菘藍ItSnRK2.1基因的克隆及其序列特性分析

張春蘭 滿麗莉 向殿軍 包烏日娜 劉鵬

（1. 內蒙古民族大學生命科學學院，通遼 028042；2. 內蒙古民族大學農學院，通遼 028042）

干旱、高鹽和低溫是植物頻繁遭受的主要非生物脅迫，在很大程度上限制植物時空分布，造成作物產量降低和品質下降，嚴重時甚至絕收［1-3］。植物在長期進化過程中形成了一系列應答保護機制去忍受或適應各種極端環境條件［3-4］。通過特異的信號傳導通路感知非生物脅迫，植物啟動相關脅迫基因的表達，調節細胞內的各種新陳代謝反應去適應逆境脅迫。其中，蔗糖非發酵相關的蛋白激酶（Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase，SnRK）調控靶蛋白的可逆磷酸化修飾在這一系列防御機制過程中發揮著重要的作用。

SnRK2蛋白激酶成員通過ABA非依賴和ABA依賴的兩種調節途徑參與滲透脅迫信號通路。擬南芥10個SnRK2成員中，有9個（除AtSnRK2.9外）能響應NaCl和甘露醇脅迫，但只有AtSnRK2.2、AtSnRK2.3、AtSnRK2.6、AtSnRK2.7和 AtSnRK2.8五個成員參與ABA應答反應［5］。類似地，水稻10個SnRK2成員均能響應NaCl脅迫，但僅有3個成員（SAPK8、SAPK9 和 SAPK10）能應答 ABA 脅迫［6］?，F在對于SnRK2非依賴ABA調控通路的研究還不太深入，而對ABA依賴信號通路的研究已經取得一定進展。高鹽、干旱等逆境脅迫能導致植物內源激素ABA大量合成，植物細胞膜上的含有START結構域的受體（PYR/PYL/RCAR）能感受ABA含量的變化［7］。細胞內缺少ABA時，PP2C會抑制依賴ABA調控通路中SnRK2蛋白激酶活性；相反，細胞產生ABA時，PP2C的活性則被PYR/PYL/RCAR受體與ABA結合形成的復合體所抑制，SnRK2蛋白激酶得以釋放［7-8］。所以，SnRK2可通過ABA非依賴通路直接作用于相關基因，開啟一系列脅迫響應基因表達；也可通過ABA依賴通路調節下游底物的活性來激活相關脅迫響應基因的表達。SnRK2作用的底物至少有58個，涉及表型遺傳調控、RNA拼接、離子通道、ROS穩定和葉綠體過程等多種生物過程［9］。SnRK2可通過SnRK2-AREB/ABF調控通路引發一系列ABA應答基因的轉錄。ABA應答基因的啟動子上含有多個保守的響應ABA的順式作用元件ABRE，SnRK2蛋白激酶可以磷酸化轉錄因子如ABRE/AREB/bZIP，活性被磷酸化調節的反式因子隨后與ABRE順式作用元件結合，啟動ABA響應基因的表達［10，11］。

