食品中PCDD/Fs和dl-PCBs的 檢測方法研究進展

葉海云,俞國珍,張蓓蕾

(三門縣食品藥品檢測中心,浙江臺州 317199)

多氯代二苯并-對-二惡英(Polychlorinated dibenzo-p-dioxins,PCDDs)、多氯代二苯并呋喃(polychlorinated dibenzo-furans,PCDFs)和二惡英樣多氯聯苯(dioxin-like polychlorinated biphenyls,dl-PCBs)統稱為二惡英類化合物[1]。2001年5月,包括中國在內的150多個國家聯合簽署了《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》(簡稱《POPs公約》),PCDD/Fs和dl-PCBs成為首批列入受控名單的持久性有機污染物[2-4]。PCDD/Fs和dl-PCBs結構穩定、親油性強、難以降解,一旦它們進入水生環境,極易結合沉積物,由各種途徑進入食物鏈并會在生物體內富積[1,5-6]。二十世紀五十年代,二惡英首次被報道為食物鏈的重要污染物,PCDD/Fs和dl-PCBs進入人體的途徑主要有皮膚接觸、空氣吸入和食物攝入,其中,膳食攝入是最主要的進入途徑,占90%以上[7-9]。本文綜合了二惡英類化合物的致毒機理和幾種用于分析檢測二惡英類化合物方法的基本原理和優缺點,較系統地總結了國內外分析檢測的最新研究進展,并對我國開展二惡英類化合物的分析監測提出了建議和展望。

1 PCDD/Fs和dl-PCBs的分類、結構和來源

PCDDs包含75個同系物,PCDFs包含135個同系物,均為氯化合物[10],結構式如圖1所示。其中,在2、3、7和8位具有0～3個氯原子的PCDD/Fs同系物無明顯毒性,而含有4～8個氯原子的PCDD/Fs具有顯著的毒性[11]。210個PCDD/Fs中同系物中具有毒性的同系物只有17種(PCDDs占7種,PCDFs占10 種)[12]。毒性PCDD/Fs通過機體循環進入人們體內,常聚集在皮下、呼吸道和肝臟中,對機體的代謝產生巨大的影響,其中毒性最大為2,3,7,8-四氯二苯并-對-二惡英(TCDD)[10]。理論上多氯聯苯(PCBs)具有209個同系物,但只有12個PCBS在持久性和效果方面具有與PCDD/Fs相似的性質,稱之為二惡英樣多氯聯苯(dl-PCBs),其他PCBs被稱為非二惡英類多氯聯苯(ndl-PCBs),dl-PCBs具有至少4個氯原子,結構中兩個苯環可以采取共平面的位置,但被氯原子取代的臨位應為非氯原子取代基(如圖1)[4]。PCDD/Fs主要來源于含氯化學品制造、市政垃圾焚燒、三廢排放以及廢舊電子垃圾拆解焚燒等過程;dl-PCBs主要來源于商業多氯聯苯混合物的生產和使用,以及工業液體的泄漏及運輸過程中造成的滲漏,多氯聯苯混合物已經在20世紀70年代被禁止生產[9]。

圖1 二惡英(PCDDs和PCDFs)和PCBs的結構式Fig.1 Structural formulas of PCDD/Fs and PCBs

2 PCDD/Fs和dl-PCBs的致毒機理及限量標準

PCDD/Fs和dl-PCBs的毒性大,其在低濃度下也易對機體的健康產生巨大的影響,引發人類嚴重的生殖,免疫和神經系統問題,具有強致癌性、生殖毒性、內分泌干擾毒性、生物蓄積性和胚胎毒性[13]。多年的研究發現PCDD/Fs和dl-PCBs的致毒機制既不是對細胞產生直接損傷,也不是與蛋白質和核酸形成加合物,更不是對細胞核中的DNA產生直接損害,而是通過激活細胞中的芳香烴受體(AhR)和下游一系列的信號通路從而對人體產生毒害作用[14-16]。AhR本質是一種高分子量的蛋白質，生物體中一種配基依賴的轉錄因子,與二惡英類化合物具有極強的親和力,進入細胞質中的二惡英類化合物可以與細胞質內靜息態的AhR蛋白復合體相結合,被激活的復合體進入細胞核與AhR核轉運蛋白形成二聚體(AhR-Arnt),AhR-Arnt二聚體隨后與特異基因上的增強子結合,從而控制下游調控基因的轉錄和翻譯(如細胞色素CYP1A1、環氧酶-2等),最終導致廣泛的毒理和健康效應(神經毒性、致癌毒性、生殖毒性、內分泌干擾等)[14-15,17]。

通常情況下,PCDD/Fs和dl-PCBs以混合物的形式存在于自然環境、食物鏈和人體組織中。因此,為對二惡英類化合物的毒性效應做出合適的評價,世界衛生組織(WHO)提出采用毒性當量因子(TEF)來對PCDD/Fs和dl-PCBs的生物毒性做出估算、衡量和評價。WHO以毒性最大的TCDD的TEF值為基準1,其它二惡英類化合物以此標準折算以確定有毒同族體的毒性當量因子,研究對象總體的的毒性當量(toxic equivalencies,TEQ)即為所測樣品中各有毒同系物濃度與其毒性當量因子乘積的加和[1]。PCDD/Fs和dl-PCBs具有極強的親脂性和穩定性,一旦進入人體便很難被代謝排除,因此美國環保局(USEPA)認為不存在人類可以接觸二惡英的“安全水平”,任何接觸都可導致嚴重危害。WHO為確保人類健康安全對現有數據及調查報告進行重新評估,將人體二惡英的日允許攝取量(tolerable daily intake,TDI)從1998年的0.014-0.037 pg/g體重修改為0. 001-0. 004 pg/g 體重[18]。

