河蜆多肽螯合亞鐵的制備工藝研究

劉晶晶,徐蘊桃,周 蓉,程潤青,孫媛媛,王 娟,杜瑜欣

(常熟理工學院生物與食品工程學院,江蘇常熟 215500)

河蜆(Corbiculafluminea),又稱黃蜆、金蚶、扁螺等,是雙殼類軟體動物,是我國重要的經濟貝類之一。研究表明,河蜆肉中含有大量的蛋白質(干樣中粗蛋白含量達66%以上)[1]、多糖等多種營養物質,利用酶水解河蜆蛋白質,可制備低分子肽和氨基酸。由于微量元素與具有特殊生物活性的短肽螯合后,提高了微量元素的吸收率,而且螯合物的抗氧化和抗菌功能也增強。因此,利用短肽與人體所需微量元素制備螯合物受到越來越多學者們的關注。曹銀娣等[2]對米蛋白肽螯合鐵的條件進行了優化,確定了最佳螯合工藝條件,發現螯合產物的抗氧化和抗菌功能特性提高了；張亞麗等[3]以豆粕酶解液為原料,對多肽絡合亞鐵的合成工藝條件進行了初步研究；鄧尚貴等[4]研究了低值魚蛋白多肽-鐵螯合物,研究發現,多肽亞鐵作為一種有機鐵,相對于無機鹽形式的鐵元素更容易被動物體吸收。鄭炯等[5]分別將血紅蛋白源多肽螯合鐵、葡萄糖酸亞鐵、氯化亞鐵以相同劑量灌輸給幾組缺鐵的白鼠,研究發現,補充血紅蛋白源多肽螯合鐵組的小鼠血液中血紅細胞和鐵含量最高。Mimura等[6]進行了甘氨酸亞鐵螯合對缺鐵病人的治療效果。Maria等[7]報道了肉類水解物中的肽類能使亞鐵離子的可溶性、吸收率提高。

目前補鈣、補鐵和補鋅劑的研究現狀,急需研究開發新一代吸收效率高、無毒副作用的微量元素補充劑。本文以河蜆肉為研究對象,利用蛋白酶進行水解得到多肽,再研究河蜆多肽與亞鐵離子螯合的最佳工藝條件,為開發新型的微量元素補充劑提供理論依據,同時拓寬河蜆的深加工途徑、提高河蜆產品的品質和附加值,實現河蜆的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

河蜆肉 江蘇省宿遷市楠景水產食品生產公司；中性蛋白酶(U≥60000 U/g);無水乙醇、雙硫腙、鹽酸、硫酸亞鐵、二甲酚橙、EDTA-2Na、溴化鉀 均為分析純。

HH.S11-2-S型恒溫電熱水浴鍋 上海市新苗醫療設備公司；BCD-216TDXZA型超低溫冰箱 青島海爾股份有限公司；ALPHA1-4型冷凍干燥機 德國MARTIN CHRIST公司；EL104型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；722可見分光光度計 上海市菁華科技儀器設備制造有限公司；DL-5-B型離心機 上海市安亨科學儀器制造有限公司；DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器 常州市萬合儀器制造有限公司；高速組織搗碎機 上海市比朗儀器制造有限公司；pHS-2F型數字pH計 上海市精密科學儀器制造有限責任公司； NICOLET 380型傅立葉變換紅外光譜儀 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 河蜆多肽的制備 按照參考文獻[8]的方法制備,速凍河蜆肉于常溫的流水下解凍,添加2倍的純凈水在12000 r/min的高速組織搗碎機中進行勻漿,在勻漿液中加入河蜆肉質量3.76%的中性蛋白酶,于55.36 ℃的水浴中酶解4 h,酶解完成后煮沸20 min,冷卻后以4000 r/min的轉速進行離心30 min,上清液在-20 ℃溫度下進行冷凍干燥10 h,即得河蜆多肽,冷藏待用。

1.2.2 河蜆多肽亞鐵螯合的單因素實驗 準確稱取1.2.1制備的河蜆多肽,配制濃度為10 mg/mL,河蜆多肽溶液與一定量的硫酸亞鐵在不同的pH和溫度條件下螯合,用磁力攪拌的方式構建螯合環境,螯合結束后,在4000 r/min的條件下離心20 min,加入無水乙醇洗滌直至雙硫腙檢測上清液不變色(4～5次左右),分別測定螯合率,考察各因素對螯合率的影響。

1.2.2.1 pH對螯合反應的影響 河蜆多肽濃度為10 mg/mL,選定多肽與亞鐵離子質量比為2∶1,在30 ℃下螯合45 min,改變多肽溶液pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,螯合結束后,測定其螯合率,從而篩選最合適的pH。

1.2.2.2 多肽與亞鐵離子的質量比對螯合反應的影響 河蜆多肽濃度為10 mg/mL,選定pH為6.0、螯合時間45 min及螯合溫度30 ℃,改變多肽與亞鐵離子的質量比分別為1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1,螯合結束后,測定其螯合率,從而篩選最合適的質量比。