菘藍（Isatis tinctoria L.）作為一種重要的中藥資源，其有效成分是它的次生代謝產物靛玉紅。由于非生物脅迫會導致植物體內產生大量的次生代謝產物，所以靛玉紅生成和累積與菘藍忍受或適應非生物脅迫的分子應答機制存在某種相關性。菘藍具有很強的抵御環境脅迫的能力，包含眾多的優良性狀及抗逆基因源。但是，相對于其它十字花科蔬菜，對菘藍抵抗逆境脅迫的研究較少，到目前為止，還未見有對SnRK2蛋白激酶成員的研究與報道。本研究基于同源克隆的方法，從菘藍中分離了一個SnRK2成員，對其基因結構、理化性質、系統發生等進行了生物信息學分析。同時，利用實時定量PCR分析了菘藍SnRK2基因的組織表達模式和脅迫表達模式。本研究期望對菘藍SnRK2基因的抗逆功能研究提供理論依據，為揭示菘藍抗逆機制以及有效成分的積累奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的菘藍種子購于邁格威農業開發有限公司。將菘藍種子用70%乙醇處理殺菌，用水漂洗幾次后播種到土壤中，培養溫度為26℃，光照強度2 000 Lx，光照16 h/d。選取30 d苗齡的菘藍種子幼苗進行高鹽脅迫處理（200 mmol/L NaCl）、干旱脅迫處理（10% PEG6000）和ABA脅迫處理（100 μmol/L ABA），以無離子水處理的菘藍幼苗作為對照。收集對照幼苗的全株用于基因克隆。分別收集對照幼苗的根、莖和葉組織用作基因組織表達模式分析。分別收取脅迫處理前（0 h）和脅迫處理后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和 72 h的菘藍葉片用于基因脅迫表達模式分析。樣品經液氮速凍后，置于-70℃冰箱保存，用于總RNA制備。

1.2 方法

1.2.1 ItSnRK2.1基因克隆 以擬南芥AtSnRK2.1 mRNA序列（NM _120946.5）作為檢索序列，進行Nucleotide BLAST，下載以下7條代表性序列：At-SnRK2.1（NM_120946.5）、AlSRK2G（XM_0028713-03.2）、CsSRK2G（XM_010424744.2）、BrSRK2G（XM_009132845.2）、BoSRK2G（XM_013773862.1）、

SRK2G（XM_018591452.1） 和 BnSRK2G（XM_013-824876.1），多序列比對后，在保守區域設計一對簡并引物（5'-GGRTYTCACCAKCTCNTCTTCTTAT-3' 和 5'-TAGTTTACMGCBTWTGGCTTTGACA-3'）?？俁NA提取按照TaKaRa公司MiniBEST Plant RNA Extraction Kit說明書進行。第一鏈 cDNA合成：在冰浴的RNase Free離心管中加入3 μg總RNA，1 μL Random 6 mers（50 μmol/L），1 μL dNTP Mixture（10 mmol/L），加 RNase free ddH2O 至 10 μL，65℃保溫5 min，迅速冰浴5 min，短暫離心后，向管中加入 4 μL 5×PrimeScript Buffer，0.5 μL RNase Inhibitor（40 U/μL），1 μL PrimeScript RTase（200 U/μL）， 加RNase free ddH2O至20 μL，混勻后，30℃保溫10 min，42℃ 30 min，95℃保溫5 min后迅速至冰上冷卻。以第一鏈cDNA為模板進行PCR擴增。擴增體系為：2 μL 1st-Strand cDNA 溶 液，4 μL dNTP Mixture（ 各2.5 mmol/L），1 μL 上游兼并引物（10 μmol/L），1 μL下游兼并引物（10 μmol/L），10 μL 5×Prime STAR Buffer（Mg2+Plus），0.5 μL Prime STAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μL），31.5 μL ddH2O。擴增程序為：95℃ 4 min ；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，32 個循環；72℃ 10 min。PCR產物經回收、末端加A和純化后克隆至T-Vector pMD20（TaKaRa公司）上進行測序。

1.2.2 ItSnRK2.1基因的生物信息學分析 基因的編碼區的預測、序列提交、蛋白質的理化性質分析， 分 別 采 用 ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）、Bankit（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?tool=genbank） 和ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）在線程序完成。利用 ScanProsite（http://prosite.expasy.org/scanprosite/）、TMpred Server（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）、NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）、SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）、SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線程序分別對ItSnRK2.1蛋白進行保守功能域、跨膜區、磷酸化位點、親水性/疏水性、二級結構和信號肽分析預測。Blastp搜索與ItSnRK2.1同源的蛋白序列，基于MEGA5.0軟件以鄰近法完成蛋白系統發育樹構建，利用GENEDOC軟件生成蛋白多序列比對?；虮磉_水平采用Miura等［12］方法進行分析。