3 PCDD/Fs和dl-PCBs的檢測方法

PCDD/Fs和dl-PCBs的定量檢測屬于多組分超痕量分析,是有機超痕量分析領域的一個難點:大多數情況下,PCDD/Fs和dl-PCBs以極微量形式存在于環境及生物體內,且其大量的同系物、異構體使得PCDD/Fs和dl-PCBs的分離較為困難,同時由于水產樣品中基質的干擾和分析時組分色譜峰交叉嚴重,使得二惡英化合物的分析過程極其復雜,對其檢測系統的特異性、選擇性和靈敏度要求極高[19]。目前,PCDD/Fs和dl-PCBs的主要分析方法有化學分析法(色譜分析法)和生物學分析技術(免疫學分析法和生物檢測法)。

3.1 化學分析法-色譜分析法

3.1.1 色譜分析法的基本原理及前處理技術 目前,色譜分析法是國際公認的分析檢測PCDD/Fs和dl-PCBs的標準方法。色譜法的原理是不同物質在不同相態具有不同的選擇性分配,由于物質在不同相中具有不同分配系數，因此，可通過流動相對固定相中的混合物進行分離洗脫,混合物中不同PCDD/Fs和dl-PCBs以不同的速度沿固定相移動,最終達到分離的效果。色譜法分析PCDD/Fs和dl-PCBs主要分為兩個階段:樣品前處理階段和色譜分析階段。通常情況下生物樣品中二惡英的含量均很低,實際樣品中復雜的基質及其他干擾物質量濃度明顯高于目標化合物,色譜分析法中各儀器精密性較高,因此對于樣品前處理的要求相對較高,樣品前處理的結果對檢測結果的準確性影響較大。PCDD/Fs和dl-PCBs測定樣品前處理主要分為4個步驟:樣品的采集、化合物提取、凈化及富集。樣品的提取和分離純化為最耗時也最為重要的兩個步驟。用于PCDD/Fs和dl-PCBs的提取的方法較多,主要有以下幾種:索氏提取、固相萃取、微波輔助萃取、加速溶劑提取、加壓流體萃取、超臨界流體萃取等[20-22],其中索氏提取是最為常用且提取率最高的方法,也是我國食品安全國家標準食品中二惡英及其類似物毒性當量的測定中首推提取PCDD/Fs和dl-PCBs的方法[23]。抽提后,樣品中的絕大部分PCDD/Fs和dl-PCBs進入提取液,同時生物樣品原有的多環芳烴、有機農藥、脂肪大分子等眾多干擾物質也跟隨PCDD/Fs和dl-PCBs混入了提取液,為確保PCDD/Fs和dl-PCBs檢測的準確性,需要通過一定的方法對提取液進行凈化,去除提取液中的干擾物質。目前常用的提取液凈化方法有:堿解、液-液分配、柱層析、濃硫酸磺化和氧化等[24]。經索氏提取并凈化后的提取液再采用多個不同色譜柱的方法進行相應的純化,得到的洗脫液用于進一步的色譜分離分析使用。

3.1.2 色譜分析

3.1.2.1 同位素稀釋-高分辨氣相色譜/高分辨質譜法(HRGC/HRMS) 同位素稀釋-高分辨氣相色譜/高分辨質譜法(Isotopedilution-HRGC/HRMS)是測定PCDD/Fs和dl-PCBs分析的“黃金標準法”[4,25],廣泛應用于環境樣品、生物樣品和食品中二惡英類化合物的檢測[26],是目前唯一具有法律效益的二惡英類化合物檢測方法,也是對痕量及超痕量濃度水平樣品中PCDD/Fs和dl-PCBs定性定量的最佳檢測方法。典型的國際和國家相關組織確定的二惡英標準分析方法[27]有:USEPA的EPA-8290、EPA-8280 和EPA-1613二惡英標準分析方法、日本的JISK-0311法以及我國環保部的HJ/T 77、HJ 650-2013二惡英標準分析方法。同位素稀釋EPA-1613法已經成為各實驗室的檢測基礎,同位素稀釋定量法是保證二惡英類分析數據準確性的關鍵。在樣品提取前定量加入13C 標記2,3,7,8-取代的二惡英毒性同類物,由于13C 標記物的化學性質與被分析組分的化學性質完全一致,因此樣品提取和凈化過程中的損失相同,樣品中二惡英含量根據13C內標物定量可以保證分析結果的準確性。Wang等[28]利用不分流注入模式和多離子監測(MID)方法，通過配備有DB-5MS毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)的HRGC/HRMS法分析了我國東南部舟山漁業中32種魚類中的十七種PCDD/Fs和十二個同位素dl-PCBs中毒性較大的同系物含量,發現不同魚類中PCDD/Fs和dl-PCBs的水平差異顯著在0.002～0.078 pg WHO-TEQ/g鮮重之間,分別為0.002～0.553 pg WHO-TEQ/g鮮重和0.003～2.059 pg WHO-TEQ/g鮮重。Squadrone等[12]利用HRGC/HRMS分析了來自意大利北部瓦雷澤湖鯰魚魚肌樣品中PCDD/Fs和dl-PCB含量,研究發現鯰魚樣品中總PCDD/Fs含量范圍為0.001～1.310 pg/g(w/w),總dl-PCBs含量范圍為0.031～21.000 pg/g(w/w)。HRGC/HRMS的優點是它可以對PCDD/Fs和dl-PCBs分別進行分離,分離效率高;并能夠對分離出的每種成分進行準確的定量,靈敏度高、分析速度快;且相對來說樣品用量較少,因而具有極其廣泛的應用范圍。但HRGC/HRMS法對儀器的精密性要求較高,因此樣品的前處理過程極為繁瑣,檢測時間較長,并且需要提供較為良好的實驗環境及專業人員進行相應的檢測工作,檢測成本較高。

