流式細胞術及PCR技術在兒童急性B淋巴細胞白血病微小殘留病監測中的價值*

唐 雪 ，憲 瑩 ，溫賢浩 ，郭玉霞 ，管賢敏 ，王世一 ，肖劍文 △（1.重慶醫科大學附屬兒童醫院血液腫瘤中心；2.兒童發育疾病研究教育部重點實驗室；3.兒科學重慶市重點實驗室；4.重慶醫科大學附屬兒童醫院臨檢中心，重慶400014）

急性淋巴細胞白血?。ˋLL）是兒童白血病最常見的亞型，其中 B 細胞性 ALL（B?ALL）占 70%～75%，兒童B?ALL最常見的白血病基因有ETV6/RUNX1、E2A/PBX1或MLL相關基因等[1]，不同基因型預后有所不同。微小殘留?。∕RD）是白血病治療后體內殘留白血病細胞的狀態，是白血病獨立的預后因素[2]。目前主要的 MRD 檢測方法有 2種[2?3]：流式細胞術（FCM）檢測殘留白血病細胞表面抗原，即FCM?MRD；聚合酶鏈式反應（PCR）技術檢測初診時存在的白血病基因表達，即PCR?MRD。本研究針對初診時 ETV6/RUNX1、E2A/PBX1或MLL基因陽性B?ALL患兒采用FCM及PCR技術監測MRD，分析2種方法的靈敏度及特異性是否存在差異，并分析MRD與B?ALL預后之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象為2012年9月至2015年1月重慶醫科大學兒童醫院收治并接受CCLG?ALL?2008方案[4]（簡稱08方案）化療初診為B?ALL的患兒。本研究得到重慶醫科大學兒童醫院倫理委員會批準，患兒家屬均簽訂知情同意書。納入標準：（1）診斷年齡小于18歲；（2）初診時按WHO?2008淋巴及造血組織腫瘤分型標準[5]完善骨髓細胞學、免疫分型、染色體核型分析及融合基因檢查；（3）ETV6/RUNX1、E2A/PBX1 或 MLL基因陽性。排除標準：（1）入院前接受過抗白血病治療；（2）成熟B?ALL及混合細胞白血??；（3）繼發性ALL或合并其他腫瘤；（4）初診時合并中樞神經系統白血病和（或）睪丸白血??；（5）確診前死亡，或確診后放棄治療，或非疾病因素未完成1個療程化療。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 按照08方案，所有患兒在不同時間點（TP），即TP1（誘導緩解療程第15天）、TP2（誘導緩解第33天）、TP3（鞏固治療第1天）時采集骨髓進行檢測。

1.2.1.1 骨髓細胞學 TP1、TP2及TP3均進行骨髓細胞學檢測。骨髓液涂片5～8張并分類計數至少200個有核細胞，幼稚細胞比例小于5%為M1型，幼稚細胞比例5%～25%為M2型，幼稚細胞比例大于25%為M3型。

1.2.1.2 FCM?MRD 在TP2及TP3采用FCM技術檢測MRD。采集EDTA抗凝骨髓液2 mL并分離單個核細胞（MNC），每管加入1×106個細胞，根據初治時免疫表型選擇個體化檢測抗體組合，每種單抗20μL，混勻后室溫避光15 min，加入1倍溶血素裂解紅細胞，離心，棄上清。PBS洗滌1次，加入500μL PBS使用四色流式細胞儀檢測。出現下述情況則定義為MRD陽性[2]：正常表達抗原強度改變（增強或減弱）和（或）丟失、異常表達其他系別標志、早期和晚期抗原同時表達、幼稚細胞比例明顯增多且均質性表達等。以這些殘存細胞占骨髓MNC 總數的比例作為 MRD 的數值，FCM?MRD＜10?4為陰性。