1.2.2.3 時間對螯合反應的影響 河蜆多肽濃度為10 mg/mL,選定pH為6.0、多肽與亞鐵質量比2∶1及30 ℃螯合溫度條件下,改變螯合時間,設定為15、30、45、60、75 min,螯合結束后,測定其螯合率,從而篩選最合適的螯合時間。

1.2.2.4 溫度對螯合反應的影響 河蜆多肽濃度為10 mg/mL,在pH為6.0、多肽與亞鐵離子質量比2∶1及螯合時間45 min條件下,改變螯合溫度為15、30、45、60、75 ℃,螯合結束后,在4000 r/min的條件下離心20 min,測定其螯合率,從而篩選最合適的螯合溫度。

1.2.3 響應面實驗優化河蜆多肽-亞鐵的螯合工藝條件 根據單因素實驗結果,以pH(A)、多肽與亞鐵離子質量比(B)、時間(C)和溫度(D)為自變量,螯合率為響應值(Y),運用Box-Behnken實驗的設計原理,設計多肽-Fe2+螯合的響應面分析實驗,其編碼水平和因素見表1。

表1 響應面實驗因素與水平Table 1 Factors and level of experiment by response surface

1.2.4 傅立葉紅外光譜分析 分別取適量固體樣品河蜆多肽和多肽亞鐵螯合物1～1.5 mg,加入干燥好的KBr做稀釋劑,樣品與溴化鉀的比為1∶200,放進瑪瑙研缽中,在瑪瑙研缽里進行研磨,直至樣品粒子成細小而均勻狀態,再壓至透明薄片,將薄片放入樣品架,用傅立葉變換紅外光譜儀在4000～400 cm-1光譜范圍進行掃描,得到兩組光譜,進行定性分析。

1.2.5 螯合率的測定 游離亞鐵離子采用鄰二氮菲法[9]測定。螯合率按式(1)進行計算:

螯合率(%)=(亞鐵離子總量-游離亞鐵離子含量)/亞鐵離子總量×100

式(1)

1.3 數據處理

所有實驗均3次重復,用 Microsoft Excel進行數據整理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 pH對螯合反應的影響 從圖1可看出pH過高或者過低均不利于螯合反應。當pH4.0～6.0時，反應螯合率逐漸升高，當pH為6.0時,反應中的螯合率最大,為80.81%,而pH為 7.0時螯合率卻驟然下降,只有71.85%。主要由于反應體系中若pH過低時,溶液中氫離子與供電子基團結合而不與金屬離子結合,使螯合率較小[10]；但若反應體系中的pH過高,溶液呈堿性,螯合體系中存在較多的氫氧根離子,Fe(OH)2極易與Fe(OH)3發生轉變,生成不溶性沉淀。因此,選擇pH6.0為螯合反應的較適pH。

圖1 pH對螯合率的影響Fig.1 Effect of pH on ability of chelation

2.1.2 多肽與亞鐵離子的質量比對螯合反應的影響 由圖2可知,螯合率隨著質量比的增加先升高后逐漸趨于穩定。當質量比為2∶1時,螯合率最大值達83.43%；而當質量比繼續增大,螯合率增加緩慢,沒有顯著性差異。主要是由于質量比過小時,河蜆多肽的量不足,與亞鐵離子不容易形成環狀配合物；而質量比過大時,可供螯合的亞鐵離子量不足而河蜆多肽剩余量增多,螯合達到飽和,螯合率趨于平穩。因此,選擇多肽與亞鐵離子質量比為2∶1。

圖2 多肽與亞鐵離子質量比對螯合率的影響Fig.2 Effect of peptide/ferrous ions ratio on ability of chelation

2.1.3 時間對螯合反應的影響 由圖3可知,在15～45 min內,螯合率隨時間的增加而增大。當時間為45 min時,螯合率最高,為82.45%。繼續延長時間,螯合率呈緩慢下降趨勢。這與邱冬玲等[11]的研究報道是一致的,蛋白肽與微量元素螯合的反應速度都比較快,一般45 min內可以完成。因此,選定為45 min為河蜆多肽與亞鐵離子螯合的較適時間。

圖3 螯合時間對螯合率的影響Fig.3 Effect of time on ability of chelation

2.1.4 溫度對螯合反應的影響 從圖4可以看出,溫度從15 ℃增加到30 ℃時,螯合率從66.67%迅速上升至83.04%；在30～75 ℃之間,螯合率呈下降趨勢。由此看出適宜的溫度能夠提高螯合率,這是因為螯合過程是放熱過程[12],偏高或者過低的溫度都不會有利于螯合反應。因此,本實驗的螯合溫度控制在30 ℃為宜。

圖4 螯合溫度對螯合率的影響Fig.4 Effect of temperature on ability of chelation

2.2 響應面優化實驗

使用響應面軟件對pH、質量比、時間和溫度設計4因素3水平實驗,共進行29組實驗,實驗方案及結果見表2。對29個實驗點的響應值進行回歸分析,反應中pH、質量比、時間和溫度對河蜆多肽亞鐵離子螯合影響的顯著性檢驗及方差分析的結果見表3。

