QuEChERS凈化－高效液相色譜－串聯質譜法測定蜂蜜中農藥及抗生素的含量

苗瓊晨，聶 晶，吳慧珍，錢鳴蓉，孫彩霞，李祖光＊

（1．浙江工業大學 化學工程學院，杭州310014； 2．浙江省農業科學院 質量標準研究所，杭州310021）

蜂蜜作為人們日漸喜愛的養生產品越來越受歡迎，但由于養蜂過程中，蜂農為了防止蜜蜂患上腐臭病、白血病等細菌性疾病，會使用大量抗生素來防治，這可能會導致蜂蜜抗生素殘留超標而影響蜂蜜質量［1－3］，給食用者帶來不同程度的身體損害［4－6］；蜜蜂在采蜜過程中可能會采集到被農藥污染的蜜源，造成蜂產品中出現農藥殘留。三唑類農藥作為一代新的殺菌劑，廣泛應用于糧食作物、蔬菜和水果中［7］，由于其親脂性的特性，其積聚在各種生物組織以及在生態系統中進行傳輸而會對食物鏈造成污染［8］。目前，針對蜂產品中農藥殘留檢測的主要對象是有機磷殺蟲劑和擬除蟲菊酯類農藥，尚未制定三唑類農藥在蜂產品中的限量標準，因此建立對蜂蜜中抗生素及三唑類農藥殘留的監測對保證蜂蜜產品的安全具有十分重要的現實意義。

QuEChERS方法是一種快速高效的前處理分析方法，QuEChERS方法應用在蜂蜜中農藥及獸藥殘留檢測方面已有文獻［9－15］報道。本工作在傳統QuEChERS方法的凈化步驟上進行了改進，利用帶磁性的凈化吸附劑來除雜，免去離心的步驟，加快了蜂蜜樣品的凈化處理過程，并且磁性凈化劑還可以回收利用，符合綠色環保的要求。本工作對各個影響因素進行了優化，在優化條件下采用高效液相色譜－串聯質譜法對蜂蜜中15種三唑類農藥及15種抗生素（包括2種四環素類，4種大環內酯類和9種喹諾酮類）殘留進行測定，可為蜂產品中30種農藥和抗生素的快速篩選提供科學的分析檢測技術。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Thermo TSQ Quantum型液相色譜－串聯質譜儀，配Survey液相操作系統；AL 204型電子分析天平；KQ－50E型超聲波清洗器。

混合標準溶液：稱取15種三唑類農藥包括聯苯三唑醇、糠菌唑、苯醚甲環唑、氟環唑、腈苯唑、三氟苯唑、氟喹唑、氟硅唑、己唑醇、腈菌唑、多效唑、戊菌唑、戊唑醇、三唑酮和滅菌唑，15種抗生素包括2種四環素類（金霉素、四環素），4種大環內酯類（交沙霉素、羅紅霉素、替米考星和泰樂菌素）和9種喹諾酮類（氧氟沙星、環丙沙星、洛美沙星、達氟沙星、奧比沙星、恩諾沙星、雙氟沙星、沙拉沙星和司帕沙星）等標準品適量，用甲醇溶解，分別配制成100．0mg·L－1的標準儲備溶液，于－4℃避光保存。使用時用甲醇稀釋至5．00mg·L－1，配成混合標準溶液，于－4℃避光保存。

Na2EDTA－Mcllvaine緩沖溶液：將0．1mol·L－1檸檬酸溶液1L與0．2mol·L－1磷酸氫二鈉溶液625mL混合，再用氫氧化鈉溶液調節pH至4．0，稱取乙二胺四乙酸二鈉60．5g放入上述混合溶液中，使其溶解，搖勻。

氯化鈉、乙酸鈉、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉均為分析純；乙腈、甲醇、乙酸乙酯均為色譜級；試驗用水為去離子水。

1．2 儀器工作條件

1）色譜條件 Luna C18色譜柱（150mm×2．00mm，3μm），柱溫30 ℃；進樣量5μL；流量0．2mL·min－1；流動相 A 為0．1%（體積分數，下同）甲酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0．0～0．1min時，B為80%，保持5min；5．0～12．0min時，B由80%降至10%；12．0～18．0min時，B由10%升至80%。

