CO2濃度對雨生紅球藻生理生化指標的影響

陳佳妮 林麗春 徐年軍 張琳 孫雪

（寧波大學海洋學院，寧波 315211）

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是綠藻綱（Chlorophyceae）、團藻目（Volvocales）、紅球藻科（Haematococceae）的一種單細胞綠藻。它的生活周期可分為營養細胞和厚壁孢子兩個時期，環境有利時主要以綠色游動細胞的形式存在，環境不利時形成厚壁孢子并大量累積蝦青素［1］。其最高蝦青素含量可達到干重的5%以上［2］，且所含蝦青素在結構、功能、應用和安全性上優于人工合成的，被認為是天然蝦青素含量最高的生物，是蝦青素的最好生物來源［3］。蝦青素（Astaxanthin）是一種具強抗氧化活性的紅色類胡蘿卜素酮化物，也是迄今為止人類發現的自然界最強的抗氧化劑，在全球市場有很大的潛力和很高的市場價值，被廣泛應用于飼料、食品添加劑和營養保健品等方面［4］。

目前，雨生紅球藻生產蝦青素的研究趨勢是采用兩步培養法［5］，根據雨生紅球藻生長周期的特性可將蝦青素的生產分為利于營養細胞生長、生物量積累的綠色營養階段和利于蝦青素積累的紅色孢子階段。與低生產成本的化學合成法相比，雨生紅球藻生長速度緩慢，生產成本較高，在蝦青素的批量生產上不占優勢［6］。目前，國內外對雨生紅球藻的研究主要集中于優化其生長和蝦青素積累條件上，如光照、溫度、pH、氮源、碳源等［7-11］。已有研究表明高CO2濃度能促進雨生紅球藻生長和蝦青素積累［12-14］，因此研究雨生紅球藻對高濃度CO2的生理響應具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種 雨生紅球藻由寧波大學海洋生物工程重點實驗室微藻室提供。

1.1.2 培養條件 以NMB3#加富的過濾除菌自然水制成基礎培養基［15］，培養溫度為（25±1）℃、光照 強 度 為 100 μmol/（m2·s）（D∶L=12 h∶12 h）。實驗使用CO2光照培養箱控制CO2濃度，未通入CO2時，培養箱內CO2濃度為空氣CO2濃度，顯示值為0.04%；通入CO2后，設置培養箱CO2濃度為0.16%，即4倍空氣CO2濃度。將對數生長期的藻液接種到盛有300 mL新鮮培養基的500 mL錐形瓶中培養，接種密度大約為2×104cells/mL，培養過程中每天在固定的時間搖瓶2次，防止細胞貼壁。

蝦青素的誘導階段：在低光強100 μmol/（m2·s）下培養8 d后，分別離心收集空氣CO2濃度和4倍空氣CO2濃度下培養的雨生紅球藻，用去離子水洗滌2次后離心，然后重新懸浮于缺氮的NMB3#培養基中。光照強度調整為200 μmol/（m2·s）（D∶L=12 h∶12 h）， 以 1.3×105cells/mL的密度接種繼續培養。

1.2 方法

1.2.1 藻細胞密度測定 每天定時取3 mL藻液，于680 nm處測定其OD 值。依據藻的細胞密度和OD680關系的回歸方程y=7.973 3x+0.032 9（R2=0.990 1）計算雨生紅球藻的細胞密度。

1.2.2 葉綠素、類胡蘿卜素含量測定 葉綠素和類胡蘿卜素含量測定參照Cheng等［13］的方法，計算公式如下：

C葉綠素（mg/L）=4.35A663+19.34A645

C類胡蘿卜素（mg/L）=4×A480

例 1 (房屋評估問題) 設U={x1,x2,…,xn}是代表10套房屋的集合,A={a1,a2,a3,a4}={價格, 結構, 色彩, 周圍環境}為條件屬性集。 “價格”屬性值域為{高,適中,低}, “結構”屬性值域為{合理,一般,差},“色彩”屬性值域為{好,差}和“周圍環境”的屬性值域為{安靜,有一點噪音,有噪音,非常吵},決策屬性D={d}的值域為{售賣,進一步評估,禁止售出}?，F邀請4位專家對這些房屋的屬性進行評估(具體評估結果參看文獻[19]),整合所有專家的意見,此時每一個屬性都會產生如下所示的一個U的覆蓋。