3.1.2.2 氣相色譜-三重四級串聯質譜法(GC-MS/MS) 氣相色譜-三重四級串聯質譜法(GC-MS/MS)相對HRGC/HRMS法而言,對樣品前處理的要求較低,為簡化檢測步驟GC-MS/MS法也被廣泛的應用于對樣品PCDD/Fs和dl-PCBs的檢測[29]。GC-MS/MS法由于其相對簡單的樣品前處理過程,更好的選擇性和一定的靈敏度,目前已經得到了歐盟官方的認同[4]。代澎等[30]建立了可用于生活飲用水中20種PCBs的測定的GC-MS/MS測定方法,采用液液微萃取富集,離心分離,13C內標法定量,檢出限為0. 35～6.60 ng/L,定量限為1.04～19.7 ng/L,該方法優勢在于樣品處理簡單、快速、可靠,應用7種13C同位素內標物對樣品進行標記能夠降低基質的干擾,使目標物得到較好的分離,并且用GC-MS/MS檢測特征離子的二級離子,提高了靈敏度,增強了定性、定量的準確度。實際檢測過程中食品樣品基質對GC-MS/MS檢測限的干擾較大導致GC-MS/MS法靈敏度低于HRGC/HRMS法,所以GC-MS/MS法測定的PCDD/Fs和dl-PCBs的檢測限一般高于HRGC/HRMS法[31],。雖然GC-MS/MS法靈敏度略低于HRGC/HRMS法,但其選擇性優于HRGC/HRMS法,因此GC-MS/MS法比較適用于二惡英含量較高的樣品[32]。

3.1.2.3 正交分離系統全二維氣相色譜法(GC×GC) PCDD/Fs單體眾多,且dl-PCBs與PCDD/Fs物理化學性質極為相近,因此很難在一根色譜柱上實現所有單體的分離,單根色譜柱分離PCDD/Fs和dl-PCBs極容易出現各化合物共流出的現象。高靈敏度的正交分離系統全二維氣相色譜技術(GC×GC)方法分離檢測PCDD/Fs和dl-PCBs能夠在顯著提高柱效的同時防止化合物共流出現象的發生,它具有不同分離機制、不同極性且互相獨立的2支色譜柱,以串連的方式結合成二維氣相色譜。經第1支色譜柱分離后的每個餾分,再經調制器聚焦后以脈沖方式進入第2支色譜柱中進一步分離,通過溫度和極性的改變,實現氣相色譜分離特性的正交化。GC×GC方法利用多種色譜柱交叉使用的方法避免了傳統多維GC系統中復雜的色譜柱更換、重復進樣操作等操作帶來的不便,且可以連續出峰并確保彼此之間無重疊,減少分析化合物的時間,是一種快速分離技術[33]。De Boer等人利用GC×GC聯用電子俘獲檢測器系統地對美國兒童膳食中多種二惡英類化合物(90種PCBs和17種PCDD/Fs)進行檢測,發現可以從所得譜圖上鑒定出這些化合物中的所有同系物[34]。目前應用較多的組合為正交分離系統全二維氣相-飛行時間質譜聯用系統(GC×GC-TOF/MS),Hoh等通過GC×GC-TOF/MS檢測系統對魚油中二惡英類物質進行了相關檢測分析[35],通過檢測發現其分辨率穩定性低于HRGC/HRMS法,但該方法在進行全掃描檢測同時可啟動選擇離子掃描檢測,因此應用前景仍然比較樂觀。

3.1.3 色譜分析檢測法優缺點 色譜分析法儀器精密性較高,可分離樣品中二惡英類物質的每種成分,并準確定量痕量毒物,是對痕量及超痕量濃度水平樣品中PCDD/Fs和dl-PCBs定性定量的最佳檢測方法。但由于PCDD/Fs和dl-PCBs的同源物和異構體作為復雜混合物存在生物樣品中,化學分析法只能識別和量化可分離并且已知的標準化合物[36],由于檢測過程中需要相對應的標準品來對樣品中的二惡英類化學物質進行定性,而目前仍有部分化合物不具備相對應的標準品,因此色譜法只能對己知的二惡英類物質進行定性定量測定,無法確定樣品中PCDD/Fs和dl-PCBs真實總量，而且化學分析法分析過程中不能確定復雜混合物中化學物質之間的相互作用以及PCDD/Fs和dl-PCBs的生物效應[25]。

