X線照射、順鉑及X線照射+順鉑對CC趨化因子受體7表達的影響

， ，，，，，，

(1.福建省腫瘤醫院、福建醫科大學附屬腫瘤醫院放療科，福建 福州 350014；2. 福建省腫瘤醫院、福建醫科大學附屬腫瘤醫院放射生物研究室，福建 福州 350014；3. 福建省人民醫院放射科，福建 福州 350004；4.廈門大學附屬中山醫院放療科，福建 廈門 361000)

惡性腫瘤是危及人類生命的常見原因之一，最近研究表明，趨化因子受體及其配體在腫瘤細胞的特異、定向轉移中發揮著重要作用[1-3]。目前已發現約50種趨化因子及20余種趨化因子受體[4]。趨化因子受體及其配體在眾多腫瘤中表達明顯增加[5]。在本研究主要分析CC趨化因子受體7(CCR7)在大腸癌SW480細胞、肺癌SPC-A1細胞、鼻咽癌CNE-2細胞中的表達，同時觀察不同X線照射劑量和方案、不同的順鉑濃度及同步X線照射+順鉑作用后CCR7表達的變化，從而為明確腫瘤細胞的轉移機制和控制腫瘤細胞遠處轉移提供進一步的分子生物學基礎。

1 材料與方法

1.1細胞株將大腸癌SW480細胞、肺癌SPC-A1細胞、鼻咽癌CNE-2細胞培養于RPMI-1640完全培養基中，常規傳代培養，待細胞生長至對數生長期進行相關實驗。

1.2照射方法及順鉑配制采用6 MV-X線照射，劑量率350 cGy·min-1，照射野大?。?0 cm×40 cm，源皮距100 cm；根據實驗設計，將順鉑用RPMI-1640培養基配制成實驗濃度。

1.3實驗分組方案單次照射SW480細胞、SPC-A1細胞及CNE-2細胞0 Gy、2 Gy、10 Gy、20 Gy 6 MV-X線24 h、48 h后觀察其CCR7表達變化:1)比較單次不同劑量X線照射后不同時間CCR7的表達：單次0 Gy、2 Gy、10 Gy和20 Gy X線照射SW480細胞、SPC-A1細胞和CNE-2細胞24 h、48 h后，檢測CCR7的表達；2)不同X線照射方案對SPC-A1細胞CCR7表達影響： 8 Gy單次X線照射與2 Gy·d-1連續照射6 d這2種方案作用于SPC-A1細胞后24 h和48 h，比較觀察CCR7表達的變化；3)比較不同濃度順鉑不同作用時間后CNE-2細胞CCR7表達變化：將CNE2細胞培養于含0 μg·mL-1、0.032 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1、20 μg·mL-1順鉑培養基中24 h、48 h后，比較觀察CCR7表達的變化；4)觀察X線照射、順鉑及X線照射+順鉑對CNE-2細胞CCR7表達的影響：單純2 Gy·d-1連續照射6 d，0 μg·mL-1、0.032 μg·mL-1、0.8μg·mL-1、20 μg·mL-1順鉑，2 Gy·d-1連續照射6 d+0 μg·mL-1、0.032 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1或20 μg·mL-1順鉑這些方案作用CNE-2細胞48 h后，比較觀察分CCR7表達的變化。

1.4采用Westernblot法檢測各細胞CCR7表達收集各處理因素作用后的細胞，通過Micro-BCA試劑盒法將蛋白含量調成等濃度，并在100 ℃沸水中煮5 min使其變性，將等量的蛋白加入質量分數15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后的蛋白被轉移到聚偏氟乙稀膜上，加入約50 μL的CCR7一抗多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，1150)3 h后，用15 000的二抗孵育1 h，曝光后洗片，將膠片置于白光下進行分析、掃描，使用Quantity one軟件分析各條帶。

2 結果

2.1不同劑量X線單次照射不同時間后SW480細胞、SPC-A1細胞及CNE-2細胞CCR7表達的變化3)SW480細胞：2 Gy和10 Gy X線照射24 h后，SW480細胞中CCR7的表達高于0 Gy組，且隨照射劑量的增加而增加(P均<0.05)；與10 Gy組比較，20 Gy組的CCR7表達沒有進一步增加(P>0.05)。照射48 h后，各劑量組CCR7的表達較0 Gy組增加，差異均有統計學意義(P均<0.05)；但2 Gy、10 Gy、20 Gy組之間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。0 Gy組、2 Gy組CCR7的表達48 h較24 h增加，差異均有統計學意義(P均<0.05)，而10 Gy組、20 Gy組48 h與24 h比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見圖1。

