熱水提取沙棘多糖工藝研究

楊宏志，王洪江，張春芝，鐘運翠，魏程程

（黑龍江八一農墾大學，黑龍江大慶 163319）

沙棘中富含100多種活性成分和營養物質，例如維生素、黃酮、甾醇、類脂和氨基酸等。這些營養物質具有重要的營養價值，主要分布在沙棘的果肉、果皮、葉片和種子中[1]。所以以沙棘為主的食品、保健產品的研制與生產目前也呈現出了向好的發展趨勢。沙棘加工的常見副產品——沙棘果渣，往往由于缺乏精深加工導致其附加值降低，造成浪費。本試驗以沙棘果渣為原料，試圖提取果渣中的沙棘多糖，為更好的提取和利用沙棘多糖奠定基礎。利用相似相溶的原理，用熱水法提取得到沙棘果渣多糖可以在保證多糖提取率的同時更加有效的保留其中的有效活性成分[2]。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

沙棘果渣，含水率為6.44%，購于黑龍江大慶市場；葡萄糖，天津市大茂化學試劑廠提供；濃硫酸，齊齊哈爾市東大化工試劑廠提供；無水乙醇，沈陽市華東試劑廠提供；苯酚，北京市雙翔達生化試劑儀器有限公司提供；丙三醇，天津市紅巖化學試劑廠提供；氫氧化鈉，哈爾濱市金麗化工試劑有限公司提供；3，5-二硝基水楊酸，湖州生物化學廠（上海）提供；蒸餾水，實驗室自制。所有試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器

DGG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥機，上海森信實驗儀器有限公司產品；754紫外可見分光光度計，上海光譜有限公司產品；ALC-310.3型電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司產品；HWS24型電子恒溫水浴箱，上海一恒科學儀器有限公司產品。

2 試驗方法

2.1 沙棘多糖提取技術路線

將沙棘果渣經除雜后粉碎過40目篩，而后脫脂、脫單糖，過濾后經熱風烘干得到沙棘果渣粉末，用熱水法提取制得沙棘粗多糖，最后測沙棘粗多糖含量。

2.2 多糖含量的測定

參照苯酚-硫酸法[3]。濃硫酸可使多糖水解生成單糖與此同時迅速脫水形成糠醛衍生物，在苯酚的作用下生成有色的化合物。此種有色化合物在波長490 nm處有最大吸收，通過測定OD值可測得其含量。

取烘干至恒質量的葡萄糖0.010 0 g配制成100mL葡萄糖標準溶液，備用。

取葡萄糖標準溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL加蒸餾水至2.0 mL，而后加入1mL 5%的苯酚溶液，滴加濃硫酸5 mL，搖勻并于室溫下放置0.5 h。用分光光度計在波長490 nm處測定OD值，做出標準曲線以得出回歸方程。

按照標準曲線繪制的方法，吸取0.2 mL樣液加蒸餾水至2.0 mL，加入1 mL 5%的苯酚溶液，滴加濃硫酸5mL，搖勻并于室溫下放置0.5 h。以加入葡萄糖標準溶液0 mL為空白對照，用分光光度計在波長490 nm處測定OD值，代入回歸方程求得樣液的多糖含量。

2.3 還原糖含量的測定

采用3，5-二硝基水楊酸比色法[4]測定：將0.65 g的3，5-二硝基水楊酸，溶于5 mL蒸餾水中，置于100mL的容量瓶中，加入65mL 1mol/L的氫氧化鈉溶液，再加入4.5 g甘油，搖勻后定容至100mL。制得3，5-二硝基水楊酸試劑。

比色法標曲的繪制：首先稱量100mg葡萄糖標準品，然后添加蒸餾水稀釋，配成1mg/mL的葡萄糖標準溶液。分別量取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的葡萄糖標準溶液置于試管中，各試管中補加蒸餾水至1 mL，分別加入1 mL配制的DNS試劑，沸水?。?00℃）加熱5 min，然后取出試管用自來水冷卻至室溫，再加入8mL蒸餾水，搖勻，測定吸光度（540 nm）。以葡萄糖的量為X軸，吸光度為Y軸，繪制標準曲線，得到回歸方程。

樣品含量的確定：取試樣1mL放入試管中，加入1 mL的3，5-二硝基水楊酸試劑，于熱水浴中反應5 min后，迅速冷卻至室溫加入8 mL蒸餾水，搖勻，于波長540 nm處測定其OD值，并根據標準曲線求得其還原糖的含量。

2.4 多糖提取得率的確定

多糖提取得率的計算方法參考了熊冰等人[5]的方法。

3 結果與討論

3.1 標準曲線的繪制

（1）多糖含量的測定。根據前文所述，制得葡萄糖標準曲線（圖1），標準曲線中回歸方程的R2非常接近1，說明方程和曲線擬合度高。將樣品于490nm處測得的OD值代入方程計算得到沙棘多糖含量 （μg）。

（2）還原糖含量的測定。將沙棘多糖樣品用分光光度計在波長540 nm處測吸光度，由葡萄糖標準曲線（見圖2） 方程計算可得到沙棘多糖還原糖得率。將樣品測得的OD值代入回歸方程計算沙棘多糖含量（μg）。相關系數非常接近1說明方程和曲線擬合好。

標準曲線（苯酚-硫酸法） 見圖1，標準曲線（DNS法） 見圖2。

圖1 標準曲線（苯酚-硫酸法）

圖2 標準曲線（DNS法）

3.2 單因素試驗

固定試驗溫度為60℃，提取時間為40min，取料液比為 1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35進行熱水法提取多糖單因素試驗，而后測量OD值，計算得出多糖得率。用蒸餾水作為空白，每組測3個平行樣。將計算所得出的結果繪制出多糖得率與料液比之間的關系圖，多糖得率隨料液比的變化。

