液相色譜-原子熒光光譜法分析測定水產動物及其制品中不同形態汞的含量

王林裴,周迎春,鄭亞哲,華向美,彭新然,*

(1.漯河出入境檢驗檢疫局,河南漯河 462000;2.北京啟迪桑德環境資源股份有限公司,北京 101102)

汞是一種常見的污染物,它可以在微生物的甲基化作用下轉化為甲基汞。汞化合物的毒性依賴于其濃度及化學形態,烷基汞的毒性比芳基汞和無機汞大,甲基汞是毒性最強的汞化合物之一[1]。甲基汞通過食物鏈可以危害人體健康,對人體中樞神經系統造成不可逆的損害[2-3]?；诠螒B毒性的差異[4-5],僅測定食品中的總汞含量已遠不能滿足評價汞毒性的需求,并且農業行業標準NY 5073-2006 《無公害食品:水產品中有毒有害物質限量》[6]要求所有水產品甲基汞含量不得大于0.5 mg/kg。因此采用高靈敏度的形態分析測定方法測定食品中的汞含量非常必要[7-8]。

食品中汞的形態分析也是近年來研究的熱點問題。目前汞形態分析主要有氣相色譜-質譜法(GC-MS)[9]、高效液相色譜與紫外檢測器聯用法(HPLC-UV)[10]、高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用(HPLC-ICP-MS)[11-14]等技術。但是氣相色譜法需要將汞衍生化處理成氣態化合物,經過萃取才可上機測定,過程繁瑣;HPLC-UV對流動相要求較高,且消耗有機物量很大,靈敏度較低;HPLC-ICP-MS雖然檢出限較低,精密度高,但是儀器成本及維護費用較高,沒有得到普遍應用。而液相色譜與原子熒光聯用[15-16]技術不僅具有檢出限低、重現性好、穩定性高等優點,而且成本較低,故可得到廣泛應用。本文主要通過摸索嘗試,建立合適的樣品提取、凈化的前處理方法,以減少雜質對測定的干擾因素。同時對高效液相色譜條件、形態分析預處理裝置和原子熒光的工作條件進行優化,建立適用于水產動物及其制品中不同形態汞的分離檢測方法,為今后汞形態測定分析研究提供方法依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲基汞(MeHg)標準品(65.5 μg/g)、乙基汞(EtHg)標準品(76.4 μg/g) 中國計量科學研究院;二價汞(Hg2+)標準溶液(10 μg/mL) 安捷倫科技有限公司產品;L-半胱氨酸(優級純)、醋酸銨(優級純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、氨水(分析純) 漯河市源匯區雙豐化學試劑經營部；另外實驗所用容器使用前均用25% HNO3溶液浸泡過夜。

液相色譜-原子熒光聯用儀(LC-AFS) 液相色譜儀包括液相色譜泵和手動進樣閥;AFS-933原子熒光光譜儀、SA-20形態分析預處理器 北京吉天儀器有限公司;AF-2汞空心陰極燈 北京有色金屬研究總院;Milli-Q Element超純水儀 美國Millipore公司;KQ5200DE超聲清洗儀 中國昆山超聲儀器有限公司;EPPENDPRF～5810R型超高速冷凍型離心機 德國艾本德公司;PHS-3C酸度計 上海雷磁儀電科學儀器股份有限公司;AB265-S型分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制 甲基汞(MeHg)、乙基汞(EtHg)標準儲備液:標準溶液分別轉入10 mL容量瓶配制成10 μg/mL的標準溶液,避光保存在4 ℃冰箱中。無機汞(Hg2+)標準儲備液:取適量標準溶液,以2%硝酸逐級稀釋成濃度為10 μg/mL的標準儲備液?；旌蠘藴手虚g液:分別移取適量的MeHg、EtHg、Hg2+標準儲備液,用流動相(5%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨+0.1% L-半胱氨酸)逐級稀釋成濃度為1.0 μg/mL的汞多形態混合標準溶液。標準曲線的配制:將配制好的三種形態汞標準溶液中間液用流動相逐級稀釋,配制成實驗所需要的0.0、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 ng/mL的混合標準溶液系列,現用現配。