1.2.1.3 PCR?MRD 在TP2、TP3時采用PCR技術檢測MRD。EDTA抗凝骨髓液分離MNC并提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA。初診MLL陽性者經逆轉錄PCR（RT?PCR）技術擴增后聚丙烯酰胺凝膠電泳及染色分析，出現陽性條帶為 PCR?MRD陽性[6]。初診ETV6/RUNX1或E2A/PBX1陽性者實時熒光定量PCR（qRT?PCR）檢測標本基因拷貝數，用已知濃度的標準品和待測標本中ABL濃度作為對照，得出待測標本基因拷貝數、基因拷貝數與ABL濃度比值，基因拷貝數小于10-5為 PCR?MRD 陰性[7?8]。

1.2.2 治療方案及危險度分組 患兒按照08方案進行危險度分組[4]并接受治療。（1）標危（SR）組必須同時滿足以下條件。①初診年齡1～＜10歲；②初診WBC≤50×109L-1；③無以下染色體改變和（或）基因檢出：t（9；22）或BCR/ABL基因、11q23相關異?；騇LL基因重排、t（1；19）或 E2A/PBX1 基因；④潑尼松試驗[4]敏感（PGR）；⑤TP1骨髓細胞學結果為非M3型、TP2時骨髓細胞學結果完全緩解且 FCM?MRD＜10-4。（2）高危（HR）組滿足以下條件之一。①t（9；22）或BCR/ABL基因陽性；②11q23相關異?；騇LL基因重排陽性；③潑尼松試驗不敏感（PPR）；④初診IR患兒TP1骨髓細胞學為M3 型；⑤FCM?MRD：TP2時 FCM?MRD≥10-2或 TP3時FCM?MRD≥10-4。（3）中危（IR）組：既不符合 SR 又不符合HR標準的患兒。

1.2.3 療效評估標準 患兒隨訪至2017年2月，療效以完全緩解（CR）率、無事件生存率（EFS）描述。CR 定義為化療后無明顯白血病癥狀體征、血常規大致正常且骨髓細胞學為M1[9]。EFS定義為自診斷之日起到第1次事件或末次隨訪日期，事件包括治療失?。ㄔ缙谒劳龌蛭催_CR）、骨髓和（或）髓外復發、CR期內死亡、發生第二腫瘤及放棄治療等[9]。

1.3 統計學處理 應用SPSS21.0統計軟件進行數據分析，計量資料以中位數、±s表示，采用t檢驗或單因素方差分析；計數資料以率表示，采用χ2檢驗分析，標準值小于1采用Fisher確切概率法分析；采用Kaplan?Meier生存分析法計算生存率。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床資料 共61例患兒納入本研究，包括ETV6/RUNX1陽性組（A組）34例，E2A/PBX1陽性組（B組）15例及MLL陽性組（C組）12例。A組因診斷時，WBC≥50×109L-1且PPR列入HR組1例，診斷年齡大于或等于10歲列入IR組1例，FCM?MRD異常列入IR組3例；B組因PPR及FCM?MRD異常列入HR組各1例?；蛐头纸M與危險度分組情況見表1。

表1 患兒危險度分布情況（n）

2.2 不同時間點FCM及PCR檢測MRD結果 A組TP2時FCM?MRD陽性5例，其中PCR?MRD陰性3例。B組TP2時 PCR?MRD陽性4例，僅1例 FCM?MRD陽性。C組TP2時4例FCM?MRD陽性，PCR?MRD陽性僅1例。表明治療早期FCM?MRD與PCR?MRD并不完全相符。A組TP3時FCM?MRD均轉陰但仍有1例PCR?MRD陽性。B組TP2后復發放棄1例，完成TP3評估14例，FCM?MRD均轉陰但仍有3例PCR?MRD陽性。C組TP2后放棄治療或失訪5例，完成TP3評價7例，FCM?MRD及PCR?MRD均轉陰。雖樣本量太少無法進行統計分析，但仍提示PCR?MRD治療后期可能靈敏度高于FCM?MRD。見表 2。

