拓撲異構酶Ⅱa基因表達檢測對乳腺癌多西他賽+阿霉素+環磷酰胺新輔助化療方案療效的預測作用

(信陽市腫瘤醫院腫瘤放療科，河南 信陽 464000)

目前，在晚期乳腺癌的初始治療方案中，新輔助化療發揮重要的作用。有研究[1]顯示，拓撲異構酶Ⅱa基因(topoisomerase Ⅱa，TOPⅡA)與蒽環類藥物新輔助化療的療效有關，能夠預測化療的敏感性。近年來研究[2]證明原癌基因擴增原因在于乳腺癌的化療耐藥反應。本研究通過探討TOPⅡA基因表達與臨床病理參數、乳腺癌新輔助化療療效的關系，從而尋找預測乳腺癌新輔助化療療效的指標。

1 資料與方法

1.1臨床資料選擇我院2012年1月至2016年12月收治的原發性乳腺癌患者40例作為研究對象，所有患者病灶>3 cm，并且無遠處轉移。術前活檢進行病理診斷，均采用統一的新輔助化療方案，年齡30～69(48.0±2.0)歲，其中50歲以上患者20例，絕經后患者10例；臨床分期：Ⅱa期10例，Ⅱb期15例，Ⅲa期10例，Ⅲb期3例，Ⅲc期2例。

1.2新輔助化療方法術前新輔助化療采用多西他賽+阿霉素+環磷酰胺(TAC)方案，具體用法用量參考文獻[3]。

1.3觀察指標根據RECIST標準評價近期療效。完全緩解(CR)：所有病灶消失；部分緩解(PR)：腫瘤縮小超過30%；疾病穩定(SD)：介于PR和PD之間；疾病進展(PD)：腫瘤增大超過20%，或發現新病灶。以CR+PR計算有效率[4]。根據Miller-Payne分級標準，評估化療后與化療前對比腫瘤細胞減少的程度，可通過顯微鏡檢查，和化療前對比，腫瘤細胞成分減少的程度分級，具體標準：1級：腫瘤細胞無變化，總數量沒有減少；2級：腫瘤細胞數量輕度減少，但密度高，減少程度比化療前減少30%；3級：腫瘤細胞減少程度達到30%～90%；4級：腫瘤細胞基本消失，存在浸潤小簇細胞，減少程度高達90%以上；5級：腫瘤部位無明顯浸潤癌細胞，殘存血管纖維，含有巨噬細胞。其中4～5級屬于腫瘤對化療敏感；1～3級屬于腫瘤對化療耐藥[5]。

1.3.1 TOPⅡA蛋白表達檢測 采用鼠抗人單克隆抗體工作液，使用PV-9000二步法免疫組化試劑盒(北京中山金橋生物工程技術有限公司)。把體積分數95%乙醇處理后的乳腺癌細胞印片放在磷酸鹽緩沖液(PBS)中，放置于4 ℃冷藏過夜；使用蒸餾水沖洗細胞印片，使用PBS沖洗3次，每次5 min；然后放置于體積分數3%過氧化氫甲醇溶液10 min，使用PBS沖洗3次，每次5 min；滴加一抗50 μL，加上塑料膜封蓋，放置于濕盒，室溫下孵育，3 h后使用PBS沖洗3次，每次5 min；進行DAB顯色30 s，再使用自來水沖洗，進行復染，脫水觀察。根據核染色判定陰陽性，從染色強度和陽性細胞百分比2個方面評價，然后綜合評判表達的陰陽性[4-5]。

1.3.2 熒光原位雜交法檢測TOPⅡA基因 試劑盒購自北京金菩嘉醫療科技有限公司，包含2種混合探針，橘紅色熒光代表TOPⅡA基因,綠色熒光代表17號染色體著絲粒。使用顯微鏡觀察雜交信號進行計數，選擇細胞需細胞核大小均等、細胞核形態無缺損、染色均勻、細胞核無相互疊加、綠色著絲粒熒光信號清晰。對紅色和綠色信號進行計數。當紅色信號數值與綠色信號數值比值>2，則為擴增；<1.8則為無擴增；1.8～2則表示需要重新計數。

1.4統計學處理采用SPSS 13.0處理數據，計數資料用百分數表示，比較用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1新輔助化療療效及病理學評價結果40例可評價療效的乳腺癌患者中，CR 4例(10.0%)，PR 23例(57.5%)，SD 12例(30.0%)，PD 1例(2.5%)；Miller-Payne分級：5級2例(5.0%)，4級10例(25.0%)，3級9例(22.5%)，2級13例(32.5%)，1級6例(15.0%)。見表1。

表1 新輔助化療療效與病理學評價

2.2TOPⅡA基因擴增與TOPⅡA蛋白過表達的關系TOPⅡA基因擴增13例，無擴增27例；TOPⅡA蛋白表達(-)～(+)27例，(++)～(+++)13例。27例TOPⅡA蛋白表達(-)～(+)組患者中，TOPⅡA基因擴增8例，無擴增19例；13例(++)～(+++)組患者中，擴增5例，無擴增8例。TOPⅡA基因擴增和TOPⅡA蛋白過表達無關(χ2=0.231，P>0.05)。

3 討論

乳腺癌是世界女性發病率最高的腫瘤，近年來乳腺癌的發病率在我國迅速增長，給女性健康和生命造成嚴重的威脅。雖然乳腺癌早期診斷率的提高與靶向治療藥物的出現促使乳腺癌死亡率降低，但是晚期乳腺癌患者的療效和預后并不樂觀。對乳腺癌患者必須給予綜合治療，從而提高治療效果，改善患者的預后情況[6]。

乳腺癌的新輔助化療是針對未發生遠處轉移的病灶進行局部化療，現已成為晚期乳腺癌標準的初始治療方案，在綜合治療中占有重要的位置。當乳腺癌患者手術治療后，容易刺激病灶生長，但是如果術前或術中進行局部化療，則可以抑制手術刺激所致的殘留殘根生長[7-9]。同時，新輔助化療方案有利于提前測試化療方案的敏感性和耐藥性，為手術后的化療方案選擇提供重要的依據；腫瘤對新輔助化療的敏感性是預測乳腺癌患者預后的重要指標，化療療效對患者的5 a生存率造成一定的影響。

本研究結果顯示，40例可評價療效的乳腺癌患者中，CR 4例(10.0%)，PR 23例(57.5%)，SD 12例(30.0%)，PD 1例(2.5%)；Miller-Payne分級：5級2例(5.0%)，4級10例(25.0%)，3級9例(22.5%)，2級13例(32.5%)，1級6例(15.0%)。由此可見，新輔助化療極少導致疾病進展的結果，病理學評價結果證實，患者對新輔助化療方案具有較高的敏感性。TOPⅡ抑制劑為主的化療方案通過阻斷斷裂的DNA修復，促使TOPⅡ和DNA殘端結合，導致染色體畸變，從而達到消滅腫瘤細胞的目的。本研究還發現TOPⅡA基因擴增和TOPⅡA蛋白過表達無關。根據乳腺癌新輔助化療方案的影響因素分析，我們認為TOPⅡA基因擴增、蛋白過表達和新輔助化療的療效無明顯的關系。因此，TOPⅡA不是能夠有效預測乳腺癌新輔助化療敏感性的指標。