晚熟桃采后褐腐病致病菌的分離鑒定 及拮抗菌對其防治效果的研究

張 娜,鄭香香,于晉澤,閻瑞香,關文強,*

(1.國家農產品保鮮工程技術研究中心,天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室,天津 300384;2.天津市食品生物技術重點實驗室,天津商業大學,生物技術與食品科學學院,天津 300134)

映霜紅桃(Prunuspersica(L.)Batsch)原名冬雪王桃,是晚熟桃中具有代表性的品種之一,具有晚熟、耐貯藏、個大、優質、豐產等特點[1]。但在采后貯藏過程中易受到褐腐病的侵害,導致桃果實軟化腐爛,褐腐病是危害晚熟桃果實產量和品質的重要病害之一。褐腐病又名菌核病,是由核盤菌屬(Sclerotinia)、鏈核盤菌屬(Monilinia)、絲核屬(Rhizoctonia)和小菌核屬(Sclerotium)等真菌引起的,多在桃、杏、李、櫻桃、梅等核果類果樹上發作[2],可危害花、葉及枝梢,但主要危害果實,具有潛伏感染性;受潛伏侵染的果實可以不表現癥狀,也可以在表面出現暗色或褐色的小瘢痕,部分受潛伏侵染的果實在開始成熟時會腐爛[3],或者在果實采后運輸、存儲期間由于環境溫度波動、機械損傷等原因導致病害的發生,果實大面積腐爛。不同地區、不同果園導致病害發生的病原菌并不一致,因此有必要對已經發生病害果園的致病微生物進行準確的病原菌分離鑒定,以利于控制病原菌的危害。

目前關于晚熟桃褐腐病的病原菌鑒定、病害發生流行規律及防治措施等均未見報道,為病害的防治帶來了較大的困難,該病害已經成為制約晚熟桃產業發展的一大障礙。晚熟桃果實一旦發生褐腐病往往在冷庫貯藏期間腐爛率就能達到15%,而出庫后由于溫度升高,5 d內平均腐爛率就高達60%。目前真菌病害的控制主要通過使用殺真菌劑(如苯菌靈、異菌脲等)來控制采后病害的發生,減少果實的腐爛和延長貯藏期[4]。然而,消費者越來越關注化學殘留物帶來的健康問題,以及殺菌劑的濫用造成許多真菌對常用殺菌劑產生了抗藥性,因此,綠色安全的生物防治作為一種有效的替代方案受到越來越多的關注。大量的研究表明,芽孢桿菌能夠較好的控制采后水果的多種疫病,如蘋果霉心病[5]、柑橘青霉病[6]、香蕉炭疽病[7]、蘋果梨青霉病、黑斑病[8],金花梨果腐病[9]等,但對于晚熟桃的采后褐腐病的研究相對較少,因此研究利用芽孢桿菌來控制褐腐病對晚熟桃產業的發展具有重要意義。

本文針對“映霜紅”晚熟桃褐腐病的發生,采用傳統形態學分類法和18S-rDNA分子生物學方法對晚熟桃褐腐病的病原菌進行分離鑒定,并利用篩選出的四種對采后蒜薹灰霉病具有顯著抑制效果[10]的芽孢桿菌(HB-2、B001、B579、B1)，采用有傷接種法在不同時間段對晚熟桃褐腐病進行預防,以期為晚熟桃褐腐病的采后生物防治提供理論依據和技術支撐,促進生態農業的健康發展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

晚熟桃 品種“映霜紅”,采收后立即運往國家農產品保鮮工程技術研究中心(天津)實驗庫中,采用0.03 mm PE保鮮袋包裝,采摘于山東省濟寧京信農產品專業合作社聯合社;拮抗芽孢桿菌:菌種HB-2(Bacillusamyloliquefaciens)、B001(Bacillussubtilis)、B579(Bacillussubtilis) 天津市植物保護研究所;芽孢桿菌B1(Bacillusamyloliquefaciens) 本實驗室保存菌種;肉汁胨培養基(NA)、馬鈴薯葡萄糖培養基PDA培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司;SK8259真菌提取試劑盒、NS1、NS6 生工生物工程(上海)有限公司;無水乙醇、生理鹽水、打孔器(直徑6 mm)、干燥器 天津市江天統一科技有限公司。

