沙棘葉綠體對葡萄酒中亞硫酸鹽清除條件的 篩選及感官品質的影響

李 敏,宋金秀,畢 陽,*,韓舜愈,李霽昕,盛文軍

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室,甘肅蘭州 730070)

SO2是葡萄酒生產中的重要添加劑,兼具殺菌與抗氧化等多種作用。然而葡萄酒中的亞硫酸鹽會引發部分消費者哮喘和支氣管痙攣[1],還會危害硫不耐癥及高敏人群的健康。此外,酒中的硫化物也會在瓶儲和陳釀過程中轉化為H2S和硫醇,從而破壞葡萄酒的口感和香氣[2]。因此,有效降低亞硫酸鹽殘留一直是葡萄酒安全領域的研究熱點。

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)為胡頹子科酸刺屬,灌木或小喬木,別名酸刺、黑刺[3]。我國是世界最大的沙棘種植國,面積達140萬hm2,約占世界總面積的95%[4]。沙棘在改良土壤、防止水土流失方面發揮了積極的生態作用[5-6]。漿果是沙棘可被加工利用的主要部分[7-9],大量沙棘枝葉尚未進行有效開發。因此,充分挖掘沙棘枝葉的功能是沙棘產業發展中亟待解決的問題。植物葉綠體具有氧化亞硫酸鹽的功能[10]，其氧化能力與葉綠體提取方法[11],以及反應溶液的pH、溫度、時間、光照、氧氣等有關[12-13],氧氣[14]、光照[15-16]及葉綠體內的自由基[17-18]共同參與了該反應過程。葉綠體也可氧化葡萄酒中的亞硫酸鹽,Lin等[19]采用小麥葉綠體脫除了干紅葡萄酒中93%的亞硫酸鹽。黃國平等[20]采用菠菜葉綠體脫除了干白葡萄酒中99%的亞硫酸鹽。pH、反應溫度和葉綠體濃度等因素對脫除效果具有較大影響。沙棘葉片具有面積小、含水量低、葉綠體含量高、光飽和點高、光合效率高等優點[21]。作為藥食兩用資源,沙棘葉的應用目前僅局限于茶劑,其葉綠體對葡萄酒中亞硫酸鹽的清除研究還未見報道。

本研究在前期實驗基礎上,從小麥草、葡萄葉和沙棘葉三種植物中選取對葡萄酒感官品質影響最小的沙棘葉,通過高速冷凍離心提取葉綠體,研究沙棘葉綠體濃度、反應時間、反應溫度、pH、乙醇濃度、光照等因素對模擬酒中亞硫酸鹽清除率的影響,通過響應面法優化清除條件,并通過比較沙棘葉綠體在干型、甜型、紅色、白色不同葡萄酒中的亞硫酸鹽清除率及其對感官品質的影響,評估葡萄酒被飲用前利用沙棘葉綠體清除其中亞硫酸鹽的應用潛力,以期為葡萄酒中亞硫酸鹽的脫除提供方法及理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中國沙棘(Hippophaerhamnoidesssp. sinensis) 成熟葉片于2016年7月采自甘肅省農科院蘭州秦王川沙棘實驗田,選擇大小、色澤基本一致,無機械傷和病蟲傷的葉片,瓦楞箱包裝,當天運至實驗室;葡萄酒 赤霞珠干紅、霞多麗干白、美樂冰紅、白比諾冰白均由甘肅莫高實業發展股份有限公司提供;碘標準液[c(1/2 I2=0.02 mol/L)]、淀粉指示劑(10 g/L)、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸、無水乙醇、酒石酸、蘋果酸、乙酸、葡萄糖、果糖、氯化鈉、(NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、K2S2O5均為國產分析純。

10 S紫外-可見分光光度計 美國Thermo公司;160350 D乙醇測定儀 法國Dujardin Salleron公司;SL-1001電子天平 上海民橋公司;1810 D超純水機 重慶摩爾公司;移液器 德國Eppendorf公司;SPX-150-II生化培養箱 上海躍進公司;JJ-2高速組織破碎機 上海南榮公司;H2050 R臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀公司;NRY-200空氣恒溫搖床 上海南榮公司;GZX-GF101-II 電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葉綠體的提取 參考Lin等[19]的方法略做修改。葉片用去離子水清洗,高速組織破碎機破碎勻漿,三層紗布過濾除去粗纖維,所得濾液于4 ℃ 10000 r/min離心10 min,收集含葉綠體的沉淀,用去離子水配制成所需濃度。