表2中的實驗數據利用Design Expert 8.05b軟件進行處理,得到河蜆多肽-Fe2+螯合物得率(Y)對pH(A)、質量比(B)、時間(C)和溫度(D)的二次回歸模型方程如下:Y=+85.56-0.18A-4.94B+3.94C-2.90D+3.96AB+1.56AC+6.02AD+5.94BC-2.05BD-13.05CD-16.95A2-5.54B2-8.56C2-23.06D2

表2 響應面實驗結果Table 2 Experimental results of response surface

表3 回歸方程的顯著性檢驗及方差分析Table 3 Analysis of variance and significance test of regression equation

注:表3中“E”為科學計數法,例:3.100E-003=3.10×10-3；p<0.001,極其顯著,用“**” 表示；p<0.05,顯著,用“*” 表示。

表3中失擬項p>0.05,不顯著,在模型中的p<0.05,方程的相關系數R2=0.9247,說明擬合程度較好,因此模型可用于分析河蜆多肽與Fe2+螯合工藝。因此模型中的回歸方程對河蜆多肽亞鐵的螯合率具有顯著性,四個因素對螯合率大小的影響順序為:質量比>時間>溫度>pH,其中交互因素中螯合時間(C)和螯合溫度(D)的交互作用對螯合率的影響是顯著的(p<0.05),其響應面和等高線圖見圖5。

圖5 螯合溫度與反應時間及其相互作用 對螯合率影響的響應曲面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots showing the effect of temperature and time and their mutual interaction on ability of chelation

圖5反映出了兩因素間的交互作用對螯合率的影響情況,顯示反應時間越長螯合率越高,當反應時間為46 min,螯合溫度為27～33 ℃內時出現峰值,整個圖形呈現上升趨勢并且其坡度較為陡峭,表明螯合溫度與反應時間的相互作用能顯著影響螯合率,所以控制一定的螯合溫度與反應時間可以達到較理想的螯合率。通過Design Expert8.05b軟件對數據進行處理后,得出的最優條件為pH5.84,質量比為1.5∶1,螯合時間為41.24 min,螯合溫度為30.57 ℃,響應面模型預測出螯合率為82.40%。

2.3 驗證實驗

根據方案實施的可操作性,并綜合考慮以上各種因素之間的相互作用,將最優方案工藝參數修正為pH6.0,質量比為1.5∶1,時間為41 min,溫度為31 ℃,以此條件再進行三次平行實驗,測得的螯合率為81.63%±0.43%,與預測值相比誤差為0.77%。因此,利用響應曲面法預測得到的優化工藝比較合理。

2.4 紅外光譜分析

分別對河蜆多肽與河蜆多肽-亞鐵螯合物兩種物質用傅立葉紅外光譜儀進行紅外光譜分析,得出紅外光譜圖,如圖6、圖7所示。

圖6 河蜆多肽的紅外光譜圖Fig.6 IR spectra of Corbicula fluminea peptides

圖7 河蜆多肽亞鐵螯合物的紅外光譜圖Fig.7 IR spectra of Corbicula fluminea peptides chelated ferrous ions

由圖6和圖7可以看出,河蜆多肽與亞鐵離子形成螯合物后,一些吸收峰的位置變化較為明顯。在特征區,河蜆多肽在3419.32 cm-1處的吸收峰是由于N-H的伸縮振動引起的,與Fe2+螯合后則移至3416.27 cm-1,向短波位移動,且吸收峰加強,因此可以判斷河蜆多肽中的氨基參與了亞鐵的螯合[13]。多肽亞鐵螯合物的紅外光譜圖中的C=O吸收峰由1657.63 cm-1位移至1647.13 cm-1,吸收強度也隨之發生了明顯的變化,這可能是河蜆多肽螯合亞鐵離子后,伸縮振動和變角振動等受到了遏制[14]；而且,河蜆多肽紅外光譜圖中的C=O反對稱振動峰在1400.88 cm-1處,而河蜆多肽螯合亞鐵的C=O面內搖擺吸收峰消失,說明Fe2+與羧基進行了結合[15]。由此可以說明河蜆多肽中的氨基和羧基參與了螯合反應,進一步說明河蜆多肽和亞鐵離子螯合生成河蜆多肽-Fe2+螯合物。

3 結論

本實驗以河蜆肉作為研究對象,將制備的河蜆多肽與亞鐵離子螯合,在單因素實驗基礎之上,采用響應面分析軟件獲得河蜆多肽-Fe2+螯合物的最佳螯合工藝條件為:pH6.0,多肽與Fe2+質量比為1.5∶1,反應時間為41 min,溫度為31 ℃,測得螯合率為81.63%,與預測值相比誤差為0.77%。利用響應曲面法預測得到的優化工藝參數比較合理,具有實用價值。通過對比分析河蜆多肽和多肽亞鐵螯合物的紅外光譜圖,發現河蜆多肽的氨基和羧基均發生了配位反應,確定多肽和亞鐵離子間進行了螯合。

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