SW-CJ.1BV微生物操作臺 上?？禐獒t療科技發展有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;BX51顯微鏡 OLYMPUS;SPX-250-C智能型恒溫恒濕培養箱 上?，樞麑嶒炘O備有限公司;DYY-5穩壓電泳儀 北京六一儀器廠;3730XL測序儀 Applied Biosystem,2720 thermal cycler PCR儀 Applied Biosyetems;FR980凝膠成像儀 上海復日科技儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桃果實褐腐病病原菌的分離純化 參考文獻[11]分離甜櫻桃致病菌的方法,將晚熟桃放在恒溫高濕條件下(20 ℃,95% RH)加快其發病。用接種針直接挑取桃果實表面菌絲(分生孢子堆),將其接種到PDA培養基上,恒溫培養箱中培養(26 ℃)。依據常規組織分離法獲得感病組織,即從發病果實的病健交界處果肉組織進行分離,切取距果實病斑5 mm處的組織,依次采用70%的乙醇、1.0%的次氯酸鈉浸泡30 s,再用滅菌水清洗3次,濾紙吸干,植入PDA培養基中,26 ℃下培養。當上述菌落直徑生長至1 cm時,用接種針挑取菌絲尖端植入另一PDA培養基中。重復上述操作2～3次即可作為純化菌種轉入凍存管中,4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 病原菌形態學特征觀察及初步鑒定 將病原菌移接于PDA平板上,26 ℃條件下,12 h光照/12 h黑暗培養。記錄菌落形態特征,并測量其大小。在光學顯微鏡下觀察培養病原菌的分生孢子和分生孢子梗形態。并根據病原菌的產孢特征及其在PDA培養基上的形態特征,參照《真菌鑒定手冊》[12]、《真菌分類學》[13]方法進行病原菌鑒定。

1.2.3 病原菌致病性的測定 將已經純化后的病原菌菌餅(直徑6 mm)回接晚熟桃果實表面和果蒂處,分別采用有傷和無傷兩種方式接種病原菌,通過觀察病斑發展速度和發病程度,判斷菌種致病能力。有傷接種采用接種針在桃果實的兩側各集中刺破5個孔(傷口直徑約5 mm),傷口處接種病原菌菌餅;無傷接種時直接將病原菌菌餅接種在桃果實表面。每個處理10個果實,置于干燥器中,室溫下培養(18～25 ℃)。記錄病斑發病個數和直徑,并計算發病率,發病率(%)=(接種菌餅總個數-未發病個數)/接種菌餅總個數×100。

1.2.4 分子生物學鑒定

1.2.4.1 基因組DNA提取 從已經純化好的培養基上直接刮取菌絲放入1.5 mL滅菌離心管中,按照SK8259(真菌)試劑盒的操作步驟進行基因組DNA的提取,利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA。提取的DNA定量后稀釋,作為PCR反應的模板。

1.2.4.2 PCR擴增 采用真菌通用引物NS1和NS6進行PCR擴增。25 μL PCR反應體系包括NS1和NS6引物各0.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)1 μL,模板DNA溶液0.5 μL,10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL,酶0.2 μL,超純水19.8 μL。反應程序為:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30個循環;72 ℃延伸10 min。反應結束后,在1.0%瓊脂糖凝膠上(150 V、100 mA)電泳20 min,用凝膠成像儀進行拍照。PCR產物電泳條帶切割所需DNA目的條帶,PCR產物用PCR引物直接測序。

1.2.4.3 序列比對 將測定的基因序列運用GenBank 核酸數據庫中的BLAST 工具軟件,在DNA 序列數據庫中搜索同源DNA 序列并進行比較分析,根據BLAST 搜索和比較的結果,判斷所獲菌株的種類或其近緣的物種。

1.2.5 四種芽孢桿菌對病原菌的體內抑制 用70%乙醇對晚熟桃表面進行消毒,無菌水沖洗,自然干燥。分別在桃果實陽面、陰面用無菌牙簽刺破傷口,每個傷口直徑3～4 mm,深2～3 mm,用滅菌濾紙將傷口處的多余的果實汁液吸干,然后滴加30 μL拮抗菌發酵液(2.5×109cfu/mL),對照組滴加無菌水。分別于第0、1、2 d在已加完拮抗菌發酵液的傷口處接種病原菌菌餅(由打孔器獲得的菌餅直徑即為接種量，26 ℃培養3 d;直徑6 mm),同期以加完無菌水的傷口接種病原菌菌餅做對照。處理后的桃果實置于15 ℃下貯藏。分別在接種病原菌3、6 d后用游標卡尺測量病斑的橫徑和縱徑,按照橢圓形的面積公式計算病斑面積,并計算抑制率。病斑抑制率(%)=(S對照組-S處理組)/S對照組×100。每個處理設5次重復,每個重復有15個桃。實驗重復3次。