2）質譜條件 電噴霧正離子源（ESI＋），毛細管溫度350℃；噴霧電壓4 000V；鞘氣流量0．7L·h－1；輔助氣 流 量 0．2L·h－1；碰 撞 氣 為氬氣（0．2Pa）；多反應監測（MRM）模式。

30種化合物的其他質譜參數見表1，其中“＊”為定量離子。

表1 質譜參數Tab．1 MS parameters

表1（續）

1．3 試驗方法

稱取蜂蜜樣品1．000 0g于50mL離心管中，加入 pH 4．0 的 Na2EDTA－Mcllvaine緩沖溶液6mL，渦旋30s，再加入乙酸－乙腈（1＋19）混合溶液18mL繼續渦旋30s，之后依次加入氯化鈉2g，無水硫酸鈉4g，快速搖勻，振蕩2min后，以7 000r·min－1轉速離心5min后靜置。取上清液6mL轉移至已加入磁性C18和N－丙基乙二胺（PSA）各20mg的20mL樣品瓶中，振蕩30s后，使用外部磁力將固液兩相進行分離，將液體倒入10mL玻璃管內經氮氣吹干后，用1mL初始流動相0．1%甲酸溶液－乙腈（2＋8）混合液復溶后，過0．22μm膜，按儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2．1 色譜行為

50μg·kg－1的30種農藥及抗生素的色譜圖見圖1。

2．2 鹽析條件的選擇

2．2．1 緩沖溶液及其酸度

蜂蜜中含糖量較高，對樣品前處理造成干擾，因此，為了緩解蜂蜜樣品黏稠狀態，需要加入適當的溶液來稀釋樣品，從而有利于化合物的提?。?6］。試驗選擇較為常用的水溶液和Mcllvaine緩沖溶液來稀釋樣品。結果表明：在Mcllvaine緩沖液稀釋作用下，提取效率明顯提高，同時考慮到提取目標物中含有能和金屬離子產生螯合作用的四環素類抗生素，試驗選擇Na2EDTA－Mcllvaine緩沖溶液為蜂蜜樣品的稀釋溶液。

考慮到目標物大都屬于兩性化合物，試驗還考察了不同 酸 度 （pH 分 別為 3，4，5，6，7，8）的Na2EDTA－Mcllvaine緩沖溶液對提取效率的影響［15］，見圖2。

圖1 15種三唑類藥物（1～15）和15種抗生素（16～30）的色譜圖Fig．1 Chromatograms of 15triazoles（1－15）and 15antibiotics（16－30）

由圖2可知：農藥和抗生素的回收率隨緩沖溶液酸度增大基本呈現先升后降的趨勢，其中三唑類農藥和四環素類抗生素表現較為明顯，各類藥物在Na2EDTA－Mcllvaine緩沖溶液pH為4時均出現了較為理想的回收率。蜂蜜樣品的pH控制在3．2～4．5之間時，加入緩沖鹽可以保持蜂蜜樣品的酸堿穩定性，試驗選擇Na2EDTA－Mcllvaine緩沖溶液的酸度為pH 4．0。

2．2．2 提取劑

圖2 緩沖溶液的酸度對提取回收率的影響Fig．2 Effect of acidity of buffer solution on extraction recovery

在QuEChERS方法對抗生素的提取試驗中發現，乙腈為提取劑時，蛋白質等共提物比較少，且乙腈比丙酮、甲醇更易與水分離［17］；試驗還考察了乙腈、甲醇、丙酮等溶劑對三唑類農藥的提取效率，結果表明乙腈對三唑類農藥的提取效率較高。試驗進一步發現在乙腈溶液中加入5%（體積分數）乙酸溶液，農藥和抗生素的回收率均較高，試驗選擇乙酸－乙腈（1＋19）混合溶液作為提取劑。

2．2．3 鹽析劑和吸水劑

QuEChERS方法常用的鹽析劑有乙酸鈉、氯化鈉，常用的吸水劑有無水硫酸鎂、無水硫酸鈉?？紤]到硫酸鎂中的Mg2＋和四環素類藥物可能會結合生成螯合物，從而影響四環素類藥物的提取，而乙酸鈉水解作用下會影響緩沖體系的酸度，試驗選擇氯化鈉為鹽析劑，無水硫酸鈉為吸水劑。

