區域位于第9染色體上，Ca含量QTL熱點區域聚集于第10染色體上，Zn含量QTL熱點區域聚集于第6、7、8、9和10染色體上，Fe含量QTL熱點區域聚集于第1、3和6染色體上，Mn含量QTL熱點區域聚集于第1、3、7、8染色體上，而Cu含量QTL熱點區域聚集于1、2和4染色體上[9-21]。這些稻米礦質含量QTL大多為初定位結果，精細定位的較少，目前僅有Yu等[18]利用珍汕 97/密陽46近等基因系將精細定位至29.9 kb區域，含有3個候選基因。上述QTL研究所使用的定位材料包括窄葉青 8 號/京系 17、Sasanishiki/Habataki、Ce258/IR75862、ZGX1/IR7586、Lemont/特青、春江06/TN1及Bala/Azucena等秈粳交[9-15]、Madhukar/Swarna、PAU201/Palman 579、珍汕97/明輝63及珍汕97/密陽46等秈秈交[16-19]、特青/云南野生稻[20]野栽交和紅香1號/松98-131粳粳交[21]等不同類型的遺傳群體，主要為亞種間組合群體，野栽交種間組合群體較少[20]，說明野生稻稻米礦質含量基因發掘研究還應進一步加強。

由于過去水稻育種目標過分集中于提高產量，忽視其礦質元素含量[22]，在一定程度上導致所育成水稻品種的稻米礦質營養含量較低。研究表明地方品種和野生稻等種質資源的稻米礦質含量高于栽培稻[23,24]，是水稻礦質含量改良育種的重要資源。野生稻為水稻遺傳改良提供了豐富的基因庫[25]，如Garcia-Oliveira等[20]研究表明31個稻米礦質含量QTL中26個(83.9%)增效等位基因來自野生稻，因此，從野生稻中發掘有利等位基因可為栽培稻的稻米礦質含量遺傳改良提供有效途徑。

東鄉野生稻是全球分布最北(28°14' N)的普通野生稻，蘊含豐富的重要農藝性狀有利等位基因[26]，利用這一珍稀水稻資源開展稻米礦質含量QTL研究具有重要意義。本研究利用協青早B和東鄉野生稻雜交衍生的BC2F4:5群體，開展糙米礦質含量QTL分析，旨在鑒定控制礦質含量QTL，并分析東鄉野生稻有利等位基因在遺傳改良上的前景。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

本研究所用BC2F4:5株系材料的構建過程(圖1)如下：以前期研究[26]的協青早B//協青早B/東鄉野生稻BC1F5回交重組自交系群體中的1個單株A58為母本，以協青早B為父本，回交1次并自交1次，獲得415個BC2F2單株，并自交產生415個BC2F2:3株系；利用169個SSR標記檢測由30個BC2F2:3株系組成的3個DNA混池，發現47個SSR標記位點(表1)呈雜合，其余122標記位點均呈純合。利用上述47個SSR標記檢測415個BC2F2:3株系，結合農藝性狀考查，得到4個候選株系；進一步檢測4個候選株系各6個單株，挑選到農藝性狀接近于親本協青早B的5個BC2F3單株，自交收獲種子；種植其自交產生的5個BC2F4分離群體，每個群體種植72個單株，經農藝性狀考查和SSR標記檢測后，挑選到132個BC2F4單株，自交產生132個BC2F4:5株系。

圖1 BC2F4:5材料構建過程

Fig. 1. Procedure for developing the BC2F4:5population.

1.2 SSR標記多態性分析

前期構建的協青早B//協青早B/東鄉野生稻BC1F5群體遺傳圖譜中共包含41個RFLP標記和108個SSR標記[26]，針對41個RFLP標記所處區間，應用Gramene數據庫(http://www.gramene.org)中的110對SSR引物，開展多態性篩選，以便應用SSR標記替代RFLP標記。由于協青早B//協青早B/東鄉野生稻BC1F5群體的原始雜交親本東鄉野生稻單株丟失，故隨機挑選30份BC2F2:3株系DNA等量混合，組成3個DNA混池，結合親本協青早B共計4份DNA模板進行多態性檢測。在協青早B和3個DNA混池間篩選到61個呈多態的SSR標記，結合BC1F5群體遺傳圖譜中108個SSR標記，總共169個SSR標記用于BC2F2:3群體基因型檢測。