式中，A645、A663與A480，分別為波長645 nm、663 nm與480 nm時色素提取液的OD值。

1.2.3 葉綠素熒光參數測定 測量前藻樣品先暗適應15 min，使用Water-PAM水樣葉綠素熒光儀（Walz，Germany）進行葉綠素熒光參數的測定。設定測量光強度為0.1 μmol/（m2·s），光化光強度為 113 μmol/（m2·s），飽和脈沖強度為 10 000 μmol/（m2·s）。葉綠素熒光參數PS II最大光能轉化效率（Fv/Fm）、實際光化學量子效率（ФPSII）、光化學淬滅（qP）和非光化學淬滅（NPQ）可在葉綠素熒光儀中直接讀出。

1.2.4 胞外碳酸酐酶活性測定 采用pH的方法［16-17］。離心收集藻細胞，使用4℃預冷的20 mmol/L巴比妥鈉緩沖液（pH 8.4）2 mL洗滌一次后，再用2 mL巴比妥緩沖液懸浮藻細胞。迅速向懸浮藻液中加入1 mL 0℃飽和CO2的蒸餾水，用pH計監測反應體系pH值的變化，記錄pH下降一個單位所需的時間。CA活性（WA）計算公式為：WA =（T0/T-1）×10其中，T0和T分別為反應體系中未加和加入藻細胞懸浮液時pH值下降一個單位所需的時間。

1.2.5 Rubisco活性測定 Rubisco的活性測定參照Jin 等［18］的方法。

Rubisco 活 性［CO2μmol/（g·FW·min）］=［（ΔOD×Vt）/（ξ×d×Δt×Vs）×10］/2

其中，ΔOD為反應前后340 nm吸光度的差，Vt為提取酶液總體積（mL），ξ為 1 μmol NADH2的消光系數，d為比色杯光徑（cm），Δt為測定時間（min），Vs為參加反應的酶液體積（mL），10為重量換算系數，2表示每固定1 mol CO2有2 mol NADH被氧化。

1.2.6 蝦青素含量測定 蝦青素含量測定參照Boussiba和Vonshak［19］的方法并加以改進，按下式計算：C（mg/L）= 4.5×A490。式中：A490為波長490 nm下的OD值。

1.2.7 數據處理 實驗數據使用SPSS 13.0軟件進行分析，以P＜0.05作為顯著差異水平。

2 結果

2.1 CO2濃度對雨生紅球藻生長的影響

在綠色營養階段，經過2 d的延滯期后，4倍空氣CO2濃度下的雨生紅球藻迅速進入對數生長期，而在空氣CO2濃度下的藻生長緩慢，到第10 天，4倍空氣CO2濃度培養藻密度約為空氣CO2濃度的3.08倍（P＜0.05）（圖1-A）。在紅色孢子階段，除第4 天和第6 天外，藻細胞密度無明顯差異，藻細胞增殖速度隨培養時間的延長逐漸變緩，6 d過后藻細胞幾乎停止生長（圖1-B）。

2.2 CO2濃度對雨生紅球藻葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

在綠色營養階段，空氣CO2濃度下藻細胞葉綠素和類胡蘿卜素含量從第4 天之后快速增加，而在4倍空氣CO2濃度下增長幅度不大。從第4 天開始，雨生紅球藻在空氣CO2濃度下藻細胞葉綠素和類胡蘿卜素含量均顯著高于4倍空氣CO2濃度下的（圖2-A、2-B）。在不同CO2濃度培養條件下，雨生紅球藻中類胡蘿卜素/葉綠素隨時間增加而不斷升高，僅在第2 天和第6 天，低CO2濃度藻中類胡蘿卜素/葉綠素高于高CO2濃度培養藻（P＜0.05）（表1）。