1.2.6 品質指標的測定 分別在接種病原菌6 d后測量晚熟桃部分營養品質指標,取樣時,避開傷口部位。硬度采用質構儀進行測定,對桃果實沿果實縫合線兩側果面帶皮穿刺,探頭直徑為2 mm,探頭下壓距離為10 mm,測試速度為2 mm/s;可溶性固形物含量采用手持糖度計測定;可滴定酸含量采用國標GB/T1245690的NaOH滴定法測定;維生素C含量采用碘量法測定。

1.3 數據處理

實驗數據運用Excel 2003軟件處理并繪圖,SPSS Statistics 17.0軟件采用Duncan多重比較用于數據的差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 桃果實褐腐病病原菌的形態學觀察及初步鑒定

桃果實褐腐病在發病初期,果實表面產生小的水浸狀褐色圓形病斑,病斑部果肉變褐腐爛,恒溫高濕條件下(20 ℃,95% RH)病斑擴散迅速,數日內病斑即可蔓延擴展至全果,使果肉褐變軟腐,隨后病部表面產生灰白色絨狀霉叢(分生孢子梗和分生孢子)。采用接種針直接挑取桃果實表面菌絲分離得到的病原菌與通過常規組織分離法得到的病原菌是同一種病原菌。該病原菌在PDA培養基上的生長速度很快,一般5 d菌落就可以布滿整個培養皿。菌落產孢豐富,菌落初期為灰白色,生長后期形成白色絨球狀物,氣生菌絲發達。但是在培養過程中發現,該病原菌的培養特性、形態學特征不穩定,如圖1a和圖1b所示,在完全一樣的培養條件下,有的菌落邊緣不平整,淺裂狀,有的菌落則邊緣平整,質地均勻;有的菌落同心輪紋較明顯,有的菌落同心輪紋則不明顯。在顯微鏡下觀察病原菌形態如圖1c、圖1d所示,分生孢子梗叢生,性孢子串生,球形,直徑3～4 μm。這與魏景超的《真菌鑒定手冊》和邵力平的《真菌分類學》中關于真菌界子囊菌門(Ascomycota)柔膜菌目(Helotiales)核盤菌科(Sclerotiniaceae)核盤菌屬(Sclerotinia)的描述相似。

圖1 病原菌在PDA上的生長形態 和顯微鏡下菌絲及孢子形態Fig.1 The growth-morphology and micro-morphology of pathogenic bacteria

2.2 病原菌致病性的測定

取分離純化后的病原菌菌餅接種到表面經過消毒的桃果實上,20 ℃條件下培養觀察,發現桃果實接種處2 d即會發病,開始時傷口接種處形成淺褐色病斑,病斑處果肉變軟,沿傷口處凹陷發黃,表面有少量菌絲生長,5 d時,約有1/2的果面變褐、發軟,并長有灰白色絨狀菌絲。該癥狀與桃褐腐病的自然發病癥狀一致,通過對發病率和病斑直徑的調查表明,該病原菌具有較強的致病性,在20 ℃條件下,5 d時病斑直徑擴展6.05～10.69 cm,并且無論在果面還是果蒂有傷接種發病率均為100%,無傷接種果面的發病率高于果蒂發病率。整體來說,有傷接種致病性高于無傷接種。

2.3 貯藏期病原菌的分子生物學鑒定

2.3.1 基因組DNA的提取及PCR擴增 褐腐病病原菌菌株的DNA提取采用SK8259(真菌)試劑盒操作,通過瓊脂糖凝膠電泳分析,試劑盒提取的樣品菌株的基因組DNA條帶清晰,可以用于下一步的PCR。以NS1、NS6為引物,經PCR擴增,得到的產物條帶特異性好,擴增的產物大小約為1300～1500 bp之間(圖2)。