1.2.3 ItSnRK2.1基因的實時定量RT-PCR檢測 利用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）合成cDNA第一鏈。

參照TaKaRa公司SYBR? Fast qPCR Mix試劑盒說明書進行實時定量RT-PCR檢測ItSnRK2.1基因表達模式。ItSnRK2.1基因特異性引物為5'-GGAGTATGCTTCTGGAGGAG-3'和5'-GAGCAGGGCTCCCATCAAGC-3'。用Itactin（AY870652）作為持家基因，擴增引物為5'-ATTCCGTTGCCCTGAAATAC-3'和5'-CTTTGCTCATACGGTCAGCG-3'。擴增程序為94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 10 s，40 個循環。

2 結果

2.1 菘藍ItSnRK2.1基因的克隆

菘藍幼苗的總RNA提取結果（圖1-A）顯示，所提取的總RNA 5S、18S和28S條帶較完整和清晰，可以用于合成cDNA第一鏈的模板。以第一鏈cDNA為模板進行RT-PCR反應，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示，產生1 300 bp左右的的特異性片段（圖1-B）。擴增產物經測序得到1 305 bp cDNA序列。ORF Finder預測結果（圖2）顯示，1305 bp 的cDNA具有一個112 bp 的3'-非編碼區（3'-UTR），一個1 071 bp的開放閱讀框（ORF）和一個122 bp 的5'-非編碼區（5'-UTR），編碼356個氨基酸。將該cDNA全長序列命名為ItSnRK2.1，提交至Genbank，獲得登錄號為MF423122。

圖1 總RNA的提取和ItSnRK2.1基因的RT-PCR擴增

圖2 ItSnRK2.1基因cDNA序列及其推導的氨基酸序列

2.2 菘藍ItSnRK2.1蛋白激酶的氨基酸組成和理化性質分析

ItSnRK2.1全長cDNA編碼356 aa，理論等電點為5.64，理論分子量為40.6 kD；ItSnRK2.1蛋白中Glu、Lys、Ser和Leu含量較高，分別為10.4%、7.9%、7.9%和7.6%；ItSnRK2.1蛋白中帶負電荷的殘基（Asp+Glu）總數為58個，帶正荷的殘基（Arg+Lys）總數為47個；ItSnRK2.1蛋白分子式為C1791H2823N489O555S15，平均疏水性（GRAVY）為-0.515，脂肪氨基酸指數（AI）為82.16。ItSnRK2.1蛋白的不穩定指數為44.94，屬于不穩定蛋白，與擬南芥AtSnRK2.1蛋白激酶的氨基酸組成極為相似。

2.3 ItSnRK2.1蛋白激酶的多序列比對和進化分析

為了明確ItSnRK2.1蛋白激酶的結構特征，對推導的ItSnRK2.1蛋白激酶的氨基酸序列同擬南芥、水稻、大麥、玉米、水稻、燕麥和二穗短柄草的SnRK2氨基酸序列進行多序列比對和ScanProsite在線預測。結果顯示，ItSnRK2.1蛋白包含一個由酸性氨基酸序列組成的高度特異的C端激酶調控域及一個高度保守的N端蛋白激酶催化域（圖3-A）。ItSnRK2.1蛋白高度保守的N端催化域（4-260 aa）具有一個24 aa的ATP結合位點（圖3-B，黑框I）和一個13 aa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活位點（圖3-B，黑框II）。C端包含一個34 aa的結構域I（Domain I）（圖3-B，黑框III）。但是，同AtSnRK2.1蛋白激酶相同，C端缺少44 aa的結構域II（Domain II）（圖 3-B，黑框Ⅳ）。