圖1 CO2濃度對雨生紅球藻生長的影響

在紅色孢子階段，不同CO2濃度下培養雨生紅球藻葉綠素含量均隨培養時間增加而逐漸降低。除第2天外，4倍空氣CO2濃度下藻的葉綠素含量均顯著低于空氣CO2濃度培養藻（圖2-C）。自第2 天起，4倍空氣CO2濃度下類胡蘿卜素含量、類胡蘿卜素與葉綠素比值增加，且顯著高于低CO2濃度組（圖2-D、表2）。在第8 天，4倍空氣CO2濃度下類胡蘿卜素含量是空氣CO2濃度類胡蘿卜素含量的1.78倍，類胡蘿卜素/葉綠素是空氣CO2濃度的2.47倍。

2.3 CO2濃度對雨生紅球藻葉綠素熒光參數的影響

如圖3所示，在綠色營養階段，雨生紅球藻的Fv/Fm、ФPSII、qP隨著培養時間變化而上下波動，但差別不大；NPQ在個別時間點變化較大。4倍空氣CO2濃度下雨生紅球藻的NPQ和大部分ФPSII都高于空氣CO2濃度培養藻，而Fv/Fm僅在第3天和第7天與低CO2濃度組差異顯著，但qP對兩種不同CO2濃度的響應無顯著差異（圖3-C）。

2.4 CO2濃度對雨生紅球藻胞外碳酸酐酶活性的影響

CO2濃度對營養階段雨生紅球藻碳酸酐酶活性的影響顯著（圖4）。從第4天到第8天，空氣CO2濃度下和4倍空氣CO2濃度下的雨生紅球藻碳酸酐酶活性都呈逐漸下降的趨勢。4倍空氣CO2濃度培養藻的碳酸酐酶活性約為空氣CO2培養的0.55-0.75倍（P＜0.05），該結果說明較高濃度CO2會抑制碳酸酐酶活性。

圖2 CO2濃度對雨生紅球藻葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

表1 不同CO2濃度培養雨生紅球藻類胡蘿卜素/葉綠素比值的變化（綠色營養階段）

表2 不同CO2濃度培養雨生紅球藻類胡蘿卜素/葉綠素比值的變化（紅色孢子階段）

2.5 CO2濃度對雨生紅球藻Rubisco活性的影響

在綠色營養階段，不同CO2濃度下的雨生紅球藻Rubisco初始活性隨著培養時間的變化呈現先略有上升然后下降的趨勢。除在第6天，4倍空氣CO2濃度下培養藻Rubisco初始活性顯著高于空氣CO2濃度下培養藻之外，其余時間點的雨生紅球藻Rubisco初始活性在兩種CO2濃度培養組均無顯著變化（圖5-A）。在第4、5天，空氣CO2濃度下雨生紅球藻Rubisco總活性略大于4倍空氣CO2濃度下的，而在后3 d則相反，但不同CO2濃度下紅球藻的Rubisco總活性無顯著差異（圖5-B）。

2.6 CO2濃度對雨生紅球藻蝦青素含量的影響

不同CO2濃度培養雨生紅球藻蝦青素含量都隨培養時間的延長而逐漸升高。在第8 天，4倍空氣CO2濃度下單個藻細胞蝦青素含量達到6.35×10-6μg，比空氣CO2濃度下蝦青素含量增加了20.23%（P＜0.05）（圖6）?？梢?，在缺氮高光培養條件下，CO2濃度顯著影響了雨生紅球藻蝦青素含量。

圖3 CO2濃度對綠色營養階段雨生紅球藻葉綠素熒光參數的影響

圖5 CO2濃度對綠色營養階段雨生紅球藻Rubisco活性的影響

3 討論

CO2是植物生長的重要影響因子之一。在一定范圍內，提高CO2濃度可以促進藻類植物的生長，例如龍須菜、小球藻、等鞭金藻等［20-22］。適宜的高CO2濃度也能促進雨生紅球藻生長，但過高CO2濃度對其生長、光合作用、碳同化無益［14］。本文研究結果表明，4倍空氣CO2濃度是一個適宜的高CO2濃度，極大地促進了綠色營養期雨生紅球藻細胞密度的提高；但該CO2濃度顯著抑制了紅色孢子期雨生紅球藻生物量積累。據報道，高濃度CO2對雨生紅球藻蝦青素積累也有很大的影響，如0.06%、6%、10%和20%CO2均能有效促進雨生紅球藻中蝦青素的積累［12-14］。本研究中 4 倍空氣 CO2（0.16%CO2）濃度，同樣促進了雨生紅球藻中蝦青素含量的升高。

