煙曲霉菌與支氣管哮喘關系的研究進展

袁曉芳，王宋平

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，是一種普遍的呼吸系統疾病，其發作對患者生活質量及社會經濟負擔有顯著的影響[1]。哮喘發作的原因包括接觸非特異性變應原與特異性變應原,其中特異性變應原包括塵螨、花粉、真菌、動物毛屑等。煙曲霉菌是日常生活中最常見的空氣傳播真菌病原體，是人類哮喘病常見的氣體中的過敏原[2]。隨著變態反應性支氣管肺曲霉病、變態反應性支氣管肺霉菌病、真菌致敏性重癥哮喘等概念的提出，煙曲霉菌與哮喘的關系越來越受到重視。無數煙曲霉菌的孢子被人類和動物不斷吸入，在生長過程中釋放多種蛋白酶誘發哮喘急性發作；且其體積很小，極易進入呼吸道并定植于氣道。研究[3]表明，環境中的大量煙曲霉菌孢子吸入與哮喘的急性發作及病情加重有密切關系?，F就煙曲霉菌與哮喘關系的研究進展作一綜述。

1　煙曲霉菌與哮喘發病原因

煙曲霉菌是廣泛存在于室內外的一種過敏原，被易感個體吸入后易誘發哮喘急性發作，慢性煙曲霉菌暴露的哮喘患者病情惡化加重的風險也大大增加。早在20世紀，Weiss等[4]收集了1982～1986年美國哮喘患者住院及死亡資料，發現5～34歲哮喘患者中因哮喘發作而死亡的死亡高峰在6～8月，而這個時間段也是煙曲霉菌孢子的生長高峰期；而相似的情況也被其他學者所發現，表明煙曲霉菌與哮喘發病有著密切關系。Denning等[5]通過實驗指出，持續的煙曲霉菌暴露是哮喘加重的誘因，并且通過對哮喘患者氣道內定植菌檢測發現，曲霉菌廣泛存在于哮喘患者的支氣管肺組織內。Fair等[6]研究了58例成年患者(這些患者經英國格倫菲爾德醫院明確診斷為哮喘)來表明哮喘與煙曲霉菌的關系。這些學者在2007年8月～2010年11月隨訪收集了哮喘患者痰標本及這些哮喘患者起居室中的空氣樣本，發現那些痰培養為煙曲霉菌陽性的哮喘患者與痰培養陰性的患者相比，起居室的空氣中存在著更高水平的煙曲霉菌孢子。這是首個顯示室內空氣真菌孢子濃度與痰中檢測濃度直接相關的研究，同時該研究也表明了哮喘患者氣道中存在煙曲霉菌的定植。Maurya等[7]對105例哮喘患者和26例志愿者進行曲霉菌屬的空氣變應原、抗曲霉抗原的血清沉淀、抗煙曲霉病的特異性IgG、總血清IgE水平和常規血液及血清放射學檢查等，發現28.5%的哮喘患者對煙曲霉菌抗原皮膚測試表現出陽性反應，10.4%的哮喘患者對抗煙曲霉病的特異性IgG有特異性反應，7.6%的哮喘患者對抗曲霉抗原的血清沉淀有陽性反應，而志愿者中沒有對曲霉抗原敏感，認為煙曲霉菌是重癥哮喘的獨立危險因素。

幾十年來，真菌被認為與哮喘和其他反應性氣道疾病的發生有關。在真菌中，煙曲霉菌的暴露、感染、定植是嚴重的肺過敏性疾病最常見的原因[8]。文獻報道，全球有數百萬的易感個體因煙曲霉菌及空氣中的其他真菌顆粒而發生肺部及鼻部過敏，嚴重的哮喘與真菌過敏及煙曲霉菌定植(或感染)氣道有關，而這一情況不僅僅發生在成年人，同時也發生于兒童[5,9]。Malo等[10]早在1979年就對北美的200例哮喘患者用煙曲霉菌提取物(這些煙曲霉菌提取物被證實對50例過敏性曲霉菌患者能產生陽性反應)進行了皮膚試驗，發現21.5%通過點刺激試驗對提取物做出反應，39%通過皮內試驗做出反應，表明部分哮喘與煙曲霉菌致敏有關。最近的流行病學研究顯示，煙曲霉菌致敏與哮喘病情惡化加重之間存在密切關系，并且煙曲霉菌感染增加了哮喘發病率與病死率。據統計，因真菌致敏而引起的重癥哮喘影響著全球325萬～1 300萬的成年人，并且每年約10萬人死于真菌致敏的哮喘[11]。