多序列比對結果（圖3-B）顯示，ItSnRK2.1蛋白與其它8個SnRK2成員高度同源。ItSnRK2.1氨基酸序列與擬南芥AtSnRK2.1（NP_196476.1）、水 稻 OsSAPK7（BAD18003.1）、 大 麥 HvPKABA1（BAB61735.1）、擬南芥 AtSnRK2.6（NP_567945.1）、玉 米 ZmSnRK2.1（ACG50005.1）、 水 稻 OsSAPK2（BAD17998.1）、燕麥 TaSnRK2.8（AKZ18234.1）和二穗短柄草 BdSAPK8（AJR27164.1）氨基酸序列的相似性分別為95.18%、74.16%、66.67%、64.33%、64.91%、65.50%、62.92%和62.90%。

為了明確ItSnRK2.1與其它nRK2蛋白激酶的進化關系，用菘藍、水稻、玉米、燕麥等30個SnRK2成員的氨基酸序列構建進化樹。結果（圖4）顯示，30個SnRK2.1蛋白激酶可以分為3組，菘藍ItSnRK2.1蛋白激酶同擬南芥AtSnRK2.1、馬鈴薯StSnRK2.4、玉米ZmSnRK2.6、水稻OsSAPK7等12個SnRK2成員聚為一組，說明這些基因在進化上高度保守，可能在抗逆功能上具有相似性。

2.4 ItSnRK2.1蛋白激酶的疏水性分析

氨基酸的親水性和疏水性是蛋白質固有的特征，氨基酸的親水性和疏水性之間的平衡決定著蛋白質的結構特征，而氨基酸內的疏水作用在很大程度上決定著蛋白質結構的穩定性。所以，分析和預測蛋白質的親水性和疏水性可以為蛋白質結構分析和功能預測提供重要的理論依據。氨基酸的親水性和疏水性分析結果（圖5）顯示，ItSnRK2.1蛋白激酶最大疏水性氨基酸值為2.189，最小疏水性氨基酸值為-3.300，存在多個明顯的親水區域，而且組成ItSnRK2.1蛋白激酶的大部分的氨基酸屬于親水性氨基酸。據此推斷，菘藍ItSnRK2.1蛋白激酶屬于親水性蛋白。

圖3 ItSnRK2.1蛋白激酶保守結構預測和多序列比對

圖4 ItSnRK2.1蛋白聚類分析

2.5 ItSnRK2.1蛋白激酶的二級結構預測

蛋白質二級結構預測結果（圖6）顯示，菘藍ItSnRK2.1蛋白激酶的二級結構具有151個α-螺旋（Alpha helix）、109個無規則卷曲（Random coil）、66個延伸鏈（Extended strand）和30個β-轉角（Beta turn）。與擬南芥AtSnRK2.1蛋白激酶的155個α-螺旋（Alpha helix）、109個無規則卷曲（Random coil）、62個延伸鏈（Extended strand）和27個β-轉角（Beta turn）極為相似，暗示菘藍ItSnRK2.1蛋白激酶可能與擬南芥AtSnRK2.1蛋白激酶可能具有相似的功能。

2.6 ItSnRK2.1信號肽的預測和分析

信號肽是由長度5-30個N-末端氨基酸組成的短肽鏈（有時不一定在N端），其功能是引導新合成的蛋白質向分泌通路轉移。利用SignalP 4.1 Server對ItSnRK2.1進行預測。結果（圖7）顯示，可能沒有信號肽區域存在于ItSnRK2.1蛋白激酶中。

圖5 ItSnRK2.1蛋白激酶親水性/疏水性分析

2.7 ItSnRK2.1蛋白激酶的亞細胞定位

為了掌握菘藍ItSnRK2.1蛋白的表達和作用位置，利用在線預測軟件PSORT Prediction對ItSnRK2.1蛋白進行亞細胞定位。預測結果表明，ItSnRK2.1蛋白的可能定位在細胞質（Cytoplasm）、微體（Microbody）、線粒體基質空間（Mitochondrial matrix space）和溶酶體（Lysosome）上。這4個位置的決定性系數（Certainty）分別為0.450、0.300、0.100和0.100，所以推測ItSnRK2.1蛋白最可能定位的位置是在細胞質上。