1.3 田間試驗

2012年11月-2013年4月，在海南陵水種植415個BC2F2:3株系及親本協青早B，每個株系種植12個單株。株行距16.7 cm′26.7 cm，正常田間管理。移栽后10 d，各株系混取中間10株幼苗葉片，用于DNA提取。 2013年5-10月在浙江杭州種植5個BC2F3單株自交產生的BC2F4群體，每群體種植72個單株。株行距16.7 cm′26.7 cm，正常田間管理。移栽后10 d，每株幼苗取約2 cm葉片，用于DNA提取。2014年5-10月在浙江杭州種植132個BC2F4:5株系及親本協青早B，重復2次。每個重復中各株系種植1行12個單株，株行距16.7 cm′26.7 cm，完全隨機區組設計，正常田間管理。移栽后10 d，選1個重復各株系混取10株幼苗葉片，約2 cm，用于DNA提取。采用簡易法[27]提取所有試驗材料總DNA。

1.4 標記檢測

PCR擴增反應在PCR熱循環儀上進行。PCR反應體系含10 μL溶液，包含5.0 μL 2′預混合溶液(CWBIO，北京康為世紀生物科技有限公司)、3 μL 去RNase酶水、1 μL DNA模板和3.3 ng/μL SSR引物各0.5 μL。PCR擴增條件：94℃下預變性2 min；94℃下變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，共循環29次；最后72℃下延伸2 min。PCR擴增產物檢測視帶型片段大小和清晰度，分別采用2.5%瓊脂糖膠分離后GelRed染色和6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后銀染顯色進行檢測。

基因型鑒定按如下進行：協青早B帶型記為“1”，東鄉野生稻帶型記為“2”，雜合帶型記為“3”，缺失帶型記為“0”。

1.5 糙米米粉制備和礦質含量測定

在2014年浙江杭州試驗點，待稻谷成熟后，2次重復中各株系混收中間5株稻穗，曬干脫粒后，置于常溫下保存3個月。稱取20 g稻谷，用THU-35A型礱谷機(日本佐竹公司)脫殼成糙米，再將糙米用1093型旋風式磨粉機(瑞典FOSS公司)磨制成粉，過0.18 mm孔徑的不銹鋼網篩(80目篩)，得到糙米米粉樣品，裝入塑料密封袋中待測。

準確稱取0.500 g(± 0.002 g)米粉試樣置于25 mL聚丙烯塑料管中，加入8 mL 68%~70%硝酸(HNO3)。將聚丙烯塑料管中混合溶液放入置于通風柜中的DigiBlock ED54型石墨消解儀(LabTech中國公司)在110℃下加熱消化，約2.5 h。溶液加熱直至不再產生棕色氣體且變為清亮無色，溶液剩余體積2 mL左右取出，切不可蒸干。再加入3 mL 30%雙氧水(H2O2)混合搖勻，繼續在110℃下消化0.5 h，溶液剩余體積1 mL左右取出，切不可蒸干。待消化殘留液冷卻至室溫后，用去離子水定容至25 mL，上下搖勻。同時做空白試劑和大米米粉標準物質(GW10010)試驗。

吸取10 mL消化溶液置于15 mL玻璃管中待測，利用去離子水、標準液制作測定標準曲線后，IRIS Intrepid Ⅱ XSP型原子發射光譜儀(Inductively coupled plasma atomic emission spectrometer，ICP-AES)進行測定，并在工作曲線上計算出米粉樣品中的Mg、Ca、Zn、Fe、Mn和Cu等礦質含量。

表1 用于BC2F4:5群體基因型檢測的47對SSR標記

1.6 數據分析

在前期的遺傳圖譜基礎上[26]，將檢測到新的61個SSR標記加密到遺傳圖譜，利用MapMaker 3.0軟件構建含169個SSR標記的遺傳圖譜。以2個重復中各性狀數據的均值為基礎進行數據分析，結合新構建的遺傳圖譜，應用Windows QTL Cartographer 2.5軟件[28]，采用復合區間作圖法(composite interval mapping，CIM)進行QTL分析，以LOD=3.0作為QTL閾值，將LOD值最高處所對應的加性效應、顯性效應和貢獻率記為該QTL的效應。QTL命名遵循McCouch和CGSNL[29]提出的命名法則。