料液比與多糖提取率的關系見圖3。

圖3 料液比與多糖提取率的關系

從圖3可看出，當料液比為1∶25時多糖得率達到最大值，當料液比低于1∶25時，隨著料液比的增大，多糖得率增大，當料液比從1∶20～1∶25時，多糖得率出現明顯的“陡坡”式增大；而料液比繼續增大時，多糖得率反而隨著溶劑量的增大而減小[6]。出現此種情況極大地原因可能是，隨著溶劑的增加，溶出物中除多糖外還含有其他物質，多糖與其相結合，從而使多糖的提取量下降。

固定料液比為1∶20，提取溫度為60℃，選取提取時間20，40，60，80，100 min進行單因素試驗，通過測定吸光度值，計算得出多糖得率。用蒸餾水作為空白，每組測3個平行樣。根據所得數據繪制出多糖得率與提取時間的關系圖，分析多糖得率隨提取時間的變化規律。

時間與多糖提取率的關系見圖4。

圖4 時間與多糖提取率的關系

從圖4可看出，當提取時間少于80 min時，隨著提取時間的延長，多糖得率增大，當時提取時間從20min延長至40min時，多糖得率急劇增加。提取時間延長至40 min后，隨著時間的延長多糖得率雖中間有略微下降但總體呈增加趨勢。提取時間達到80 min時，多糖得率達到最大值。繼續延長提取時間多糖得率反而下降[7-8]。出現此種情況極有可能是，提取時間過長導致水分蒸發量過多，沙棘果渣黏度增大，使得多糖的提取變得困難，從而使多糖的提取量減少[7]。

選取料液比為1∶20，提取時間為40min，取提取溫度為50，60，70，80，90℃進行單因素試驗，通過測定吸光度值，計算得出多糖得率。用蒸餾水作為空白，每組測3個平行樣。將計算所得出的結果繪制出多糖得率與提取溫度之間的關系圖，多糖得率隨提取溫度的變化。

溫度與多糖提取率的關系見圖5。

從圖5可看出，多糖提取量隨著提取溫度的增大而增加，提取溫度為90℃時具有最大的多糖得率。但是考慮到多糖的生物活性與溫度有很大的關系，溫度過高會使得生物活性降低，所以選擇溫度為3個中間溫度進行正交試驗。

3.3 因素間互作效應試驗

根據單因素試驗的方法，在選定的3個因素中固定1個因素，選取另一因素的2個條件與其他一因素進行單因素試驗并作圖。

圖5 溫度與多糖提取率的關系

圖6 料液比與溫度的互作效應影響

料液比與溫度的互作效應影響見圖6，時間與料液比的互作效應影響見圖7，時間與溫度的互作效應影響見圖8。

圖7 時間與料液比的互作效應影響

圖8 時間與溫度的互作效應影響

從圖6，圖7可看出，料液比與溫度之間、料液比與提取時間之間沒有交互影響；但從圖8中看出，溫度與提取時間之間有比較弱的交互影響。

3.4 正交試驗

試驗因素與水平設計見表1，L9（34）試驗方案及結果見表2。

表1 試驗因素與水平設計

表2 L9（33）試驗方案及結果

通過表2可以看出，3個因素的級差大小順序為R3＞R2＞R1，說明上述3個因素對多糖得率的貢獻影響從大到小順序為C＞B＞A，即按照對多糖得率的影響來說溫度＞料液比＞提取時間。因此熱水法提取沙棘多糖最佳工藝條件組合為C3B1A1，即料液比為1∶25（g∶mL），提取溫度為80℃，提取時間為40 min，經驗證試驗得到在此條件下沙棘果渣多糖提取率達到102.36mg/g。

4 結論

依據試驗結果得出，用熱水法提取沙棘果渣中的沙棘多糖的最佳提取工藝參數為料液比1∶25（g∶mL），溫度80℃，提取時間40 min。在此工藝條件下沙棘粗多糖提取率可達102.36 mg/g，其多糖提取率顯著高于微波、超聲等其他提取方法。熱水法提取耗時長、耗能高的缺點是今后要進一步解決的問題。

[1]IV Bartish，N Jeppsson.Inter-and intraspecific genetic varation in hippophae （Elaeagnaceae） investigated by RAPD marders[J].Plant Systematics and Evolution，2000 （5）：85-101.

[2]張黎明，趙朝，高文遠.玉屏風總多糖的醇提水提工藝條件優化 [J].時珍國醫國藥，2008，19（10）：2 474-2 478.

[3]張惟杰.復合多糖生化技術 [M].上海：上?？萍汲霭嫔?，1987：26-30.

[4]井樂剛.大豆乳清中大豆異黃酮的提取純化及其生物活性的研究 [D].哈爾濱：東北農業大學，2003.

[5]王秀娟.超聲波輔助醬鹵雞蛋加工工藝研究 [J].農產品加工，2007（6）：34-35，42.

[6]黃婧，張名位，辛修峰，等.苦瓜粗多糖提取工藝的優化 [J].農業機械學報，2007，38（6）：112-116.

[7]鄧紅霞.紫菜多糖提取及殘渣利用研究 [D].雅安：四川農業大學，2005.

[8]林永賢，于海峰，許鵬，等.發菜多糖的提取及性質研究 [J].現代食品科技，2007，23（5）：34-36.

[9]楊宏志，鐘運翠，閻福林，等.沙棘多糖提取工藝研究[J].黑龍江八一農墾大學學報，2009，21（2）：68-71.◇