2.8 ItSnRK2.1蛋白激酶的的跨膜區分析

α-螺旋結構通常作為蛋白質序列中跨越細胞膜的區域，構成跨膜區的氨基酸大部分必須是疏水性氨基酸，這樣才能使膜蛋白順利通過細胞膜的磷脂雙分子層。TMpred 預測結果（圖8）顯示，可能有3個跨膜結構域存在于ItSnRK2.1蛋白中。由外向內的跨膜結構域有一個，位于183-200 aa，長度為18 aa，分數為892。由內向外的跨膜結構域有二個：一個位于98-121 aa，長度為24 aa，分數為182；另一個位于183-200 aa，長度為18 aa，分數為1 109。所以，ItSnRK2.1蛋白激酶可能存在2個顯著跨膜結構域（分數大于500）。

2.9 ItSnRK2.1蛋白激酶磷酸化位點分析

大部分前體蛋白需要經過翻譯后修飾才能成為有功能的蛋白質，而蛋白質翻譯后修飾中最重要、最常見的方式之一是蛋白質的磷酸化。磷酸化位點預測結果（圖9）顯示，ItSnRK2.1蛋白激酶可能有8個酪氨酸（Tyr），11個蘇氨酸（Thr），23個絲氨酸（Ser）成為磷酸化位點。擬南芥AtSnRK2.1蛋白激酶可能有7個酪氨酸（Tyr），10個蘇氨酸（Thr），21個絲氨酸（Ser）成為磷酸化位點。二者可能的磷酸化位點的數目和位置極為相似，它們可能具有類似的磷酸化過程。

2.10 ItSnRK2.1基因表達分析

2.10.1 ItSnRK2.1基因組織表達特性 為了探明ItSnRK2.1基因在雪菜根、莖和葉組織中的表達模式，利用實時定量RT-PCR對ItSnRK2.1基因的轉錄情況進行了分析。檢測結果（圖10）顯示，在3個供試組織中都能檢測到ItSnRK2.1基因的表達，但基因表達水平在不同組織中存在一定差異。ItSnRK2.1基因表達量最高的組織是根，其次為葉片，表達量最低的組織是莖，說明ItSnRK2.1基因的表達具有組織特異性。

2.10.2 ItSnRK2.1基因脅迫表達特性 實時定量RT-PCR檢測結果（圖11）顯示，ItSnRK2.1基因積極參與高鹽和干旱脅迫應答反應。當菘藍幼苗受到高鹽脅迫時，ItSnRK2.1基因表達量迅速上升，在脅迫3 h時，表達量達到最高，為處理前（0 h）的4.8倍，隨后表達量逐漸降低，72 h時表達量僅為對照的1.3倍（圖11-A）。當菘藍幼苗遭受PEG脅迫時，ItSnRK2.1基因表達量也呈現出先升高、后下降的表達規律，但出現兩個波峰值，分別出現在3 h時和12 h時，表達量分別是對照的2.2和2.3倍（圖11-B）。當用ABA處理菘藍幼苗時，各時間段ItSnRK2.1基因表達水平無明顯差異（圖11-C），類似于去離子水（對照）處理（圖11-D）。

圖6 ItSnRK2.1同AtSnRK2E二級結構比較

圖7 ItSnRK2.1蛋白信號肽的預測

圖8 蛋白跨膜結構域預測

圖9 ItSnRK2.1蛋白磷酸化位點預測

圖10 ItSnRK2.1基因的的組織表達分析

3 討論

SnRK2家族基因編碼植物體內特有的參與多種信號傳導的一類Ser/Thr蛋白激酶，是影響植物抗逆境脅迫能力的關鍵調控基因，其在不同脅迫下和不同組織中的表達具有一定的差異性。實時定量和半定量分析結果顯示，煙草NtSnRK2.1基因在根部有最高表達水平，葉片中的次之，莖部的表達量最低［14］。Northern blot檢測結果表明，在 ABA、NaCl和甘露醇脅迫下，水稻基因組中10個SnRK2成員（SAPK1-SAPK10）在根、葉鞘和葉片不同組織中的表達存在差異性［6］。本研究發現ItSnRK2.1基因的表達也具有一定的組織差異性，與水稻和煙草中的組織表達模式基本一致。