圖1 不同劑量X線單次照射

2)SPC-A1細胞：0 Gy、2 Gy、10 Gy、20 Gy X線照射SPC-A1細胞24 h后各組SPC-A1細胞CCR7表達比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。0 Gy、2 Gy、10 Gy、20 Gy X線照射SPC-A1細胞48 h后各組SPC-A1細胞CCR7表達比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。各劑量組照射24 h、48 h后SPC-A1細胞CCR7表達比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖2。

圖2 不同劑量X線單次照射

3)CNE-2細胞：照射24 h后，各劑量組CCR7的表達較0 Gy組增加，差異均有統計學意義(P均<0.05)；但2 Gy、10 Gy、20 Gy組之間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。照射48 h后，各劑量組CCR7的表達較0 Gy組增加，差異均有統計學意義(P均<0.05)；但2 Gy、10 Gy、20 Gy組之間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。各劑量組照射48 h后CCR7表達均較照射24 h后明顯增加，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖3。

圖3 不同劑量X線單次照射

2.22種X線照射模式對SPC-A1細胞CCR7表達的影響8 Gy單次X線照射組與2 Gy·d-1連續照射6 d組(生物學效應等效于8 Gy單次照射組)24 h的CCR7比較差異無統計學意義(P>0.05)；8 Gy單次X線照射組與2 Gy·d-1連續照射6 d組(生物學效益等效于8 Gy單次照射組)48 h的CCR7比較差異無統計學意義(P>0.05)；各劑量組24 h、48 h的CCR7比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 2種X線照射模式對SPC-A1細胞CCR7表達的影響

2.3不同濃度順鉑作用于CNE-2細胞不同時間后CCR7表達的變化不同濃度順鉑作用24 h后，與0 μg·mL-1順鉑組比較，0.032 μg·mL-1順鉑組CCR7的表達無變化(P>0.05)，而0.8 μg·mL-1順鉑組、20 μg·mL-1順鉑組CCR7的表達明顯增加，差異均有統計學意義(P均<0.05)；0.8 μg·mL-1順鉑組、20 μg·mL-1順鉑組CCR7的表達明顯高于0.032 μg·mL-1順鉑組，差異均有統計學意義(P均<0.05)； 20 μg·mL-1順鉑組CCR7的表達明顯高于0.8 μg·mL-1順鉑組，差異有統計學意義(P均<0.05)。

不同濃度順鉑作用48 h后，與0 μg·mL-1順鉑組比較，0.032 μg·mL-1順鉑組、0.8 μg·mL-1順鉑組、20 μg·mL-1順鉑組CCR7的表達明顯增加，差異均有統計學意義(P均<0.05)；0.8 μg·mL-1順鉑組、20 μg·mL-1順鉑組CCR7的表達明顯高于0.032 μg·mL-1順鉑組，差異均有統計學意義(P均<0.05)；20 μg·mL-1順鉑組CCR7的表達明顯高于0.8 μg·mL-1順鉑組，差異有統計學意義(P均<0.05)。

0 μg·mL-1順鉑組、0.032 μg·mL-1順鉑組及0.8 μg·mL-1順鉑組CCR7表達48 h較24 h降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)。20 μg·mL-1順鉑組CCR7表達48 h與24 h比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 不同濃度順鉑作用于

2.4X線照射、順鉑及同步X線照射+順鉑對CNE2細胞CCR7表達的影響與2 Gy·d-1連續照射6 d組及0.032 μg·mL-1順鉑組比較，0.032 μg·mL-1順鉑+2 Gy組CCR7的表達無明顯變化(P均>0.05)。與2 Gy·d-1連續照射6 d組及0.8 μg·mL-1順鉑組比較，0.8 μg·mL-1順鉑+2 Gy組CCR7的表達下降，差異均有統計學意義(P均<0.05)。與2 Gy·d-1連續照射6 d組及20 μg·mL-1順鉑組比較，20 μg·mL-1順鉑+2 Gy組CCR7的表達下降，差異均有統計學意義(P均<0.05)。0.032 μg·mL-1順鉑+2 Gy組、0.8 μg·mL-1順鉑組+2 Gy組、20 μg·mL-1順鉑+2 Gy組3組CCR7的表達兩兩比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖6。