1.2.2 模擬酒配制 參考Rowe等[22]的方法。稱取酒石酸5.00 g,蘋果酸2.50 g,乙酸0.20 g,葡萄糖2.00 g,果糖2.00 g,NaCl 0.20 g,(NH4)2SO41.00 g,K2HPO42.00 g,MgSO4·7H2O 0.20 g,MnSO4·H2O 0.05 g溶于1000 mL水中,用無水乙醇調整乙醇濃度為12%,用1 mol/L NaOH調整pH為3.4,4 ℃避光儲存待用。

1.2.3 SO2溶液配制與測定 參考李華[23]的方法。稱取122 mg K2S2O5溶于 1000 mL去離子水中,獲得60 mg/L SO2溶液,避光密封待用。參考國標GB/T 15038-2006[24]采用直接碘量法測定總SO2,待測樣中總SO2=碘標準溶液濃度mol/L×(樣品消耗的碘標準溶液體積mL-空白實驗消耗的碘標準溶液體積mL)×32 g/mol×1000/25 mL。亞硫酸鹽清除率(%)=(未處理前樣品總SO2-處理后樣品總SO2)/未處理前樣品總SO2×100。

1.2.4 葉綠體對模擬酒中亞硫酸鹽清除的單因素篩選 在酒精濃度12%、pH3.4的模擬酒中,固定反應時間5 h,反應溫度25 ℃,自然光照條件下,考察不同葉綠體濃度(11、13、15、17、19、21 mg/mL)對亞硫酸鹽清除率的影響;固定葉綠體濃度11 mg/mL,反應溫度25 ℃,自然光照,考察不同反應時間(1、2、3、4、5、6、7 h)對亞硫酸鹽清除率的影響;固定葉綠體濃度11 mg/mL,反應時間5 h,自然光照,考察不同反應溫度(5、10、15、20、25 ℃)對亞硫酸鹽清除率的影響;為盡量避免葉綠體對葡萄酒感官品質的不利影響,在預實驗基礎上并結合Lin S C方法[19],固定葉綠體濃度11 mg/mL,反應時間5 h,反應溫度25 ℃,考察乙醇濃度(5%、10%、15%、20%、25%)、pH(3、4、5、6、7、8)、光照(自然光照、避光)對亞硫酸鹽清除率的影響。

1.2.5 葉綠體對模擬酒中亞硫酸鹽清除的響應面實驗設計 采用Design-Expert 軟件進行響應面中心組合設計(CCD),在單因素實驗基礎上選取葉綠體濃度11 mg/mL、反應時間5 h、自然光照條件,以溫度X1,pH X2,乙醇濃度X3為自變量,亞硫酸鹽清除率為響應值,進行三因素三水平實驗設計。因素水平和編碼如表1所示。

表1 響應面實驗設計因素水平和編碼Table 1 Level and code of independent variable used for response surface analysis

1.2.6 沙棘葉綠體清除4種葡萄酒中的亞硫酸鹽實驗 參考國標GB/T 15038-2006[24],測定4種葡萄酒中的總二氧化硫含量并以此為對照,分別測定4種葡萄酒經響應面實驗優化參數處理后的亞硫酸鹽的含量。

1.2.7 沙棘葉綠體對4種葡萄酒感官品質的影響

1.2.7.1 感官分析 品嘗小組由20名經過葡萄酒品嘗訓練的葡萄酒專業師生組成,年齡21～40歲。參考國標GB 15037-2006[26]中不同類型葡萄酒的感官要求,從色澤(20分)、澄清度(20分)、香氣(20分)、滋味(20分)、典型性(20分)對樣品打分。

參考李華[25]的方法進行三角品嘗。采用X2分布進行差異分析。X2>3.85即為差異顯著。

1.2.7.2 色度與色調測定 參考李華等[25]的方法。分別測定酒樣在420、440和520 nm處的吸光度值,色調紅/白=OD420 nm/OD520 nm,色度紅酒=OD420 nm+OD520 nm,色度白酒=OD440 nm。