表1 色譜分析檢測法優缺點Table 1 The advantages and disadvantages of chromatographic analysis

3.2 生物學檢測法

3.2.1 生物學檢測法基本原理及分類 生物學檢測方法是依據PCDD/Fs和dl-PCBs單體進入生物細胞內與AhR結合的致毒機理而開發的靈敏度和檢出下限可達到或接近HRGC/HRMS水平的新方法,其原理是借助與二惡英具有特異性結合位點的抗體、受體、酶的識別機制,通過測定生物分子活化程度間接確定二惡英類化合物毒性當量。生物學檢測方法可分為免疫法(酶免疫分析法-EIA和熒光免疫分析法-DELFIA)和生物法(酶活力誘導法-EROD和熒光素酶報告基因法-CALUX)兩大類[37]。

3.2.2 免疫分析法

3.2.2.1 酶免疫分析法 酶免疫分析法是以抗原和抗體的特異性反應為基礎的分析方法,但免疫法中使用的抗體較難獲取且該法不能檢測所有的同系物。酶免疫分析法(EIA)是根據鼠單克隆抗體(DD3)與二惡英結合的特點而建立的競爭抑制酶免疫方法,檢測的基礎是結合在固相載體表面且具有免疫學活性的抗原、抗體以及既具有免疫學活性又具有酶活性的酶標記抗體。在測定過程中,以不同濃度二惡英為標準物質作出標準樣品的劑量-效應曲線,最終通過測定抗體與競爭酶的熒光強度反向獲取二惡英的TEQ,熒光強度與TEQ為反比關系[38-39]。EIA法具有操作簡便,一次可平行測定多個樣品的特點,而且開發出的價格低廉商品化的試劑盒可在采集樣品現場直接完成相關測定[40]。Tsutsumi等[41]利用酶免疫試劑盒與HRGC/HRMS測定魚類樣品中dl-PCB的TEQ濃度,發現酶免疫試劑盒可以識別魚類樣品中dl-PCBs的濃度臨界值為50pg TEQ/g,兩種方法所測結果相關性良好(r=0.92,n=26),因此酶免疫試劑盒有助于在HRGC/HRMS分析之前對大量的魚類樣品進行初步的篩選。但EIA法無法確定PCDD/Fs和dl-PCBs的生物效應且前期開發較為繁瑣,費用昂貴,測定PCDD/Fs和dl-PCBs時也需采取不同的EIA方法。與其他生物分析技術相比,EIA法表現出更大的分析特異性和對來自其他污染物的干擾的相對不敏感性[42-43]。Samara等[43]利用EIA法和HRGC/HRMS法對來自工業設施現場樣品中PCDDs/Fs及多溴二苯并對二惡英/呋喃(PBDDs/Fs)進行比較，發現基于EIA法樣品中測定的PCDDs/Fs的毒性當量高于HRGC/HRMS法0～4個數量級,而PBDDs/Fs的毒性當量高于HRGC/HRMS法0～1數量級,且在EIA和HRGC/HRMS數據之間沒有發現相關性,這可能歸因于同源物特異性交叉反應、樣品基質類型的差異以及在免疫測定中競爭抗體結合的其他化合物的存在的影響。

3.2.2.2 熒光免疫分析法 熒光免疫分析法(DELFIA)利用生物基因技術選擇出與樣品中PCDD/Fs和dl-PCBs相互競爭的單克隆抗體的抗原鍵合銪離子,反應完全后加入熒光增強液解離抗原中的銪離子至增強液中,增強液中形成的膠束銪離子能夠高效地發出熒光。用時間分辨熒光法技術排除非特異性熒光干擾后對鰲合物加以分析,獲取樣品中PCDD/Fs和dl-PCBs熒光值,其熒光強度與樣品中PCDD/Fs和dl-PCBs的TEQ成反比[44]。EIA法與DELFIA法相比并不需要細胞內誘導活化過程,從而大大提高了樣品中PCDD/Fs和dl-PCBs的檢測效率,并且檢測所得的TEQ值比較一致,但EIA法靈敏度相對DELFIA法較低。DELFIA法采用時間分辨熒光技術,可以消除非特異性熒光干擾,靈敏度大大提高。由于靈敏度提高,檢測所需試樣量少,因此大大降低了二惡英類物質檢測成本。Tatsuro Endo等[45]建立了酶放大微流控熒光免疫傳感器來檢測共平面PCBs(Co-PCBs),可以在30秒內確定樣品中Co-PCBs衍生物的濃度,Co-PCBs檢測的線性范圍從0.1 pg/mL至1.0 μg/mL(回歸分析提供了相關性系數r=0.982～0.964),重現性好、精度高。

3.2.3 生物分析法 生物分析法是依據二惡英的致毒機理,根據機體細胞對二惡英專一性反應或是生物分子對PCDD/Fs和dl-PCBs結構獨特的識別能力來對其進行相關測定。