多序列比對結果顯示，不同SnRK2蛋白激酶成員在N末端高度保守，而在C末端高度特異。SnRK2家族成員在C末端包含一個酸性補?。―/E），一般富含天冬氨酸（D）或谷氨酸（E），依據這一特點將SnRK2成員分為二組：SnRK2a（酸性補丁中富含D）和 SnRK2b（酸性補丁中富含E）［15］。序列分析顯示，菘藍ItSnRK2.1蛋白的C末端也包含一個谷氨酸（E）的酸性補丁，因此，ItSnRK2.1屬于SnRK2b家族中的一員?；贑末端結構組成和系統發生，又可將SnRK2家族成員分為3組：Group I-Group III［16］。進化樹構建結果表明，菘藍ItSnRK2.1被歸為Group I成員，這與Group II和Group III屬于SnRK2a，而Group I屬于SnRK2b的研究結果一致。SnRK2蛋白激酶家族的C末端主要包含兩個結構域：一個是Domain I，該區域是SnRK2蛋白激酶響應非生物脅迫的必要元件，Group I-Group III成員都具備這一結構域；另一個是Domain II，為Group III成員所特有的一段序列，是響應ABA應答不可缺

少元件，在與PP2C、ABI1等磷酸酶的互作及響應ABA 應答等方面發揮著重要的作用［6，13，17-18］。除SnRK2.9外，擬南芥其余9個SnRK2成員都響應高滲脅迫，同時研究發現Group I成員不響應ABA脅迫，Group II成員對ABA脅迫不響應或具有微弱的響應，Group III成員強烈響應 ABA 脅迫［5，10，16］。10 個水稻SnRK2成員也都響應高滲脅迫，其中Group I和Group II中的3個成員（SAPK8、SAPK9和SAPK10）也響應ABA脅迫［6］。這些研究結果與SnRK2家族成員的高度保守的N端催化域和特異的C端激酶調控域是相關的，SnRK2家族成員在功能上的相似性與差異性、響應脅迫的相似性與差異性等都可能歸因于SnRK2s序列的一致性和多樣性。與擬南芥AtSnRK2.1和水稻SAPK7的研究結果及其相似，菘藍ItSnRK2.1蛋白激酶的C末端僅含有一個34 aa的Domain I，缺少44 aa的Domain II，并且響應高滲脅迫但對ABA脅迫不敏感，暗示菘藍ItSnRK2.1基因與擬南芥AtSnRK2.1和水稻SAPK7有類似的功能，在參與非生物脅迫過程中很可能也是不依賴ABA調控通路的。

4 結論

從菘藍中克隆了1個編碼蔗糖非發酵相關的蛋白激酶的基因ItSnRK2.1，包含一個1 071 bp的完整開放閱讀框，編碼356個氨基酸，理論等電點為5.64，理論分子量為40.6 kD。

ItSnRK2.1蛋白激酶包含一個ATP結合位點和一個絲氨酸/蘇氨酸酶活結構域。預測了ItSnRK2.1蛋白激酶的亞細胞定位、親水性/疏水性、信號肽、二級結構、磷酸化位點和跨膜域。ItSnRK2.1氨基酸序列與其它SnRK2成員分享較高的相似性，同AtSnRK2.1、AtSnRK2.5和StSnRK2.6蛋白親緣關系最近，處在同一進化分枝。ItSnRK2.1基因表達具有組織特異性，積極參與高鹽和干旱脅迫應答反應，但對ABA脅迫不敏感，表明該基因可能與植物抗逆境脅迫有關，且不依賴ABA調控通路。

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