SET8基因下調對大鼠血管平滑肌細胞增殖遷移的影響及其機制

張東雪，胡春燕，梁向楠，高少輝

(河北醫科大學第四醫院，石家莊 050011)

動脈粥樣硬化是導致心血管疾病發生和患者死亡的關鍵因素[1]血管內膜增生是動脈粥樣硬化等血管疾病發生的關鍵環節[2]，而血管平滑肌細胞(VSMCs)的增殖、遷移是血管內膜增生的直接原因[3]。因此，抑制VSMCs增殖、遷移是減少心血管疾病發生的關鍵環節。金屬基質蛋白酶(MMP)2和MMP9可降解細胞外基質，參與了VSMCs的增殖與遷移等過程[4]。E鈣黏附蛋白(E-Cadherin)可維持上皮細胞的完整性，與細胞的侵襲、轉移和分化密切相關[5]。SET8是現今發現惟一能夠特異性單甲基化組蛋白H4賴氨酸20位(H4K20)的賴氨酸甲基轉移酶，具有調控細胞增殖、遷移與分化的作用[6]。但是，目前SET8對VSMCs增殖、遷移的作用尚不明確。2017年6～12月，我們擬通過大鼠胸主動脈VSMCs來觀察SET8基因下調對大鼠VSMCs增殖、遷移能力的影響，為心血管疾病提供可能的治療靶點。

1　材料與方法

1.1實驗動物、試劑及儀器選取河北醫科大學動物實驗中心的健康雄性SD大鼠6只，均為4周齡，體質量80～120 g，合格證號：1305090。實驗試劑：DMEM培養基(美國Gibco公司)；SET8-短發夾RNA(SET8-shRNA)質粒(廣州復能基因有限公司)，PCR引物(上海捷瑞生物工程有限公司)，實時熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；SET8抗體(英國Abcam公司)，GAPDH抗體(美國Bioworld公司)，兔二抗和鼠二抗(美國KPL公司)；脂質體LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)，Transwell小室(美國Corning公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)粉(美國Sigma公司)，ECL顯色劑(美國Thermo Fisher公司)；蛋白提取試劑盒(普利萊)，RNA提取試劑盒(美國Thermo Fisher公司)。實驗儀器：實時熒光定量PCR儀(美國life公司)，酶標儀(美國Biotek公司)，倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2VSMCs的制備與分組選取SD大鼠，在生物安全柜中取出胸主動脈，去除其外膜及內膜，剩下中間層的VSMCs，將血管剪碎，每塊組織約1 cm×1 cm。將組織塊均勻地貼到培養瓶壁上，采用組織塊貼壁法培養原代大鼠VSMCs，2 h后翻瓶，在二氧化碳培養箱中繼續培養，傳代培養至第3代。將細胞接種于適宜孔板中，細胞融合率達80%時給予轉染干預。將VSMCs隨機分為正常對照組、空質粒組、SET8-shRNA組，正常對照組為正常VSMCs，空質粒組轉染2 μg/L NS-shRNA，SET8-shRNA組轉染2 μg/L SET8-shRNA。

1.3各組VSMCs SET8 mRNA檢測采用實時熒光定量PCR。PCR引物由Primer 5.0軟件設計，各組轉染48 h后，以cDNA為模板，加入SET8的上游、下游引物，GAPDH作為內參照。采用SYBR?Green方法，應用實時熒光定量PCR儀進行檢測，以GAPDH為內參，以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。體系為20 μL反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 min，60 ℃退火，延伸30 s，40個循環，并設置溶解曲線，將信號采集設置在退火延伸階段，采集圖像進行分析。實驗重復3次。

1.4各組VSMCs SET8蛋白檢測采用Western blotting法。各組轉染48 h后，應用普利萊試劑盒提取蛋白質，并用BCA法測定蛋白濃度；蛋白上樣量為50 μg，采用10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離；轉膜、5%牛奶封閉1 h，加入一抗稀釋液(GAPDH 1∶ 10 000，SET8 1∶ 500)，4 ℃孵育過夜。次日，洗膜，放入二抗稀釋液(1∶ 10 000)，37 ℃環境下孵育1 h。ECL顯色并進行圖像采集和分析，實驗重復3次。

1.5各組VSMCs增殖能力觀察采用MTT法。取第3代VSMCs以適當濃度接種于96孔板中，當細胞生長至融合率達60%～70%時進行轉染，細胞分組及處理方法同1.2，放入培養箱繼續培養。每組設3個復孔。分別在轉染后第0、12、24、36、48 h進行檢測。檢測前4 h各孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續培養4 h；取板棄去培養液，各孔中加入150 μL二甲基亞砜并充分震蕩;酶標儀490 nm波長處檢測OD值，記錄結果。實驗重復3次。

1.6各組VSMCs遷移能力觀察采用Transwell實驗。取第3代VSMCs，以適當濃度接種于6孔板中;當細胞生長至融合率達60%～70%時進行轉染，細胞分組及處理方法同1.2。細胞轉染24 h后，將基質膠與冷的無牛清DMEM培養基以1∶ 8混合；每孔加入50 μL混合液，于37 ℃培養箱孵育5 h。待基質膠變成白色凝固層，吸去多余培養基。以胰酶消化細胞，收集3組細胞；用無牛清的DMEM培養基重懸細胞，調整細胞密度為1×106/mL。上室加入100 μL細胞懸液，下室加入500 μL的完全培養基。放入培養箱中繼續培養24 h后，甲醇固定，結晶紫染色，顯微鏡下照相并計數遷移至下室的細胞數。實驗重復3次。