2 結果與分析

2.1 BC2F4:5群體的表型變異

BC2F4:5群體及親本協青早B的糙米6種礦質含量基本統計參數列于表2。除Fe含量外，其余5種糙米礦質含量分布均呈正態分布。6種糙米礦質含量的遺傳變異均較小，其中Mg含量的變異系數最小，為6.54%；而Ca含量的變異系數最大，為12.33%。與親本協青早B相比，群體的Mg、Ca、Zn、Fe、Mn和Cu含量均值分別高9.21%、9.14%、0.70%、2.10%、11.40%和13.00%。

表2 協青早B3/東鄉野生稻BC2F4:5群體糙米礦質含量

表3 協青早B3/東鄉野生稻BC2F4:5群體糙米礦質含量間相關分析

*,**分別表示在0.05和0.01水平上顯著相關。

*,**significant at 0.05 and 0.01 level, respectively.

2.2 糙米礦質含量間相關性分析

由糙米礦質含量間相關性分析(表3)可知，有較強的證據表明Mg、Ca、Zn、Fe和Mn之間顯著性較高，而Cu含量與其余5種糙米礦質含量的相關性較低。具體表現為：除Ca和Zn以及Fe和Mn之間不呈現顯著相關外，Mg、Ca、Zn、Fe和Mn含量兩兩之間均呈極顯著正相關；Cu含量僅與Mg和Zn含量呈顯著正相關，與Ca含量呈顯著負相關。

2.3 糙米礦質含量QTL分析

采用CIM法對6個糙米礦質含量進行QTL分析，以LOD=3.0為QTL閾值，共檢測到17個控制糙米礦質含量QTL(表4，圖2)，分別位于第1、4、6、8、9和11等6條染色體上，LOD介于3.12~18.58。單個QTL解釋糙米礦質含量的表型貢獻率介于5.0%~47.2%，其中表型貢獻率大于10%的QTL有13個，8個QTL增效等位基因來自東鄉野生稻。

表4 協青早B3/東鄉野生稻BC2F4:5群體糙米礦質含量QTL

a加性效應是指東鄉野生稻等位基因取代協青早B等位基因。

aAdditive effect of replacing an Xieqingzao B allele by Dongxiang wild rice allele.

本研究僅檢測到1個控制糙米Mg含量QTL，位于第1染色體上的RM10176－RM10300區間內，表型貢獻率為15.5%，遺傳作用模式為部分顯性，其協青早B增效等位基因可增加糙米Mg含量41.76 mg/kg。

檢測到4個控制糙米Ca含量的主效QTL，分布于第1、4、6和11染色體上，貢獻率介于13.5%~17.2%。其中和的遺傳作用模式均為部分顯性，其增效等位基因分別來自協青早B和東鄉野生稻，加性效應分別為9.00 mg/kg和17.88 mg/kg；表現完全顯性，加性效應和顯性效應分別為10.11 mg/kg和9.66 mg/kg；的遺傳作用模式為超顯性，增效等位基因來自協青早B，顯性效應值為10.56 mg/kg。

共檢測到4個糙米Zn含量QTL，分別位于第4、6和8等3條染色體上，貢獻率介于5.0%~16.1%。其中和的遺傳作用模式均為加性，其增效等位基因分別來自東鄉野生稻和協青早B，加性效應為0.99 mg/kg和0.97 mg/kg；其余和的遺傳作用模式為部分顯性，其增效等位基因均來自協青早B，加性效應分別為0.66 mg/kg和0.92 mg/kg。

檢測到2個控制糙米Fe含量QTL，和，表型貢獻率分別為38.8%和23.1%，其中的遺傳作用模式為部分顯性，其東鄉野生稻等位基因分別增加糙米Fe含量1.31 mg/kg；的遺傳作用模式為超顯性，增效等位基因來自東鄉野生稻，顯性效應值為0.99 mg/kg。

檢測到2個控制糙米Mn含量QTL，分別位于第6和11染色體上，表型貢獻率分別為5.8%和47.2%。其中，的遺傳作用模式為超顯性，增效等位基因來自協青早B，顯性效應值為2.06 mg/kg；的遺傳作用模式為部分顯性，增效等位基因來自協青早B，加性效應值和顯性效應值分別為2.81 mg/kg和1.09 mg/kg。

檢測到4個控制糙米Cu含量QTL，分別位于第6、8和9等3條染色體上，其貢獻率介于9.6%~21.9%。其中、和的遺傳作用模式均為超顯性，前者的增效等位基因來自協青早B，后兩者的增效等位基因來自東鄉野生稻，顯性效應值分別為0.34、0.20和0.18 mg/kg；的遺傳作用模式為顯性，增效等位基因均來自東鄉野生稻，顯性效應值為0.08 mg/kg。

圖2 糙米Mg、Ca、Zn、Fe、Mn及Cu含量QTL的染色體位置

Fig. 2. Chromosomal positions of the QTLs conferring Mg, Ca, Zn, Fe, Mn and Cu contents in brown rice.