1.3 數據分析

所有實驗均重復3次。采用Design-Expert V.8.05進行響應面實驗設計與數據分析,全部數據采用Excel 2010計算平均值與標準偏差,采用SPSS 22.0進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 葉綠體濃度對模擬酒中亞硫酸鹽清除率的影響 沙棘葉綠體具備良好的亞硫酸鹽清除能力,當濃度為11 mg/mL時,就可清除41.67%的亞硫酸鹽,隨著濃度的增加清除率顯著升高,當濃度為17 mg/mL時達到最大,與初始的11 mg/mL相比,清除率提高了45.00%。隨著濃度的進一步增加,清除率并沒有顯著升高(圖1)。表明17 mg/mL已到達葉綠體氧化反應的飽和濃度,此時氧化能力達到最大,該結果與前人報道基本一致[11,19]?？紤]到高濃度葉綠體添加會對葡萄酒的色澤產生較大影響,故選取11 mg/mL進行后續實驗。

圖1 葉綠體濃度對模擬酒中亞硫酸鹽清除率的影響Fig.1 Effect of the chloroplast concentration on clearance rate of sulfite in model wine注:不同字母代表差異顯著(p<0.05);圖2～圖6同。

2.1.2 反應時間對模擬酒中亞硫酸鹽清除率的影響 隨著反應時間的增加清除率顯著升高,1 h即可清除41.67%的亞硫酸鹽,5 h時清除率達到最大,與初始的1 h相比,清除率提高了25.00%。隨著時間的進一步增加,清除率并未顯著升高(圖2)。這表明葉綠體對亞硫酸鹽的生物氧化是個緩慢的過程。值得注意的是1 h處理時沙棘葉綠體也已具有較高的清除率。

圖2 反應時間對模擬酒中亞硫酸鹽清除率的影響 Fig.2 Effect of the reaction time on clearance rate of sulfite in model wine

2.1.3 反應溫度對模擬酒中亞硫酸鹽清除率的影響 反應溫度的升高也會抑制葉綠體對亞硫酸鹽的清除作用,當溫度為5 ℃時,清除率可達到最高值43.75%,隨著反應溫度的增加清除率顯著降低,當溫度為10 ℃時清除率降至最低,比5 ℃時降低了19.05%,隨著溫度的進一步升高清除率略有增加,并從15 ℃起不再發生顯著變化(圖3)。低溫會引起葉綠體膨脹,類囊體腔膨大,基粒片層消失,被膜破壞[30],葉綠體內活性氧代謝失衡,因此5 ℃累積的大量活性氧有利于亞硫酸鹽的清除[31]。但考慮到葡萄酒在低溫下易產生酒石沉淀,同時也不利于香氣物質釋放,因此選擇20 ℃進行后續實驗。

圖3 反應溫度對模擬酒中亞硫酸鹽清除率的影響Fig.3 Effect of the reaction temperature on clearance rate of sulfite in model wine

2.1.4 乙醇濃度對模擬酒中亞硫酸鹽清除率的影響 乙醇會抑制葉綠體對亞硫酸鹽的清除作用,當濃度為5%時,清除率可達到56.25%,隨著濃度的增加清除率顯著降低,當濃度為25%時降至最低,與初始的5%相比,清除率降低了14.82%(圖4)。表明乙醇破壞了葉綠體類囊體膜結構[27],促進了葉綠體中的離子泄漏[28],使葉綠體的氧化能力降低,該結果與前人報道基本一致[20]。因此,葉綠體對低醇葡萄酒(酒精度1%～7%)中亞硫酸鹽的清除效果要高于利口葡萄酒(酒精度15%～22%)。

圖4 乙醇濃度對模擬酒中亞硫酸鹽清除率的影響Fig.4 Effect of the alcohol concentration on clearance rate of sulfite in model wine

2.1.5 pH對模擬酒中亞硫酸鹽清除率的影響 pH對清除率的影響表現為先上升后下降,當pH<6時,清除率隨pH增加而逐漸升高,當pH為6時達到峰值77.08%,與初始pH3相比,清除率提高了27.58%。隨著pH繼續增加清除率逐漸降低,pH為8時的清除率與pH3時相同(圖5)。說明葉綠體在其正常pH范圍時的氧化能力最強[29],該結果與前人研究結果[16]相同。而在葡萄酒的pH范圍3.2～4.0內,盡管清除率并未達到峰值,但也已高于60%。

圖5 pH對模擬酒中亞硫酸鹽清除率的影響Fig.5 Effect of the pH on clearance rate of sulfite in model wine

圖6 光照條件對模擬酒中亞硫酸鹽清除率的影響Fig.6 Effect of the light condition on clearance rate of sulfite in model wine