1.7各組VSMCs MMP2、MMP9、E-Cadherin mRNA檢測檢測方法同1.3。

2　結果

2.1各組VSMCs SET8表達比較正常對照組、空質粒組、SET8-shRNA組SET8 mRNA相對表達量分別為1.00±0.00、0.83±0.03、0.48±0.04，SET8蛋白相對表達量分別為0.99±0.20、0.81±0.06、0.68±0.02，SET8-shRNA組與正常對照組、空質粒組相比P均<0.05。

2.2各組VSMCs增殖能力比較轉染后第0、12、24、36、48 h，正常對照組VSMCs的OD值分別為0.36±0.01、0.78±0.08、0.99±0.03、1.21±0.03、1.31±0.03，空質粒組分別為0.36±0.01、0.73±0.06、0.97±0.03、1.12±0.21、1.25±0.06，SET8-shRNA組分別為0.34±0.01、0.49±0.08、0.63±0.09、0.80±0.01、0.88±0.05，SET8-shRNA組與正常對照組和空質粒組第12、24、36、48 h時相比，P均<0.05。

2.3各組VSMCs遷移能力比較正常對照組、空質粒組、SET8-shRNA組VSMCs遷移細胞數分別為(180.67±13.05)、(171.33±15.95)、(55.00±12.29)個，SET8-shRNA組與正常對照組、空質粒組相比P均<0.05。

2.4各組VSMCs MMP2、MMP9、E-Cadherin mRNA表達比較正常對照組、空質粒組、SET8-shRNA組的MMP2 mRNA相對表達量分別為1.00±0.00、1.03±0.11、0.71±0.15，MMP9 mRNA相對表達量分別為1.00±0.00、1.05±0.20、0.52±0.12，E-Cadherin mRNA相對表達量分別為1.00±0.00、0.89±0.20、1.65±0.23，SET8-shRNA組與正常對照組、空質粒組相比P均<0.05。

3　討論

動脈粥樣硬化與心血管事件的發生密切相關[7,8]。而導致動脈粥樣硬化的重要因素之一是VSMCs的增殖和遷移[9]。正常VSMCs具有增殖性弱、遷移性弱的特征，主要起收縮作用，并用來維持血管的正常形態[10]。研究[11,12]發現，在受到病理刺激時VSMCs可去分化為高增殖、高遷移特性的分泌型細胞，并向內膜下間隙遷移，導致內膜增生，進而導致血管動脈粥樣硬化。因此，抑制VSMC過度增殖與遷移是減少動脈粥樣硬化斑塊形成的關鍵。

Linscott等[13]研究發現，賴氨酸甲基轉移酶SET8可影響染色體結構，并且還能招募特異的調節蛋白，在細胞內具有調控組蛋白修飾、調節染色質結構和基因轉錄、調控細胞周期等作用，因此SET8參與細胞增殖、轉移、分化等多種細胞生理功能。研究[14,15]表明，干擾SET8基因表達可有效抑制腫瘤細胞的增殖和遷移能力。本研究MTT和Transwell實驗結果表明，與正常對照組、空質粒組相比，SET8-shRNA組VSMCs的增殖、遷移能力明顯降低，提示干擾SET8基因表達能夠抑制VSMCs的增殖與遷移能力。

Lai等[16]研究發現，MMP2主要作用是降解Ⅳ型膠原和明膠，使細胞能夠突破基底膜屏障，在侵襲轉移中起著重要作用；MMP9能夠降解明膠、Ⅳ型和Ⅴ型膠原，促進細胞的侵襲和遷移。E-Cadherin是維持上皮細胞結構極性和完整性的糖蛋白，對于維持細胞與細胞間的黏附能力非常重要，與細胞的侵襲、轉移和分化密切相關[17]。Yang等[18]研究發現，SET8作為表觀修飾因子可以與TWIST在體內相互作用，能夠催化H4K20單甲基化進而調控TWIST靶基因MMP2、MMP9和E-Cadherin的轉錄，介導靶基因的表達，進而參與調控細胞的增殖、遷移。本實驗結果顯示，與正常對照組、空質粒組相比，SET8-shRNA組VSMCs MMP2、MMP9 mRNA表達降低，E-Cadherin mRNA表達升高。這表明SET8表達降低后，催化H4K20單甲基化作用減弱，從而抑制了靶基因MMP2和MMP9的表達，使膠原蛋白及膠原成分降解作用減弱，細胞不易突破基底膜屏障；同時促進E-Cadherin的表達，使細胞間黏附能力增強，從而抑制了VSMCs的增殖與遷移。

綜上所述，SET8基因下調后大鼠VSMCs的增殖與遷移能力降低；這可能與下調MMP2、MMP9表達，上調E-Cadherin表達有關。本研究僅在細胞實驗中觀察到了干擾SET8能抑制VSMCs細胞的增殖與遷移，其具體是通過何種機制來影響MMP2、MMP9及E-Cadherin表達進而影響VSMCs的增殖與遷移能力仍需進一步驗證，從而為預防和治療動脈粥樣硬化提供依據。