表1 病原菌擴增序列結果對比表Table 1 The contrast table of pathogen amplification sequences

圖2 PCR產物電泳圖Fig.2 The electrophoregram of PCR products

圖3 拮抗菌B001、B1、B579、HB-2對桃褐腐病的預防效果Fig.3 The prevention effect of antagonistic Bacillus B001,B1,B579,HB-2 on peach brown rot注：不同小寫字母表示同一貯藏天數下，不同組間差異顯著(p<0.05)。

2.3.2 rDNA-ITS序列測定與比對 將擴增得到的褐腐病病原菌菌株的ITS PCR產物進行純化和測序,得到的序列與GenBank上的已知序列進行BLAST比對。具體結果如表1所示,通過將該病原菌的ITS序列與GenBank中已有的相關菌株的ITS序列進行同源性比較,表明該病原菌序列分別與核盤菌(CP017820.1)和核盤菌D2(KT454401.1)的同源性均達到99%,也就是說晚熟桃上分離的褐腐病病原菌屬于真菌界子囊菌門(Ascomycota),柔膜菌目(Helotiales),核盤菌科(Sclerotiniaceae),核盤菌屬(Sclerotinia)。

2.4 四種芽孢桿菌不同時間預防處理對褐腐病病原菌的體內抑制作用

芽孢桿菌在自然界中廣泛存在,其營養簡單、生長快,能忍受極端的外部環境而長期存活,是一種理想的生防微生物[14-15],并且在水稻[16]、小麥[17]、黃瓜[18]、辣椒[19]等農作物的采前病害的防治上顯現出很好的效果。本文中分離得到的晚熟桃褐腐病病原菌的致病性很強,常溫下5～7 d就能夠造成果實大部分腐爛,因此本文采用四種芽孢桿菌對其進行生物防治,以期為晚熟桃采前采后病害防治提供技術支撐。

桃果實接種褐腐病病原菌之后,隨著貯藏時間的延長,病斑逐漸增大。使用四種芽孢桿菌對其進行預防實驗時,大部分處理均能夠抑制褐腐病病斑擴展,具體結果如圖3所示。貯藏3 d時,拮抗菌B001提前預防天數對褐腐病病斑擴展的抑制率具有顯著性差異(p<0.05),貯藏6 d時,提前1 d和2 d預防顯著好于0 d預防(p<0.05),與對照相比0 d預防加速了褐腐病病斑的擴展;拮抗菌B1所有預防處理對褐腐病病斑擴展都有很好的抑制作用,其中提前1 d預防處理對褐腐病病斑擴展的抑制率顯著好于其他兩組(p<0.05);拮抗菌B579與B1一樣,所有預防處理對褐腐病病斑擴展都有很好的抑制作用,但平均抑制率高于B1菌,從貯藏3 d時實驗結果來看,提前0、1、2 d預防處理這三組之間差異顯著,貯藏6 d時提前1、2 d預防處理之間差異不顯著但抑制率顯著高于0 d預防處理;拮抗菌HB-2提前1、2 d預防處理顯著好于提前0 d預防處理,提前0 d預防處理對晚熟桃褐腐病病斑的擴展沒有抑制作用,甚至在貯藏前期加速了病斑的擴展(p<0.05)。綜上所述,四種芽孢桿菌除了個別處理均能夠顯著抑制晚熟桃采后褐腐病病斑的擴展速度,其中提前1、2 d預防處理好于提前0 d預防處理,這說明四種芽孢桿菌對晚熟桃核盤菌病原菌具有較強的活體抑制作用。

芽孢桿菌抑菌的作用機制多種多樣,主要包括競爭作用、拮抗作用、溶菌作用、誘導植物產生抗性及促進植物生長5個方面[20-22]。分析本文中芽孢桿菌抑制機理可能是由于預防處理接種的芽孢桿菌能在晚熟桃上提前繁衍和定殖,形成競爭優勢,從而抑制了后來接種的褐腐病病原菌的生長。不過實驗中發現不同的芽孢桿菌提前預防天數對褐腐病的抑制效果也具有一定的差異性,這可能與不同芽孢桿菌在果實活體上的生長特點,以及對褐腐病的抑制能力不同所致,具體原因還需進一步的研究及驗證。