與小麥葉綠體[19]相比,沙棘葉綠體表現出在低濃度、低溫、酸性、低醇及普通葡萄酒酒精度(7%～15%)條件下快速降低亞硫酸鹽的能力。通過單因素實驗表明反應溫度、pH、乙醇濃度對亞硫酸鹽清除率有較大影響,同時考慮到應添加盡量少的植物葉綠體以降低其對葡萄酒感官品質的影響,因此選擇葉綠體濃度11 mg/mL、反應時間5 h、光照條件下進行響應面實驗。

2.2 響應面實驗

2.2.1 響應面實驗設計方案及結果 響應面中心組合設計(CCD)實驗方案及實驗結果見表2。

表2 響應面實驗設計及亞硫酸鹽清除率Table 2 RSM design and the sulfite clearance rate

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 回歸分析結果見表3,反應溫度(X1),pH(X2),乙醇濃度(X3)三因素經回歸擬合后得到沙棘葉綠體對模擬酒中亞硫酸鹽清除率的二次回歸方程:

Y=58.28+0.38X1+1.81X2-3.39X3+0.045X1X2-1.91X1X3+1.27X2X3-2.08X12+5.27X22+1.21X32

表3 回歸模型及方差分析結果Table 3 Regression model analysis of mean square deviation for experiment data

注:p<0.01表示該指標極顯著。

2.2.3 響應面圖交互作用分析 圖7為當固定反應溫度、pH、乙醇含量中任意一個因素為零水平時,其余兩個因素的交互作用對亞硫酸鹽清除率的影響。當pH相同時,反應溫度對清除率的影響表現為先上升后下降,15 ℃時清除率最低,隨著溫度的升高清除率逐漸增加,于20 ℃左右達到最高清除率,隨后清除率再次降低;當反應溫度相同時,pH對清除率的影響表現為先下降后上升,pH7時的清除率最高,隨著酸度的增加清除率逐漸降低,當pH約為5.8時清除率降至最低,之后隨著酸度的增加清除率再次緩慢升高(圖7A)。隨著乙醇含量的升高清除率迅速下降,溫度越高這種變化越明顯(圖7B)。當pH相同時,清除率隨酒精度的增加而降低,酸度越高這種變化越明顯;當酒精度相同時,pH對清除率的影響表現為先下降后上升,但隨著酒精度的增加,清除率隨著pH的降低而降低(圖7C)。與方差分析結果相符。

圖7 兩因素的交互作用對亞硫酸鹽清除率的影響Fig.7 Response surface plots of variable parameters on the sulfite clearance rate

2.2.4 驗證實驗 對回歸方程求解即獲得亞硫酸鹽清除率達到最大時的反應條件。當溫度24.65 ℃,pH5.00,乙醇濃度15.00%,沙棘葉綠體的清除率為55.02%;根據實際情況優化為溫度25 ℃,pH5,乙醇濃度15%條件下進行驗證實驗,測得亞硫酸鹽清除率為55.45%,與預測值誤差小于1%,證明響應面法可有效優化模擬酒中亞硫酸鹽的清除條件。

2.2.5 響應面優化條件對4種葡萄酒中亞硫酸鹽的清除實驗 供試的4種葡萄酒pH為3.33～3.69,酒度為11%～12%。沙棘葉綠體可顯著降低葡萄酒中的亞硫酸鹽(圖8)。清除率依次為干白(51.90%)>冰白(46.00%)>冰紅(42.57%)>干紅(30.14%)。較高的清除率表明沙棘葉綠體可作為亞硫酸鹽的生物氧化劑,并適應特殊的葡萄酒環境。同時沙棘葉綠體在冰白、冰紅兩種甜型冰酒中較高的清除率具有實際意義,因為甜酒為了抑制酵母菌二次發酵,硫的添加量是干紅的近4倍[23]。

2.3 沙棘葉綠體對4種葡萄酒感官品質的影響

圖9 沙棘葉綠體對冰白(A)、冰紅(B)、干白(C)、干紅(D)葡萄酒感官品質的影響Fig.9 Effects of seabuckthorn chloroplast on sensory quality of white icewine(A),red icewine(B),dry white wine(C)and dry red wine(D)

圖8 沙棘葉綠體的響應面優化條件 對四種葡萄酒中亞硫酸鹽含量的影響Fig.8 Effect of seabuckthorn chloroplasts at optimum conditions on sulfites contents in four kinds of wine