3 討論

近年來，隨著人們膳食結構和生活方式的變化，礦質營養缺乏已成為影響人體健康的重要因素。由于稻米的全球消費量大，稻米礦質含量略微增加便可有效緩解人類礦質元素缺乏癥[6]。理解稻米礦質含量遺傳變異和礦質含量等位基因間的差異對稻米礦質含量的遺傳改良非常重要。人們習慣食用稻米部位為精米，盡管其礦質含量低于糙米[30]，但與糙米礦質含量密切相關；其次，高礦質含量稻米可以通直接食用糙米或加工成米制品以提高稻米礦質含量的利用效率。為此，本研究利用野生稻和栽培稻種雜交構建BC2F4:5群體開展糙米礦質含量QTL分析。

3.1 糙米礦質含量間的相關性

稻米礦質含量間的相關性已有較多報道。稻米Mg含量與Ca含量[18, 31, 32]、Zn含量[18,31]、Fe含量[31,33]，Mn含量[18,31-33]及Cu含量[18]呈顯著或極顯著正相關。稻米Ca含量與Zn、Fe含量[18, 31, 33]及Mn含量[18, 31-34]呈極顯著正相關，而與Cu含量[33]呈極顯著負相關。稻米Zn含量與Fe含量[23, 31-33]、Mn含量[18,23]及Cu含量[18, 32, 33]均呈顯著或極顯著正相關。稻米Fe含量與Cu含量[34]及Mn含量[23, 31, 33]均呈顯著或極顯著正相關。稻米Mn含量與Cu含量均呈顯著或極顯著正相關[18,31, 33]。

本研究結果表明，Mg含量與Ca、Zn、Fe及Mn含量呈極顯著正相關，與Cu含量呈顯著正相關；Ca含量與Fe和Mn含量呈極顯著正相關，而與Cu含量呈顯著負相關；Zn含量與Fe和Mn含量呈極顯著正相關，與Cu含量呈顯著正相關。上述結果與前人結果較為一致，尤其是Mg、Zn和Mn含量間均呈顯著或極顯著正相關，表明這些礦質含量間存在穩定的協同效應，將有助于稻米不同礦質元素的聚合改良，應在育種實踐中得到重視。

3.2 糙米礦質含量QTL

本研究共檢測到17個糙米礦質含量QTL，其中8個QTL的有利等位基因來自東鄉野生稻，這些有利的野生稻等位基因成功導入到協青早B背景將促進稻米礦質營養的遺傳改良。

在17個QTL中，有13個QTL與前人報道的稻米礦質含量QTL區間重疊或相近(表3)。其中Mg含量和Fe含量QTL各1個QTL，即與Garcia-Oliveira等[20]報道的糙米Mg含量QTL重疊，位于Anuradha等[19]檢測到的糙米Fe含量QTL區間內。Ca含量和Mn含量QTL各2個，即和分別與糙米含量QTL[20]和糙米及精米Ca含量QTL[18, 35]相近，和分別與糙米Mn含量QTL[9]和精米Mn含量QTL[18]部分重疊。Cu含量QTL有3個，即分別與2個報道中的糙米Cu含量QTL[15, 20]及Yu等[18]報道的精米Cu含量QTL重疊；位于Norton等[15]檢測到的標記區間內；與黃瑩瑩等[21]報道的糙米Cu含量QTL相同。Zn含量QTL有4個，分別為與2個報道中的糙米Zn含量QTL[9, 11]區間一致；與3個研究中的糙米Zn含量[9, 11, 15]和2個研究中的精米Zn含量QTL[14, 18]部分重疊；位于Xu等[13]檢測的精米Zn含量QTL區間內；與糙米Zn含量QTL[10, 16]和Xu等[13]檢測的精米Zn含量QTL重疊。值得注意是，本研究檢測到LOD值最高的礦質含量QTL均在前人相同元素含量QTL定位研究中被檢測到。上述在不同環境和遺傳背景中共同檢測到的控制稻米礦質含量染色體區間，可能是有潛在利用價值的稻米含量QTL。此外，由于本研究利用BC2F4:5分離群體的遺傳背景較為純合(純合率為72.19%)，一定程度上也導致已報道的位于這些純合區域的稻米礦質含量QTL在本研究中未被檢測到。