3.2.3.1 酶活力誘導法 7-乙氧基-異吩惡哇酮-脫乙基酶(EROD)與PCDD/Fs和dl-PCBs的結合具有良好的時間-效應關系。PCDD/Fs和dl-PCBs與AhR結合活化后,AhR核轉位因子進入到細胞核內與AhR核轉位子蛋白再度結合并識別特定DNA片段,啟動發揮毒性的靶基因轉錄,激活EROD酶。通過測定EROD酶的活性,間接反映PCDD/Fs和dl-PCBs與AhR的結合能力,一定范圍內,EROD酶活與二惡英濃度呈線性關系[46]。相對來說,EROD法有利于篩選目的物質,得到更多關于激動劑和拮抗劑的信息支持,從而揭示未知的活性化合物[42]。馮忠孚[47]在檢測垃圾焚燒二惡英類化合物的檢測過程中,結合新型前處理柱對比EROD生物測試法和HRGC-HRMS法發現兩者檢測結果具有強相關性(R2=0.95),從而說明結合新型前處理柱的EROD生物測試法能夠得到與高分辨氣質儀器分析方法具有相近TEQ值的檢測結果,具有高靈敏度和高通量的特點,能夠以較低的成本快速篩查大量樣品,是一種極具發展潛力的二惡英類化合物檢測方法。

表2 生物學分析檢測法優缺點Table 2 The advantages and disadvantages of biological detection

3.2.3.2 熒光素酶報告基因法 熒光素酶報告基因法(CALUX)也稱為受體報告基因法,能夠特異性測定樣品中所有具有AhR 受體的化合物,AhR受體是TEQ的生物學基礎,因而CALUX靈敏度更高,檢測的線性范圍更寬,檢測時間更短,因此CALUX法更適用于健康評價[48]。Samara等[38]使用化學活化的熒光素酶基因表達細胞生物測定系統(CALUX)和基于抗體的方法酶免疫測定(EIA)來檢測幾種多溴、多氯、多溴/氯化二苯并對二惡英/呋喃的二惡英樣反應(PBDDs/Fs,PCDDs/Fs和PBCDDs/Fs),測試結果顯示溴化合物和混合的溴/氯化合物的生物活性類似于它們的氯化類似物。目前CALUX法較適合大量樣本靈敏的快速篩選,比傳統的HRGC/HRMS的成本低40%～70%,已被廣泛用于對多種環境介質、生物樣品和食品中二惡英的檢測[49-52],USEPA在2008年2月將CALUX生物測定法批準為二惡英檢測的替代方法[52-55]。由于CALUX法測定的是所有具有AhR受體的二惡英類物質,因此一般情況下CALUX法樣品測定結果高于化學分析法樣品測定的結果[53]。Vromman等[54]通過CALUX和GC-HRMS(比利時境內標準檢測法)兩種方法測定比利時境內食品基質(乳制品、雞蛋、魚、動物脂肪和植物油)中二惡英和二惡英樣多氯聯苯的污染數據,觀察到兩種方法之間的測定結果存在顯著差異,CALUX方法測得食物基質中的二惡英的中位數濃度約為GC-HRMS法二惡英的中位濃度的兩倍。由此可見,在比利時官方控制計劃框架內CALUX方法獲得的數據不能用于風險評估,特別是不能準確估計二惡英和二惡英樣多氯聯苯的膳食攝入量。這可以解釋為：一方面不屬于17種二惡英/呋喃的大量不同形狀的化合物和12種二惡英樣多氯聯苯同系物也與芳基烴受體(AhR)相結合。另一方面，該測定法被用于合規監測的篩選，其中需要通過最大水平強調方法性能，從而導致監測濃度的準確度不足。因此,實際應用時,可先用CALUX篩選檢測,再將篩選出的陽性樣品用化學分析法作進一步定性定量檢測。籍龍杰等[55]利用HRGC/HRMS和CALUX對42個垃圾焚燒飛灰樣品進行二惡英類化合物的分析,發現CALUX結果與HRGC/HRMS結果具有很好的線性相關性(R=0.96),并計算兩者的換算系數為0.332,最終可以利用快速檢測的結果和換算系數來推算出HRGC/HRMS的結果。

3.2.4 生物學檢測法優缺點 生物學檢測法是以現代分子生物學的研究成果為基礎，針對傳統儀器分析方法的缺點而發展起來的二惡英類化合物檢測技術。生物學檢測法因其操作簡便、靈敏度高、特異性強、設備簡單、成本低(分析成本降低50%以上)、測試周期短、可平行測試大量樣品等優點成為研究熱點[56]。美國、歐盟、日本等紛紛將生物學檢測方法推薦為二惡英類化合物檢測的指導方法及篩選方法[46]。盡管生物學檢測法測試周期短,適于快速、大規模樣品的篩選,但其無法鑒定生物樣品中二惡英化合物的種類,只能測定出混合物的總毒性當量。