1.2.2 色譜條件的優化

1.2.2.1 流動相的選擇 配制兩種不同的流動相,分別為5%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨+0.1% L-半胱氨酸和5%的乙腈+0.06 mol/L乙酸銨+0.1% L-半胱氨酸兩種流動相,采用Athena C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),均調節pH為7.00,流速=0.8 mL/min,進樣量:100 μL,柱溫:25 ℃,原子熒光工作條件見1.2.3(HCl濃度:7.0%;KHB4溶液濃度:2.0%),用這兩種流動相作對比,重復進樣以選擇最佳流動相。

1.2.2.2 流動相pH的選擇 分別配制不同pH的5%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨+0.1% L-半胱氨酸溶液,流速=0.8 mL/min,進樣量:100 μL,柱溫:25 ℃,原子熒光工作條件如1.2.3(HCl濃度:7.0%;KHB4溶液濃度:2.0%),重復進樣,比較3種不同汞形態的分離效果。

1.2.2.3 流速的選擇 流動相:5%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨+0.1% L-半胱氨酸(pH=7.01),進樣量:100 μL,柱溫:25 ℃,原子熒光工作條件如1.2.3(HCl濃度:7.0%,KHB4溶液濃度:2.0%),只改變流速(分別設置為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min),觀察儀器響應值,重復進樣從而優化選擇。

1.2.2.4 進樣體積的優化 流動相:5%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨+0.1% L-半胱氨酸(pH=7.01),流速:0.8 mL/min,柱溫:25 ℃,原子熒光工作條件如1.2.3(HCl濃度:7.0%,KHB4溶液濃度:2.0%),依次用20、40、60、80、100、120、140、150 μL混標溶液進行測試,重復進樣觀察其信號響應情況,選擇最佳。

1.2.3 原子熒光光譜條件的優化

1.2.3.1 還原劑(KHB4)濃度的選擇 流動相:5%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨+0.1% L-半胱氨酸(pH=7.01),進樣量=100 μL,柱溫:25 ℃,流速:0.8 mL/min,配制0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%濃度梯度的KHB4溶液,載流(HCl)濃度為7.0%,負高壓:300 V,Hg燈總電流:35 mA,載氣流速:300 mL/min,屏蔽氣流速:500 mL/min，觀察原子熒光強度變化情況以選擇適宜KHB4濃度。

1.2.3.2 載流(HCl)濃度的選擇 色譜條件與原子熒光工作條件均與1.2.3.1相同(還原劑KHB4濃度=2.0%),改變HCl溶液的體積分數(3.0%、5.0%、7.0%、9.0%、12%、15%),觀察原子熒光強度變化情況,以選擇適宜濃度。

1.2.4 樣品前處理 稱取樣品0.800 g于50 mL塑料離心管中,加入10 mL 5 mol/L的HCl溶液在30 ℃水中超聲90 min。將溶液進行過濾后取上清液1.0 mL,用3 mol/L的NaOH溶液調節pH使之在6.0～7.8范圍內,稀釋適當倍數(加入濃度為0.1% L-半胱氨酸),用0.22 μm的濾膜過濾,然后上機測定。按同一操作方法作空白實驗。