在QTL定位研究中,相關性狀QTL通常成簇分布于相同或相鄰的染色體區間內，這可能是由基因的多效性和多個基因的緊密連鎖引起的。本研究檢測到的17個糙米礦質含量QTL分別聚集于6條染色體上的5個QTL簇中，這也證實了QTL多效性的存在?？刂?種不同糙米礦質含量QTL分別位于第6和第11染色體上的2個QTL簇中，如控制Ca、Zn和Cu含量QTL位于第6染色體的RM588-RM204區間和控制Ca、Fe和Mn含量QTL第11染色體上的RM206-RM254區間?？刂?個不同稻米礦質含量QTL位于第1、6和8染色體上的3個QTL簇，如控制Ca和Zn含量QTL位于第4染色體上RM273-RM5709區間，且這2個QTL的有利等位基因均來自東鄉野生稻。由上述分析可知，除了第1染色體上的RM10176-RM10300區間和第4染色體上的RM273-RM5709區間的QTL增效等位基因方向一致外，其余3個QTL簇中的QTL增效等位基因方向不同，表明對某些性狀有利的野生稻等位基因可能對另一些性狀的影響不利。在5個QTL簇中，QTL簇均為主效QTL，且其有利等位基因來自東鄉野生稻，將成為進一步精細定位和克隆的候選對象；相應地，從群體中挑選到含該QTL的株系108，其糙米Ca和Zn含量分別為142.80 mg/kg和32.06 mg/kg，該株系可應用于稻米Zn和Ca含量改良育種。由于初定位區間較大，一般難以判斷QTL簇的成因。因此，需將QTL簇中的不同QTL分解到更小的區間內，以探究QTL的一因多效機理以及不同性狀QTL簇的存在形式，可為多性狀的同步改良或標記輔助選擇提供有力的手段，如同時開展稻米中多個礦質元素的聚合改良。

謝辭: 感謝中國水稻研究所莊杰云研究員對本研究的悉心指導！

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QTL Analysis for Mineral Contents in Brown Rice Using a BC2F4:5Population Derived from Dongxiang Wild Rice (Griff.)

HU Biaolin1, 2, HUANGDerun1, XIAO Yeqing2, HE Qiangsheng3, WAN Yong2,*, FAN Yeyang1,*

(1,,,;2,,,;Jiangxi Xingan Seed Industry Co. Ltd, Shangrao 334300, China;,:)

Biofortifying food crops with essential minerals would alleviate mineral deficiencies in humans.One plant A58 was selected from Xieqingzao B// Xieqingzao B /Dongxiang wild rice BC1F5population, and was backcrossed with Xieqingzao B to develop a BC2F4:5population. The contents of Mg, Ca, Zn, Fe, Mn and Cu in brown rice of 132 BC2F4:5lines were measured with an inductively coupled plasma atomic emission spectrometer (ICP-AES). Detection of quantitative trait loci (QTLs) for mineral contents in brown rice was conducted using Windows QTL Cartographer 2.5.A total of 17 QTLs for mineral contents in brown rice were detected on chromosomes 1, 4, 6, 8, 9 and 11, respectively, including one for Mg content, four for Ca content, four for Zn content, two for Fe content, two for Mn content, and four for Cu content. The explained phenotypic variations ranged from 5.0% to 47.2%, and eight QTLs of them had the enhancing alleles derived from.Twelve QTLs were clustered in five chromosomal regions, indicating that common genetic-physiological mechanisms were involved for different mineral nutrients, and the beneficial alleles could be utilized to improve grain nutritional quality by marker-assisted selection.

Dongxiang wild rice; brown rice; mineral content; QTL mapping

10.16819/j.1001-7216.2018.7011

Q343.1+5; S511.03

A

1001-7216(2018)01-0043-08

2017-01-19；

2017-04-02。

國家863計劃資助項目(2014AA10A604)；江西省重點研發計劃重大專項(20161ACF60022)；江西省自然科學基金資助項目(20171ACB21071)；江西省農業科學院創新基金資助項目(20161CBS002)。