2．3 凈化條件的選擇

2．3．1 除雜吸附劑

在QuEChERS方法中，較為常用的除雜吸附劑主要有C18和PSA，C18可除去脂類等非極性物質，PSA可除去極性有機酸、脂肪酸、糖類等物質。傳統的凈化過程是加入不帶磁性的C18和PSA來除雜吸附，再離心分離，所需凈化劑量較大，且離心分離需要較長時間。試驗分別考察了無磁性C18和PSA、磁性C18和PSA對試驗過程的影響。結果表明：使用無磁性C18和PSA時，傳統離心步驟以及吸取上清液轉移至少需要10min；磁性吸附劑只需要1min即可完成吸附雜質和傾倒提取液2步，其主要依靠外部磁場來完成，方便快捷。試驗選擇使用磁性C18和PSA來進行除雜吸附。

2．3．2 磁性C18和PSA用量

試驗考察了磁性C18和PSA用量（二者分別加入10，20，30，40，50mg）對各類藥物回收率的影響，其結果見表2。

表2 吸附劑用量對回收率的影響Tab．2 Effect of the amounts of adsorbent on recovery

由表2可知：在磁性C18和PSA加入量分別為20mg時，藥物回收率達到最高；增加磁性C18和PSA的用量，藥物回收率呈下降趨勢，這可能是由于加入的吸附劑量過大，磁性吸附劑對目標物有一定吸附及包裹，使藥物在分離過程中被保留而降低其回收率。試驗選擇磁性C18和PSA的用量分別為20mg。

用過的磁性C18和PSA經丙酮、甲醇清洗后可重復使用，在節省成本方面也具有優勢。試驗將用過一次的磁性C18和PSA依次用丙酮10mL、甲醇10mL浸泡，并超聲洗滌，該過程重復2次，回收后烘干。再次作為除雜吸附劑使用時，20mg磁性C18和20mg磁性PSA除雜效果接近首次使用，當重復利用4次后，需要另外增加10mg新的吸附劑即可達到首次使用的吸附效果。表明磁性C18和PSA重復使用率較高，降低了吸附劑使用成本。

2．4 工作曲線與檢出限

在空白蜂蜜基質樣品溶液中添加混合標準溶液，配制成質量分數分別為0．20，0．50，1．00，2．00，5．00，20．0，50．0，100．0μg·kg－1的混合標準溶液系列，按試驗方法進行測定。以各化合物的質量分數為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標繪制基質工作曲線。30種化合物的線性范圍、線性回歸方程及相關系數見表3。

分別以3倍信噪比和10倍信噪比計算檢出限（3S／N）和測定下限（10S／N），其結果見表3。

表3 線性參數、檢出限和測定下限Tab．3 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2．5 精密度和回收試驗

對空白基質分別添加10．0，20．0，50．0μg·kg－1的混合標準溶液進行加標回收試驗，按照試驗方法對每一個添加水平平行測定5次，計算其加標回收率和測定值的相對標準偏差（RSD），其結果見表4。

表4 精密度和回收試驗結果（n＝5）Tab．4 Results of tests for precision and recovery（n＝5）

表4（續）

由表4可知：30種化合物的回收率在71．1%～116%之間，RSD小于22%。說明方法的精密度和準確度較高。

2．6樣品分析

按試驗方法對12個蜂蜜樣品進行測定，其中7個蜂蜜樣品有檢出，其檢出結果見表5。

表5 樣品分析結果Tab．5 Analytical results of samples μg·kg－1

由表5可知：三唑類農藥中苯醚甲環唑檢出較多，質量分數在9．6～44．0μg·kg－1之間，喹諾酮類和四環素類藥物也有檢出，但質量分數均較低。

本工作建立了同時測定蜂蜜樣品中15種三唑類農藥和15種抗生素藥物的QuEChERS－HPLCMS／MS分析方法，分別對提取劑、凈化方法、吸附劑及其用量等樣品前處理條件進行了優化，將磁性材料用于QuEChERS方法，縮短了測定時間。方法操作簡便快速，凈化效果好，適用蜂蜜中農藥及抗生素的多殘留檢測。

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