2.5 四種芽孢桿菌不同時間預防處理對晚熟桃品質的影響

晚熟桃貯藏過程中品質逐漸下降,尤其是感染褐腐病之后品質下降更為明顯。接種病原菌后貯藏6 d時對晚熟桃品質進行測定結果如表2～表5所示,四種芽孢桿菌提前1、2 d預防處理組的晚熟桃VC含量,除了B1提前2 d預防處理組,均顯著高于對照組(p<0.05),尤其是提前2 d預防時,對照組VC含量下降到(2.64±0.22) mg/100 g,而B579處理組VC含量為(4.10±0.34) mg/100 g;四種芽孢桿菌提前1、2 d預防處理組的晚熟桃可溶性固形物含量,均顯著高于對照組(p<0.05),HB-2提前2 d預防可溶性固形物含量為(13.17±0.11) mg/100 g,對照組可溶性固形物含量為(8.46±0.71) mg/100 g;四種芽孢桿菌提前2 d預防處理有利于抑制晚熟桃可滴定酸含量的下降,其他兩組處理對可滴定酸含量的影響與對照相比沒有顯著性差異,提前2 d預防時,B579處理組可滴定酸含量是對照組的1.40倍;四種芽孢桿菌,除了HB-2同時接種褐腐病提前0 d處理外,預防處理組都能夠顯著抑制晚熟桃硬度的降低(p<0.05),B579提前0、1、2 d預防處理組晚熟桃的硬度分別是對照組的1.33、1.49、1.76倍。四種芽孢桿菌提前預防處理對晚熟桃品質保持產生一定的積極作用,這主要是由于提前預防處理能夠有效抑制褐腐病病斑的擴展,進而保證了晚熟桃的品質。這與劉璐[23]、肖嫩群[24]等的研究認為芽孢桿菌能夠提高果蔬的產量和品質的研究相一致。

表2 四種芽孢桿菌不同時間預防處理 對晚熟桃VC含量的影響Table 2 Effect of four species of Bacillus prevention deals time on VC content of peach

注:同列中不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);表3～表5同。

表3 四種芽孢桿菌不同時間預防處理 對晚熟桃可溶性固形物含量的影響Table 3 Effect of four species of Bacillus prevention deals time on soluble solids content of peach

表4 四種芽孢桿菌不同時間預防處理 對晚熟桃可滴定酸含量的影響Table 4 Effect of four species of Bacillus prevention deals time on titratable acid content of peach

表5 四種芽孢桿菌不同時間預防處理對晚熟桃硬度的影響Table 5 Effect of four species of Bacillus prevention deals time on hardness of peach

3 結論

通過對晚熟桃果實貯藏期褐腐病病原菌的分離、鑒定,首次發現核盤菌屬(Sclerotinia)病原菌能夠導致晚熟桃果實貯藏期的腐爛。在實驗中多次重復回接過程中發現,該病原菌對晚熟桃的侵染力很強,有傷和無傷接種,均可侵染,且傷口越大侵染發病越快,越重;通過病原菌形態學鑒定和18S-rDNA相結合的手段,明確了晚熟桃采后褐腐病病原菌為子囊菌門(Ascomycota),柔膜菌目(Helotiales),核盤菌科(Sclerotiniaceae),核盤菌屬(Sclerotinia),這為進一步研究該病害的流行和防治提供了科學依據。

本研究中所采用的四種芽孢桿菌B001、B1、HB-2、B579在晚熟桃活體接種實驗中對褐腐病均具有較好的抑菌效果,B579所有處理整體上對晚熟桃褐腐病病斑擴展的抑制率最大,抑制效果最為明顯,其中B001提前1 d和2 d預防顯著好于0 d預防(p<0.05);B1提前1 d預防處理對褐腐病病斑擴展的抑制率顯著好于其他兩組(p<0.05);B579提前1、2 d預防處理對褐腐病的抑制率顯著高于0 d預防處理;HB-2提前1 d預防顯著好于其他兩組(p<0.05)。同時四種拮抗菌對于晚熟桃的VC含量、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、硬度的降低均表現出較好的抑制作用。本研究能夠為晚熟桃采后病害的生物防治提供技術支撐,促進晚熟桃產業的發展。

本研究是在外部環境穩定的條件下,通過接種病原菌的方式來研究拮抗菌對少量單個晚熟桃褐腐病的抑制作用,但是對于在自然環境下,受外部環境的影響,能夠導致晚熟桃采后腐爛的病原菌并不是唯一的,同時拮抗菌的處理方式也要有所不同,那么這些因素是否會對拮抗菌的抑菌能力產生影響,都仍需進一步研究驗證。

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