圖6 X線照射、順鉑及同步X線

3 討論

趨化因子受體是一種G-偶聯蛋白，其在許多類型的細胞上表達，已發現超過50種人類趨化因子[6]。趨化因子受體與其相應配體結合參與多種各種生理和病理過程[7]。研究[8-9]發現，在引導腫瘤細胞特異性轉移至特定的淋巴結和器官過程中，趨化因子及其受體組成的信號轉導通路發揮重要作用。CCR7/CCL21軸主要引導腫瘤細胞淋巴結轉移[2,10,11-16]。

趨化因子受體參與惡性腫瘤細胞的生物學行為。然而，一些文獻[17-20]報道，受到亞致死性X線照射時，惡性腫瘤細胞轉移能力可能增加。1949年，Kaplan等[21]首先報道放療可能增加患者遠處轉移機率，1970年Suit等[22]也發現，原發部位復發腫瘤患者接受治療后轉移率較高。本文主要探討X線照射與SW480細胞、SPC-A1細胞、CNE-2細胞CCR7表達的關系及X線照射、順鉑及同步X線照射+順鉑對CNE-2細胞CCR7表達的影響。

結直腸癌是最常見的消化道腫瘤，其常見轉移途徑是淋巴系統轉移，在某些器官和組織中其趨化因子及其受體的表達特異性增加。從免疫組化圖上(SW480細胞)可以看出，趨化因子受體在細胞漿內少量表達，主要表達于細胞膜上。實驗結果顯示(如圖2)，在照射劑量等于或小于10 Gy時，照射24小時后，隨著照射劑量的增加，CCR7的表達增加；20 Gy組中CCR7的表達與10 Gy組比較沒有進一步增加; 48 h后，2 Gy，10 Gy和20 Gy組與對照組相比有所增加，但組間差異無統計學意義。實驗結果表明，大腸癌SW480細胞CCR7的表達在單劑量小于或等于10 Gy的X射線下增加，但在20 Gy的單劑量下增加的趨勢不再明顯，這可能與單次大劑量X射線照射對細胞殺傷效應及CCR7基因損傷有關。CCR7與結直腸癌轉移相關，X射線照射增加了CCR7的表達，因此，實驗結果提示放療可提高腫瘤的局部控制率，但在低劑量放療時可能促進腫瘤細胞遠處轉移，而高劑量放療時盡管CCR7表達增加，由于射線殺傷作用提高，其轉移能力并不一定增強。

肺癌是目前危及人類生命的最常見惡性腫瘤之一，用各種治療方案提高肺癌控制率勢在必行。本研究表明，CCR7在SPC-A1細胞中的表達不隨照射時間和劑量而改變，大劑量照射較常規照射CCR7表達無變化，提示SPC-A1細胞中CCR7對X線無應答。因此在放、化療過程中給予相應的CCR7阻斷劑可進一步減少肺癌細胞的遠處轉移，從而提高治療效果。

鼻咽癌是我國常見的惡性腫瘤之一，綜合治療失敗的主要原因仍為遠處轉移[23]。順鉑是頭頸部腫瘤最常用化療藥物之一，本研究探討CNE-2細胞CCR7在X線照射、順鉑及同步X線照射+順鉑作用后表達的變化，本實驗發現CNE-2細胞在X線照射后CCR7的表達增加，但其表達水平并未隨劑量的增加而改變。因此，低劑量照射可能使CNE-2細胞轉移能力增加，增加放療劑量盡管使CCR7增加，但由于X線的殺傷作用，并不一定增強其抑制轉移能力。CNE-2細胞CCR7的表達在X線照射、順鉑及同步X線照射+順鉑處理后表達增加，相比單純順鉑，同步X線照射+順鉑作用后CCR7的表達下降，而相比X線照射變化不明顯。因此，我們可以看出，與單純化療比較，同步放、化療可能降低CNE-2細胞轉移能力，這與臨床研究一致，即同時放、化療可以減少鼻咽癌轉移并提高生存率[24-28]。

本實驗僅在蛋白水平了解不同細胞各因素處理后CCR7表達的變化，仍不明確腫瘤細胞真正轉移能力，同時本實驗在體外進行，X線照射、順鉑、同步X線照射+順鉑對動物CCR7表達和腫瘤細胞轉移的影響尚不清楚，因此，有必要通過趨化小室，進一步進行動物實驗和人體實驗，由于多種分子均涉及腫瘤細胞轉移，因此需進一步研究上述研究因素對其他涉及腫瘤轉移因素的影響。同時，多種干細胞、血管內皮細胞及免疫細胞均表達趨化因子受體，拮抗趨化因子受體的靶向療法可能引起多種臨床不良反應，因此需進一步研究如何針對趨化因子受體的拮抗治療。