4 展望

二惡英類化合物進入到機體后,可以隨著食物鏈逐步富積,對我國的食品安全及人們健康產生不利影響,因此，檢測食物中的二惡英類化合物尤為重要，常用的檢測方法有化學分析法和生物法，這兩種方法各有優缺點，并相互補充?；瘜W分析法具有準確可靠,可分離測定出二惡英化合物中物質單體,并準確定量痕量毒物單體TEQ數據等特點,但前處理過程復雜、消耗大量化學試劑和耗材,分析成本高、周期長、無法同時處理大量樣品,對儀器設備、實驗環境及人員配備要求較高,不能確定復雜混合物中化學物質之間的相互作用以及PCDD/Fs和dl-PCBs的生物效應。生物學檢測法一般用于大量樣品的篩選或含量較高樣品的測定以及無需對單體進行定量,檢測結果只能體現出總TEQ 數據,屬于半定量方法。生物學檢測法具有檢測周期短、操作簡單、低成本、高通量、能反映有毒物質對機體造成的生物影響的特點,但不能了解樣品中二惡英類化合物具體組成及單體TEQ數據,因此在處理具有爭議的結果時,仍須化學分析法進行確證。綜上所述,為加快推進PCDD/Fs和dl-PCBs監測防控進程,可通過以下幾個方面進行切入:

為確保我國食品安全及更精確快速的檢測出食品中二惡英類化合物含量,我國應盡快構建快速、靈敏、經濟的二惡英毒性檢測方法和制定食品中允許限量標準,并同步建立食品行業體系中獨立的二惡英類污染物檢測實驗室。

由于食品樣品基質較為復雜,應根據檢測樣品及檢測目的的不同,充分利用化學、生物學檢測法各自的優勢,構建適合于我國食品行業的二惡英污染物檢測評價體系。例如，低成本和高通量的生物檢測法可作為農畜及水產品中二惡英類化合物的檢測工具,精確的化學分析法則可用于對準確定量痕量二惡英類污染物的認證分析。

PCDD/Fs和dl-PCBs類物質的異構體和同類物種類繁多,檢測時結構性質相近使得部分色譜峰出現不可避免的重疊現象,盡管高分辨質譜可以很好的識別不同質量分數的PCDD/Fs和dl-PCBs化合物,但對相同質量分數的異構體和化合物并不能進行很好的區分,因此想要更精確的測定食品中PCDD/Fs和dl-PCBs類化合物的含量,需要提升色譜分析技術或加快構建合理的多維色譜及高分辨率質譜儀聯用體系。

生物學檢測方法(特別是CALUX)雖然不能代替化學分析法,但因為其快速、簡單、低成本以及在研究化學物質的生物及毒性效應方面的巨大優勢,使得其能作為化學分析的補充，廣泛用于PCDD/Fs和dl-PCBs類物質的初步篩選性分析檢測。因此,應該對生物學檢測法進行明確的定義,從而使其真正意義上應用于食品中二惡英類化合物的快速篩選,并制定出適合我國國情的可接受的操作標準;同時需要提升檢測人員對生物方法篩選策略的理解和知識的豐富度,并根據不同生物檢測法的局限性對其實驗結果進行分別分析,更合理的評估食品樣品中二惡英化合物的影響;注重開發成本相對低廉但具有高分辨質譜相似靈敏度與分辨率的儀器，以促進食品中二惡英污染物的快速檢測的進程。

[1]Yudkovski Y,Herut B,Shefer E,et al. Dioxin-like biological activity of organic extracts from sediments and fish livers sampled along the Israeli Mediterranean and Red Sea coasts[J]. Marine Pollution Bulletin,2015,98(1-2):295-300.

[2]Wang L,Ding G,Zhou Z,et al. Patterns and dietary intake of polychlorinated dibenzo-p-dioxins and polychlorinated dibenzofurans in food products in China[J]. Journal of Environmental Sciences,2017,51(1):165-172.

[3]Olanca B,Cakirogullari G C,Ucar Y,et al. Polychlorinated dioxins,furans(PCDD/Fs),dioxin-like polychlorinated biphenyls(dl-PCBs)and indicator PCBs(ind-PCBs)in egg and egg products in Turkey[J]. Chemosphere,2014,94(1):13-19.

[4]Ron H,Wim T,Alwyn F,et al. European developments following incidents with dioxins and PCBs in the food and feed chain[J].Food Control,2015,50:670-683

[5]Shin E,Kim J,Choi S,et al. Estimated dietary intake and risk assessment of polychlorinated dibenzo-p-dioxins and dibenzofurans and dioxin-like polychlorinated biphenyls from fish consumption in the Korean general population[J]. Chemosphere,2016,146:419-425.

[6]Perelló G,Díaz-Ferrero J,Llobet J M,et al. Human exposure to PCDD/Fs and PCBs through consumption of fish and seafood in Catalonia(Spain):Temporal trend[J]. Food and Chemical Toxicology,2015,81:28-33.

[7]Lorenzi V,Ghidini S,Angelone B,et al. Three years of monitoring of PCDD/F,DL-PCB and NDL-PCB residues in bovine milk from Lombardy and Emilia Romagna regions(Italy):Contamination levels and human exposure assessment[J]. Food Control,2016,68:45-54.

[8]Son M,Kim J,Park H,et al. Assessment of the daily intake of 62 polychlorinated biphenyls from dietary exposure in South Korea[J]. Chemosphere,2012,89(8):957-963.

[9]Manning T M,Roach A C,Edge K J,et al. Levels of PCDD/Fs and dioxin-like PCBs in seafood from Sydney Harbour,Australia[J]. Environmental Pollution,2017,224:590-596.