1.3 數據處理

數據分析用液相色譜原子熒光光譜聯用儀數據工作站進行曲線擬合(外標校正),實驗中每次數據測定均重復測量三次,采用Excel軟件進行數據的顯著性分析,應用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相的選擇 由于使用C18反相色譜柱,流動相中需要加入有機溶劑,但高有機負荷可能導致分析時信號不穩定,實驗中選用5.0%的甲醇+0.06 mol/L乙酸銨+0.1% L-半胱氨酸和5.0%的乙腈+0.06 mol/L乙酸銨+0.1% L-半胱氨酸兩種流動相做對比,發現用甲醇作流動相時,柱壓小于15 MPa,比較穩定,且出峰效果好,因此選用甲醇做有機溶劑參與流動相。加入少量的L-半胱氨酸來確保汞的洗脫效率,同時可以較好地消除離子型Hg的記憶效應[17]。

2.1.2 流動相pH的選擇 本實驗考察了流動相的pH對三種汞形態的分離度、保留時間、響應值等的影響。結果表明:pH在4.98～7.68時,對汞形態的分離度、保留時間影響不大,當流動相pH為7.01時,儀器響應值相對較高,如圖1所示。因此選擇實驗時流動相的pH為7.01。

圖1 pH對三種汞形態分離效果的影響Fig.1 The influence of pH on the separation of three mercury species注:a:pH=4.98;b:pH=7.01;c:pH=7.68。

2.1.3 流速的選擇 實驗通過設置不同流速,考察了流動相流量對分離效果的影響。實驗結果表明,隨著流速的增大,三種汞形態在色譜柱中的保留時間有所減小,而儀器的響應值變化幅度不大,將流速較低時的柱壓與流速較高時的柱壓進行對比分析,差異性較為顯著(p<0.05,F>F crit),如圖2和3所示,柱壓較高不利于延長色譜柱壽命。綜合考慮,實驗選擇0.8 mL/min作為最佳流速。

圖2 流速與柱壓關系Fig.2 The relationship between flow rate and column pressure

圖3 流速與響應值關系Fig.3 The relationship between flow rate and response value

2.1.4 進樣體積的優化 進樣量主要影響儀器的響應值,如圖4所示。隨著進樣量的增加,熒光強度也會逐漸增強,達到100 μL時,熒光強度變化明顯,之后雖有增加但不明顯,對分析測定來說,100 μL已經適用,過多可能會造成系統污染對結果不利。

圖4 進樣量對熒光強度的影響Fig.4 The influence of injection volume on fluorescence intensity

2.2 原子熒光光譜條件的優化

2.2.1 還原劑(KHB4)濃度的選擇 分別配制不同濃度的KHB4溶液,觀察其對原子熒光強度的影響。結果表明,當KHB4的濃度為2.0%時,汞形態能夠獲得較高的熒光信號,且精密度較高;濃度低于2.0%時,氫氣產生量較少,單位體積內帶入的樣品比較少,使信號響應值偏低;濃度較高時,產生的氫氣會對樣品造成稀釋,同樣會影響熒光信號,降低儀器穩定性,還原劑濃度對熒光強度的影響如圖5所示。因此,實驗選用2.0%的KHB4為最佳濃度。

圖5 KHB4濃度與熒光強度關系Fig.5 The relationship between the concentration of reducing agent and the fluorescence intensity

2.2.2 載流(HCl)濃度的選擇 分別考察了不同濃度HCl對原子熒光強度的影響。結果表明,濃度低于7%時,不能提供足夠的氫離子,不利于生成穩定的氫化物,可能會造成此反應過程的中斷,對檢測有較大的影響。濃度較大時,熒光強度值不穩定,甚至會降低,而當體積分數為7.0%時,三種汞形態的熒光信號響應值較大,效果較好,如圖6所示。

表2 精密度結果Table 2 The precision results

圖6 HCl濃度與熒光強度關系Fig.6 The relationship between HCl concentration and fluorescence intensity

2.3 汞形態分離圖譜

按照1.2.2所設置的儀器條件對三種形態的汞混合標準溶液(10 ng/mL)進行分離檢測,分離效果圖譜如圖7所示?？梢钥闯?三種不同的汞形態在14 min內實現分離,并且分離效果十分理想,Hg2+、MeHg、EtHg的保留時間分別為4.56、6.83和12.85 min。