2.3.1 添加沙棘葉綠體后葡萄酒的感官評分 沙棘葉綠體對冰白(A)、干白(C)葡萄酒影響較大,5個指標得分均低于原酒,表明白葡萄酒的感官品質整體下降,而冰紅(B)除了香氣外,其它指標得分也有所降低(圖9)。雖然沙棘葉綠體也影響干紅(D)葡萄酒的顏色,但是香氣和滋味的變化較小,也幾乎不影響其口感的典型性,這是由于干紅葡萄酒口感較復雜,單寧等苦澀物質、乙醇以及果皮中的植物性香氣掩蓋了微量葉綠體對口感的影響。

2.3.2 三角品嘗實驗 經品嘗小組打分并計算,冰紅、冰白、干白葡萄酒X2=13.23>3.85,均與原酒存在差異顯著;干紅葡萄酒X2=3.03<3.85,即添加沙棘葉綠體對干紅酒樣口感的影響不顯著(p<0.05))。該結果與感官評分結果一致。

圖10 沙棘葉綠體對白葡萄酒(A) 和紅葡萄酒(B)色度的影響Fig.10 Effect of seabuckthorn chloroplasts on the color depth of white(A)and red wines(B)

2.3.3 沙棘葉綠體對4種葡萄酒顏色的影響 在白葡萄酒中加入沙棘葉綠體會使干白和冰白的色度分別增加16.44%和15.49%(圖10A)。這表明葉綠體略微增加了酒液的黃綠色,從葉綠體自身的綠色也可得以印證。在紅葡萄酒中添加沙棘葉綠體則會降低酒的色度(圖10B),干紅和冰紅分別降低28.84%和38.89%,而色調分別增加11.23%和1.75%(圖11)。由此表明酒液的紫紅色損失較多,可能是由于花色素被葉綠體氧化所致,同時葉綠體自身的綠色使酒液的黃綠色略有增加。該結果與感官評分一致,四種酒的顏色都發生劣變。

圖11 沙棘葉綠體對兩種紅葡萄酒色調的影響Fig.11 Effect of seabuckthorn chloroplasts on the hue of red wines

3 結論

沙棘葉綠體可清除模擬葡萄酒中的亞硫酸鹽。單因素實驗表明葉綠體濃度、反應時間、反應溫度、pH、乙醇濃度、光照條件均影響清除率,其中乙醇濃度、pH和反應溫度的影響最為顯著。對三個影響顯著因素的響應面實驗獲得亞硫酸鹽最佳清除率的回歸模型,經計算最佳清除條件為反應溫度25 ℃,pH5,乙醇濃度15%,此條件下沙棘葉綠體對模擬葡萄酒中亞硫酸鹽的平均清除率為55.54%,在4種葡萄酒中的清除率分別為干白(51.90%)>冰白(46.00%)>冰紅(42.57%)>干紅(30.14%)。感官實驗表明添加沙棘葉綠體對干紅的口感影響最小。由此表明,沙棘葉綠體可通過體外氧化反應有效清除葡萄酒中的亞硫酸鹽,具有清除率高,反應時間短,適應干紅葡萄酒環境的優點,具有深度開發的價值。

[1]Vally H,Thompson P. Allergic and asthmatic reactions to alcoholic drinks[J]. Addiction Biology,2003,8(8):3-11.

[2]魏陽吉,馬麗艷,李景明. 葡萄酒中硫化氫檢測方法的研究[J]. 釀酒科技,2010(2):109-111.

[3]張麗霞,康健,吳桐. 新疆沙棘籽油提取工藝研究[J]. 食品科技,2011(8):196-201.

[4]臧茜茜,鄧乾春,從仁懷,等. 沙棘油功效成分及藥理功能研究進展[J]. 中國油脂,2015,40(5):76-81.

[5]Ali H. Nitrogen fixation by non leguminous plant seabuckthorn in semi arid cliamatic conditions of Gilgit-Baltistan[J]. Pakistan Journal of Weed Science Research,2013,19(4):305-314.

[6]陳云明,劉國彬,侯喜錄. 黃土丘陵半干旱區人工沙棘林水土保持和土壤水分生態效益分析[J]. 應用生態學報,2002,13(11):1389-1393.

[7]Alexandrakis Z,Kyriakopoulou K,Katsaros G,et al. Selection of process conditions for high pressure pasteurization of seabuckthorn juice retaining high antioxidant activity[J]. Food and Bioprocess Technology,2014,7(11):3226-3234.