[10]Karima G,Lucie C,Sabrine M,et al.Treatment technologies used for the removal of As,Cr,Cu,PCP and/or PCDD/F from contaminated soil:A review[J].Journal of Hazardous Materials,2017,333:194-214

[11]Shen H,Starr J,Han J,et al. The bioaccessibility of polychlorinated biphenyls(PCBs)and polychlorinated dibenzo-p-dioxins/furans(PCDD/Fs)in cooked plant and animal origin foods[J]. Environment International,2016,94:33-42.

[12]Squadrone S,Prearo M,Nespoli R,et al. PCDD/Fs,DL-PCBs and NDL-PCBs in European catfish from a northern Italian lake:the contribution of an alien species to human exposure[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety,2016,125:170-175.

[13]Oh JR,Ikonomou MG,Fernandez MP,et al. PCB and PCDD/F totals,TEQs,and congener patterns in Korean coastal marine environments,1987,1988,1990,and 1996-1999.[J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology,2003,44(2):224-236.

[14]Linda S. B. Dioxin and the AH receptor:Synergy of discovery[J].Current Opinion in Toxicology,2017,2:120-123

[15]Fracchiolla N S,Annaloro C,Guidotti F,et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD)role in hematopoiesis and in hematologic diseases:A critical review[J]. Toxicology,2016,374:60-68.

[16]Okey A B. An Aryl Hydrocarbon Receptor Odyssey to the Shores of Toxicology:The Deichmann Lecture,International Congress of Toxicology-XI[J]. Toxicological Sciences,2007,98(1):5-38.

[17]Puga A,Ma C,Marlowe JL. The aryl hydrocarbon receptor cross-talks with multiple signal transduction pathways[J]. Biochemical Pharmacology,2009,77(4):713-722.

[18]Van Leeuwen FX,Feeley M,Schrenk D,et al. Dioxins:WHO’s tolerable daily intake(TDI)revisited.[J]. Chemosphere,2000,40:1095-1101.

[19]Guo rui Liu,Ming hui Zheng,Zongwei Cai,et al. Dioxin analysis in China[J].Trends in Analytical Chemistry,2013,46:178-188.

[20]Brocca D,Lasagni M,Collina E,et al. Supercritical fluid extraction:An innovative tool for a fly ash-like model support[J].Environmental Science and Technology,2002,36(4):790-796.

[21]Kitamura K K K N,Takazawa Y,Hashimoto S,et al. Effective extraction method for dioxin analysis from lipid-rich biological matrices using a combination of pressurized liquid extraction and dimethyl sulfoxide/acetonitrile/hexane partitioning[J]. Analytica Chimica Acta,2004,512(1):27-37.

[22]van Beuzekom A C,Hijman W C,Berkhoff C J,et al. Fast sample preparation involving MASE and coupled column normal phase liquid chromatography for the rapid trace analysis of dioxins in air-dust samples from fire catastrophe emissions[J]. Talanta,2004,63(5):1183-1192.

[23]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.GB 5009.205-2013食品安全國家標準食品中二噁英及其類似物毒性當量的測定[S].北京:中國標準出版社,2013.

[24]Focant J J F U,Pirard C,De Pauw E. Automated sample preparation-fractionation for the measurement of dioxins and related compounds in biological matrices:A review[J]. Talanta,2004,63(5):1101-1113.

[25]Vanderperren H N V I,Van Wouwe N,Behets S,et al. TEQ-value determinations of animal feed;emphasis on the CALUX bioassay validation[J]. Talanta,2004,63(5):1277.

[26]Hernández F,Sancho J V,Ibáez M,et al. Current use of high-resolution mass spectrometry in the environmental sciences[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2012,403(5):1251-1264.

[27]程劼,蘇曉鷗. 飼料中二惡英類化合物檢測方法研究進展[J].飼料研究,2010(2):44-47.

[28]Wang X,Zhang H,Zhang L,et al. Assessment on dioxin-like compounds intake from various marine fish from Zhoushan Fishery,China[J]. Chemosphere,2015,118:163-169.

[29]Cunliffe A M,Williams P T P T. Isomeric analysis of PCDD/PCDF in waste incinerator flyash by GC-MS/MS[J]. Chemosphere,2006,62(11):1846-1855.

[30]代澎,張曉妍,馬金波.液液微萃取-氣相色譜-三重四級桿測定生活飲用水中的20種多氯聯苯[J].中國衛生檢驗雜志,2016,26(14):2006-2012.

[31]Myers A L,Mabury S A,Reiner E J. Analysis of mixed halogenated dibenzo-p-dioxins and dibenzofurans(PXDD/PXDFs)in soil by gas chromatography tandem mass spectrometry(GC-MS/MS)[J]. Chemosphere,2012,87(9):1063-1069.

[32]Eppe G,Focant J,Pirard C,et al. PTV-LV-GC/MS/MS as screening and complementary method to HRMS for the monitoring of dioxin levels in food and feed[J]. Talanta,2004,63(5):1135-1146.

[33]Eljarrat E,Barcelo D. Congener-specific determination of dioxins and related compounds by gas chromatography coupled to LRMS,HRMS,MS/MS and TOFMS.[J]. Journal of Mass Spectvometry,2002,37(11):135-141.

[34]Dougherty CP,Henricks Holtz S,Reinert JC,et al. Dietary exposures to food contaminants across the United States[J]. Environmental Research,2000,84(2):170-185.