圖7 三種汞形態的混合標準溶液(10 ng/mL)色譜圖Fig.7 Chromatogram of mixed standard solution of three mercury species(10 ng/mL)

2.4 線性方程與檢出限、定量限

通過實驗驗證,可以得知在1～100 ng/mL范圍內,三種汞形態均可以呈現良好的線性關系。重新配制標準曲線(0～10 ng/mL),通過計算機軟件,進入數據處理界面,先載入校準表(即標準曲線),后讀進基線,由軟件自動分析結果計算得出三種汞形態的檢出限如表1,按照前面所述前處理方法計算得出檢出限分別為0.021、0.014、0.018 mg/kg。

表1 三種汞形態的標準曲線Table 1 The standard curves of three mercury species

注:線性方程中的C表示標準溶液的質量濃度,ng/mL,I表示熒光強度;檢出限按3倍信噪比計算,定量限按10倍信噪比計算。

2.5 精密度實驗結果

表3 不同樣品中三種Hg形態的加標回收率(ng/mL)Table 3 The recoveries of three mercury species in different samples(ng/mL)

注:N.D表示未檢出。

表4 標準參考物質的汞形態分析結果(mg/kg)Table 4 Detection results of three mercury species in standard reference substance(mg/kg)

注:N.D表示未檢出。由于在實際產品中不容易找到同時存在3種汞化合物的樣品,所以本實驗是對汞的混合標準溶液(10 ng/mL)用LC-AFS平行測定7次,利用標準曲線計算所測的濃度,以濃度和出峰面積來計算相對標準偏差(RSD),由表可知,3種汞形態都具有良好的穩定性,其RSD均小于5%。

2.6 加標回收實驗結果

選取市售活龍魚肉腸、扇貝、草魚、龍蝦、紫菜5種樣品,分別向其中添加三種不同濃度梯度(分別為5、20、100 ng/mL)的三種汞混合標準溶液,LC-AFS的分析結果見表3。

由表可知,三種汞形態的加標回收率分別在80.1%～95.8%,92.1%～105%,80.3%～97.6%。由此可見,在本實驗選定的實驗條件下,本研究選用的儀器條件和實驗方法的準確度和可靠性較高。

2.7 標準物質分析測定

用本實驗建立的方法對兩種魚肉組織標準物質BCR463和 ERM-CE464進行汞化合物測定以驗證本方法的準確性,結果見表4,平行樣測定結果在標準范圍內,兩種標準物質圖譜見圖8及圖9。由圖可以看出,色譜圖峰形較好,信號響應高,且不存在干擾雜峰,說明整個方法的提取和凈化效果比較好。

圖8 標準物質BCR463色譜圖Fig.8 Chromatogram of the standard material BCR463

3 結論

本文建立了酸消解—液相色譜—原子熒光法測定水產及其制品中汞形態的方法,在14 min內實現甲基汞、乙基汞及無機汞這三種不同的汞形態的分

圖9 準物質ERM-CE464色譜圖Fig.9 Chromatogram of the standard material ERM-CE464

離。在色譜條件及原子熒光光譜條件優化下,選擇5 mol/L HCl進行超聲萃取,Athena C18色譜柱分離汞形態化合物。根據建立的方法和優化條件以魚肉腸、扇貝、草魚、龍蝦、紫菜等5種樣品為基質進行加標回收實驗,回收率在80.1～105%之間,滿足分析要求;以兩種魚肉組織標準物質BCR463和 ERM-CE464為研究對象驗證方法的準確性,方法檢出限分別為0.021、0.014、0.018 mg/kg。平行樣品分析三種汞化合物的相對標準偏差(RSD)均小于5%(n=7),精密度良好。此方法前處理簡單、樣品提取率高,所使用設備成本較低,分離效果好,準確度高,適于水產品中汞形態的提取與定量分析要求。

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