[8]范兆軍,牛廣財,朱丹,等. 響應面法優化沙棘果酒發酵條件的研究[J]. 食品與機械,2009,25(1):58-62.

[9]Ting H C,Hsu Y W,Tsai C F,et al. Theinvitro,andinvivo,antioxidant properties of seabuckthorn(HippophaerhamnoidesL.)seed oil[J]. Food Chemistry,2011,125(2):652-659.

[10]Jolivet P,Bergeron E,Zimierski A,et al. Metabolism of elemental sulphur and oxidation of sulphite by wheat and spinach chloroplasts[J]. Phytochemistry,1995,38(1):9-14.

[11]黃國平,姚玉靜,陳黎斌. 葉綠體脫除亞硫酸鹽效果研究[J]. 食品科學,2010,31(4):21-23.

[12]王向麗,丁力,黃國平,等. 葉綠體催化脫除二氧化硫的研究[J]. 現代食品科技,2009,25(10):1140-1143.

[13]黃國平,王向麗,胡飛. 葉綠體的提取方法與其脫除二氧化硫的活性[J]. 食品科技,2011(7):211-214.

[14]任家榮,劉霽欣,李瑞年,等. 氣體放電法氧化高濃度亞硫酸鹽[J]. 物理化學學報,2004,20(6):656-658.

[15]Covello P S,Thompson J E. Spin trapping evidence for formation of the sulfite radical anion during chloroplast-mediated oxidation of bisulfite ion[J]. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects,1985,843(1-2):150-154.

[16]Bharali B,Bates J W. Detoxification of dissolved SO2(Bisulfite)by Terricolous Mosses[J]. Annals of Botany,2006,97(2):257-263.

[17]Li B,Xing D,Zhang L. Involvement of NADPH oxidase in sulfur dioxide-induced oxidative stress in plant cells[J]. Photochemical and Photobiological Sciences,2007,6(6):628-634.

[18]李永裕,潘騰飛,余東,等. 模擬酸雨對龍眼葉片PSⅡ反應中心和自由基代謝的影響[J]. 生態學報,2012,32(24):7866-7873.

[19]Lin S C,Georgiou. A biocatalyst for the removal of sulfite from alcoholic beverages[J]. Biotechnology and Bioengineering,2005,89(1):123-127.

[20]黃國平,劉巖,陳黎斌. 葉綠體清除白葡萄酒中二氧化硫效果研究[J]. 安徽農業科學,2013(2):804-806.

[21]金爭平,溫秀鳳,張吉科. 沙棘葉生理年齡與源庫功能轉化的關系[J]. 國際沙棘研究與開發,2012,10(2):22-27.

[22]Rowe J D,Harbertson J F,Osborne J P,et al. Systematic identification of yeast proteins extracted into model wine during aging on the yeast lees[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58(4):2337-2346.

[23]李華. 葡萄酒工藝學[M]. 北京:科學出版社,2007.

[24]中華人民共和國質量監督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會. GB/T 15038-2006 葡萄酒、果酒通用分析方法[S]. 北京:中國標準出版社,2007.

[25]李華. 葡萄酒品嘗學[M]. 北京:科學出版社,2006.

[26]中華人民共和國質量監督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會. GB 15037-2006 葡萄酒[S]. 北京:中國標準出版社,2007.

[27]衛瑾,湯小儀,李有則. 乙醇對菠菜葉綠體的光合作用的影響[J]. 植物生理學報,1982(2):51-57.

[28]韓俊華,周君一,牛天貴,等. 乙醇對鮮切西蘭花抗氧化酶及葉綠體超微結構的影響[J]. 食品科學,2008,29(3):283-287.

[29]周文彬,邱保勝. 植物細胞內pH的測定[J]. 植物生理學報,2004,40(6):724-728.

[30]焦雨歆,趙琦,王雪英,等. 環境因子對植物葉綠體結構的影響[J]. 生物技術通報,2008(2):5-10.

[31]黎明,楊芳絨,商衛衛. 低溫對宜昌潤楠生理指標及葉片超微結構的影響[J]. 西北林學院學報,2010,25(4):19-22.

[32]王榮,杜紅波,秦艷芬,等. 兩種亞硫酸氫鹽對“紅富士”葉片光合色素含量的影響及其原因探析[J]. 昭通學院學報,2013(5):52-55.