圖6 CO2濃度對紅色孢子階段雨生紅球藻蝦青素含量的影響

高CO2濃度會降低藻類的色素含量［23］。本實驗結果表明，高CO2濃度下雨生紅球藻中葉綠素和類胡蘿卜素含量都顯著降低，這與韋韜等［12］結論相似。本研究中，紅色孢子階段紅球藻細胞葉綠素含量顯著降低，類胡蘿卜素大量合成，這與受到環境脅迫時，雨生紅球藻可以通過積累蝦青素等來保護細胞有關［24］。而類胡蘿卜素與葉綠素比值越高就越適宜雨生紅球藻蝦青素的積累［14，25］。高CO2濃度下類胡蘿卜素/葉綠素顯著增加，這說明高光缺氮脅迫與高CO2濃度共同作用能有效促進雨生紅球藻蝦青素合成。

Fv/Fm是PS II最大光能轉化效率，反映了藻類進行光合作用的最大潛力，同時也是反映藻類生長環境良好與否的重要指標，在非脅迫條件下該參數變化較?。?6］。ФPSII是實際光化學量子效率，反映PS II反應中心在有部分關閉情況下的實際原初光能捕獲率。在本研究中，綠色營養階段4倍空氣CO2濃度下雨生紅球藻的Fv/Fm、ФPSII多升高，說明4倍空氣CO2濃度下藻細胞光能轉化效率和光利用水平較高。光化學淬滅（qP）是反映PS II天線色素吸收的光能用于光化學電子傳遞的份額；而非光化學淬滅（NPQ）則表示的是 PS II天線色素吸收的光能中不用于光合電子傳遞而以熱形式耗散的部分［27］。本研究結果中高濃度CO2促進了雨生紅球藻NPQ的顯著升高，而qP值與低CO2相比無顯著變化。推測，在正?？諝釩O2水平下，雨生紅球藻已經適應了這種低CO2條件，沒有過多的熱能耗散。而在4倍CO2下雨生紅球藻受到了較高CO2脅迫，熱形式耗散的能量增加，因此4倍CO2下該藻的NPQ比正?？諝釩O2濃度要高。但在4倍CO2條件下，該藻在熱形式耗散和光合作用效率兩方面達到了平衡，Fv/Fm、ФPSII和NPQ都升高，最終光合效率提高，生長加快。

CA是一種負責CO2轉運的酶，能夠可逆地催化CO2與HCO3-之間的轉化，重新固定呼吸釋放的CO2并用于光合作用［28］。本實驗結果顯示4倍空氣CO2濃度下培養藻的CA活性顯著低于空氣 CO2濃度，這與微藻細胞內存在的二氧化碳濃縮機制（CO2concentrating mechanism，CCM）有關，說明高濃度CO2會抑制無機碳的轉運，而低濃度CO2可以通過誘導CCM機制來增強胞外CA活性，提高胞內CO2水平從而維持較高的光合固碳能力［29］。Rubisco是催化光合CO2固定和光呼吸最初步驟的關鍵酶，藻類中95%以上的有機碳是由Rubisco固定的，但是Rubisco對CO2的親和力較低，且水體中可溶性CO2不足使得水體中藻類光合固碳受限［30］。CO2濃度是影響植物Rubisco活性的一個重要因素。有研究表明，CO2加富處理會顯著提高黃瓜Rubisco活性［31］。然而并不是所有植物在高CO2環境中Rubisco活性都會增加，在對多種不同植物進行的研究中，Rubisco活性平均下降了24%［32］。在本研究中高CO2濃度下雨生紅球藻Rubisco活性升高并不顯著，這可能與高濃度CO2引起的二磷酸核酮糖（RuBP）羧化限制和RuBP再生限制有關［33］。

4 結論

本研究表明相比于空氣CO2濃度，4倍空氣CO2濃度條件下雨生紅球藻生長加快，葉綠素和類胡蘿卜素含量及其比值、葉綠素熒光參數、CA活性、蝦青素含量均變化顯著。4倍空氣CO2濃度更利于雨生紅球藻生長、光合作用中光能轉化效率和光利用水平的提高及蝦青素的合成。

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