表2 不同時間點FCM及PCR檢測MRD結果（n）

TP2、TP3時三組患兒共做FCM及PCR監測116例次，FCM?MRD陽性 10例次（陽性率為 8.62%），PCR?MRD陽性17例次（陽性率為14.66%），PCR?MRD陽性率高于 FCM?MRD，但差異無統計學意義（P＞0.05）。TP2時FCM?MRD陽性率及PCR?MRD檢查陽性率分別為16.39%和 27.88%，PCR?MRD陽性率也高于 FCM?MRD，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 療效評估 61例患兒總CR率為98.36%（60/61），三組 CR率（A、B、C組分別為 100.00%、100.00% 和91.67%）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。A 組均CR，睪丸及中樞復發各 1例，3年EFS為（93.1±4.7）%。B組均CR，TP2時FCM?MRD陰性而PCR?MRD陽性4例均骨髓復發，FCM?MRD及PCR?MRD均陰性11例中感染死亡2例，其余9例生存，3年EFS為（60.0±12.6）%。C組1例未CR，11例CR患兒放棄治療4例，其余7例（FCM?MRD及PCR?MRD均陰性）中感染及異基因造血干細胞移植死亡各1例，3年EFS為（62.9±17.9）%。隨訪至2017年2月，所有患兒3年總EFS為（80.0±5.4）%，A 組 EFS均高于 B、C 組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖 1。B 組 PCR?MRD 陽性患兒全部復發，而PCR?MRD陰性患兒無復發，見圖2。

圖1 三組患兒EFS比較

圖2 B組患兒EFS比較

3 討 論

白血病是兒童時期發病率最高的惡性腫瘤，B?ALL最為常見[1]。隨著診治技術的改進和社會經濟發展，兒童B?ALL療效不斷提高，治療達到CR后患兒體內仍剩余的微量殘留白血病細胞是導致疾病復發的重要因素[2]，因此，尋找可靠的指標用于檢測MRD對于指導白血病治療非常重要。

初診時，白血病細胞具有與正常血細胞表達水平、表達時機或組合不同的抗原表達，即白血病相關免疫表型（LAIP）[10]，治療達到CR后殘留白血病細胞一般仍保留其初診時LAIP。因此，可利用FCM確定初診時LAIP，定期隨訪其水平變化可動態監測MRD。FCM?MRD 簡便快速，但該方法存在若干缺陷[11]：（1）目前尚未發現真正意義上的白血病特異性抗原，LAIP只是基于正常白細胞表面分化抗原的多參數分析，治療后可能抗原漂移導致假陰性；（2）不同實驗室及人員個體化差異大，導致不同中心檢測的穩定性較差；（3）FCM需使用新鮮標本，故對檢測結果有疑問時試驗難以重復。

ETV6/RUNX1、E2A/PBX1及MLL相關基因是兒童B?ALL最常見的白血病基因，分別占兒童B?ALL的20%～35%、5%～10% 和 5%[12]。融合基因是白血病特異性的分子遺傳學標記且是獨立的預后因素。因此，初診時利用PCR技術檢測患者存在的融合基因、定期隨訪該基因表達情況也可以監測MRD[13]，且可以克服FCM技術存在的缺點。

本研究結果顯示，治療早期PCR?MRD陽性率雖高于 FCM?MRD，但差異無統計學意義（P＞0.05），說明治療早期根據醫院自身條件選擇其中一種檢測方法均可有效監測MRD并指導治療。但MLL陽性患兒復發率高和治療后LIAP容易發生抗原漂移并導致FCM?MRD誤差，故長期隨訪時PCR?MRD效果可能會優于FCM?MRD。本研究結果發現，E2A/PBX1陽性B?ALL患兒治療后FCM?MRD早期轉陰而PCR?MRD陽性者全部復發，提示該基因陽性患兒治療后選擇PCR技術監測MRD可能優于FCM。但PCR技術僅能針對初診時有特異性白血病基因患兒進行，對于基因檢測陰性患兒仍只能采用FCM檢測MRD。

總之，使用FCM或PCR技術均可以有效檢測兒童B?ALL的MRD水平，并指導其分層治療。但FCM存在的缺陷均可以被PCR技術彌補，而PCR檢測為白血病特有標記，因此，對于有特異性白血病基因的患兒，采用PCR技術監測MRD尤其是長期隨訪時可能優于FCM。

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