[35]Hoh E,Lehotay S. J,Mastovska K,et al. Evaluation of automated direct sample introduction with comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry for the screening analysis of dioxins in fish oil.[J]. Journal of Chromatography A,2008,1201(1):69-77.

[36]Garrison P.M,Tullis K,Aarts J.M.M.J.G,et al. Species-Specific Recombinant Cell Lines as Bioassay Systems for the Detection of 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin-like Chemicals[J]. Fundamental and Applied Toxicology,1996,30(2):194-203.

[37]Behnisch P A. Combinatorial Bio/Chemical Analysis of Dioxin and Dioxin-like Compounds in Waste Recycling,Feed/Food,Humans/Wildlife and the Environment[J]. Environmental International,2003,29:861-877.

[38]Samara F,Gullett BK,Harrison RO,et al. Determination of relative assay response factors for toxic chlorinated and brominated dioxins/furans using an enzyme immunoassay(EIA)and a chemically-activated luciferase gene expression cell bioassay(CALUX)[J]. Environment International,2009,35(3):588-593.

[39]Harrison RO,Eduljee GH. Immunochemical analysis for dioxins-progress and prospects[J]. The Science of the Total Environment,1999,239(1/3):1-18.

[40]Focant J.-F,Eppe G,De Pauw E. Optimisation and use of tandem-in-time mass spectrometry in comparison with immunoassay and HRGC/HRMS for PCDD/F screening[J]. Chemosphere,2001,46(4):417-424.

[41]Tsutsumi T,Amakura Y,Okuyama A,et al. Application of an ELISA for PCB 118 to the screening of dioxin-like PCBs in retail fish[J].Chemosphere,2006,65(3):467-473.

[42]Levy W,Brena B M,Henkelmann B,et al. Screening of dioxin-like compounds by complementary evaluation strategy utilising ELISA,micro-EROD,and HRGC-HRMS in soil and sediments from Montevideo,Uruguay[J]. ToxicologyinVitro,2014,28(5):1036-1045.

[43]Samara F,Wyrzykowska B,Tabor D,et al. Toxicity comparison of chlorinated and brominated dibenzo-p-dioxins and dibenzofurans in industrial source samples by HRGC/HRMS and enzyme immunoassay[J]. Environment International,2010,36(3):247-253.

[44]孫晞,歐仕益,彭喜春. 二惡英類化學物質生物檢測方法研究進展[J]. 環境與職業醫學,2007,24(2):218-221.

[45]Endo T,Okuyama A,Matsubara Y,et al. Fluorescence-based assay with enzyme amplification on a micro-flow immunosensor chip for monitoring coplanar polychlorinated biphenyls[J]. Analytica Chimica Acta,2005,531(1):7-13.

[46]李曉敏,張慶華,王璞.飼料中二惡英檢測方法研究進展[J].中國飼料,2014,(15):23-27.

[47]馮忠孚,王宛,楊炳建.利用EROD生物測試法快速篩選焚燒廢氣中二惡英類化合物[J].山東化工,2014,43,(7):

67-69.

[48]Hilscherova K,Machala M,Kannan K,et al. Cell bioassays for detection of aryl hydrocarbon(AhR)and estrogen receptor(ER)mediated activity in environmental samples[J]. Environmental Science and Pollution Research,2000(3):159-171.

[49]Chan J K Y,Man Y B,Xing G H,et al. Dietary exposure to polychlorinated dibenzo-p-dioxins and dibenzofurans via fish consumption and dioxin-like activity in fish determined by H4IIE-luc bioassay[J]. Science of The Total Environment,2013,463-464(5):1192-1200.

[50]Khim J S,Villeneuve D L,Kannan K K,et al. Instrumental and bioanalytical measures of persistent organochlorines in blue mussel(Mytilus edulis)from Korean coastal waters[J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology,2000(3):360-368.

[51]Nelson E A S,Hui L L,Wong T W,et al. Demographic and lifestyle factors associated with dioxin-like activity(CALUX-TEQ)in human breast milk in Hong Kong[J]. Environmental Science and Technology,2006(5):1432-1438.

[52]Song Y,Wu N,Han J,et al. Levels of PCDD/Fs and DL-PCBs in selected foods and estimated dietary intake for the local residents of Luqiao and Yuhang in Zhejiang,China[J]. Chemosphere,2011(3):329-334.

[53]Windal I I W I,Denison M S,Birnbaum L S,et al. Chemically activated luciferase gene expression(CALUX)cell bioassay analysis for the estimation of dioxin-like activity:critical parameters of the CALUX procedure that impact assay results[J]. Environmental Science and Technology,2005(19):7357-7364.

[54]Vromman V R,Baert K,Vanderperren H,et al. Evaluation of the use of CALUX results for dioxins and dioxin-like PCBs analysis for quantitative human exposure assessments[J]. Food Control,2012,27(2):314-321.

[55]籍龍杰,陸勝勇,杜穎哲,等. 熒光素酶報告基因法測定飛灰中二噁英類物質[J]. 環境污染與防治,2016(9):19-24.

[56]Reiner E J,Clement R E,Okey A B,et al. Advances in analytical techniques for polychlorinated dibenzo-p-dioxins,polychlorinated dibenzofurans and dioxin-like PCBs[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2006(4):791-806.