2　 煙曲霉菌與哮喘發病機制

2.1氣道上皮損傷及氣道重塑氣道上皮細胞損傷脫落是哮喘的重要病理特征；在損傷的上皮下方，可見纖維母細胞、平滑肌細胞增生，以及間質膠原異常沉積等氣道重塑的表現。國內外均有實驗表明，煙曲霉菌可導致不同程度的氣道上皮受損及氣道重塑。Hogaboam等[12]通過鼻內滴注煙曲霉菌制造真菌致敏性哮喘小鼠模型，發現經煙曲霉菌暴露的小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中干擾素γ(INF-γ)、轉化生長因子β(TGF-β)顯著升高，支氣管氣道杯狀細胞、纖維細胞增生，氣道羥脯氨酸表達增高。Samarainghe等[2]在比較氣管內予以煙曲霉菌分生孢子及空氣吸入兩種方式所致的真菌致敏性哮喘對小鼠氣道影響差別的實驗中發現，兩組小鼠在煙曲霉菌影響下均出現氣道上皮下纖維化、膠原沉積和平滑肌細胞增生的情況。Amitani等[13]在實驗中證明，煙曲霉菌可產生多種生物活性物質減慢支氣管纖毛擺動并造成氣道上皮細胞的損傷，且支氣管纖毛擺動減慢及損傷的氣道上皮有利于煙曲霉菌定植于氣道。Blease等[14]提出煙曲霉菌的孢子對致敏的個體不僅造成IgE、輔助性T細胞2型(Th2)因子、C-C趨化因子增高，還存在上皮下纖維化和杯狀細胞增生等上皮損傷表現。有研究用煙曲霉菌攻擊趨化因子受體1(CCR1)野生型和CCR1敲除的兩組小鼠，發現兩組小鼠均存在氣道高反應性，但CCR1敲除組小鼠IL-4、IL-13和Th2誘導的趨化因子如C10、巨噬細胞衍生的趨化因子、大氣道周圍杯狀細胞及上皮下纖維化較CCR1野生型組明顯減少，CCR1敲除組氣道重塑情況較CCR1野生型減輕，并提出CCR1可能是煙曲霉菌致敏哮喘氣道重塑的重要受體。王妍[15]使哮喘大鼠在霧化激發前接觸煙曲霉菌孢子，測定BALF中總蛋白濃度以觀察支氣管上皮損傷情況，測定跨肺壓和氣體流速計算激發后氣道反應性；結果發現，接觸煙曲霉菌使BALF中總蛋白濃度升高，煙曲霉菌暴露能加重大鼠氣道上皮的損傷并且增加氣道反應性。本實驗同時測定肺組織中的Toll樣受體2(TLR2)mRNA，發現霧化吸入前接觸煙曲霉菌孢子的哮喘大鼠肺組織中TLR2 mRNA表達上調更多，推測TLR2可能加重了煙曲霉菌孢子暴露后哮喘大鼠支氣管上皮損傷。

2.2氣道炎癥及免疫因素哮喘氣道上皮下有多種炎性細胞的浸潤，慢性氣道炎癥是哮喘的基本特征。在哮喘的急性發作過程中，過敏原經過抗原提呈細胞激活Th2細胞，活化的Th2細胞釋放細胞因子IL-4、IL-5、IL-9和IL-13等；這些細胞因子促進嗜酸性粒細胞生長、遷移和活化、分化，刺激激活B淋巴細胞合成特異性IgE與多種細胞表面受體結合；當過敏原再次入侵人體，多種效應細胞釋放相關活性介質，誘發哮喘。煙曲霉菌不僅能刺激炎性細胞釋放細胞因子，還能增強氣道高反應性，引起哮喘急性發作。Samarainghe等[2]將煙曲霉菌分生孢子以滴入及吸入兩種方式暴露于哮喘小鼠氣道，兩組小鼠氣道中均發現大量巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞聚集，并檢測到大量IgE的釋放。Hogaboam等[12]也發現，煙曲霉菌致敏哮喘小鼠BALF中存在大量嗜酸性粒細胞和淋巴細胞，且煙曲霉菌暴露后小鼠氣道出現顯著增強的高反應性，且這種氣道高反應性持續30 d仍存在。Tomee等[16]發現,煙曲霉菌中的蛋白酶可誘導促炎性細胞因子如IL-8和IL-6以及單核細胞趨化蛋白1的釋放，并導致氣道上皮細胞脫落,引起細胞凋亡。Blease等[17]發現，煙曲霉菌可引起致敏小鼠分泌大量IL-13、IL-4及IL-14。Haczku等[18]對小鼠采取鼻后滴注的方式將煙曲霉菌暴露于氣道，用酶聯免疫吸附法測定小鼠血清免疫球蛋白，發現小鼠血清總IgE以及煙曲霉菌的特異性IgE、IgG1顯著增高，同時還發現血清免疫球蛋白的升高與氣道嗜酸性粒細胞增多以及IL-4、IL-5分泌增多有關；這些經煙曲霉菌暴露后的小鼠不僅表現出炎性細胞因子及炎性細胞的釋放增多，還表現出對乙酰膽堿的反應性高度增加。汪澤等[19]對慢性哮喘大鼠氣道反復暴露煙曲霉菌孢子后，測定BALF中炎性細胞及嗜酸性粒細胞數以及IL-13、IL-15、總IgE表達量，發現慢性煙曲霉菌暴露會增加哮喘大鼠氣道炎性細胞浸潤及細胞因子的釋放。鄭明睿[20]建立哮喘模型大鼠，使其反復霧化吸入煙曲霉菌孢子，再檢測肺組織中炎性細胞及細胞因子數量，同樣發現慢性煙曲霉菌暴露會增加哮喘大鼠氣道炎性細胞浸潤及細胞因子的釋放。龍飛[21]將暴露于煙曲霉菌孢子中的大鼠與正常大鼠比較，發現暴露于煙曲霉菌大鼠BALF上清液中黏液蛋白5ac(Muc5ac)和粒-巨細胞刺激因子(GM-CSF)明顯增高，且大鼠氣道對乙酰膽堿反應性明顯增高；并認為煙曲霉菌可能通過促進Muc5ac、GM-CSF釋放及增加氣道高反應性引起大鼠哮喘發生并加重哮喘大鼠病情發展。而張志紅[22]在A549細胞的體外實驗中發現，該細胞與各種刺激因子共同培養后可產生大量IL-6、IL-8,且酵母菌多聚糖能誘導該細胞釋放IL-6及IL-8顯著增多,而煙曲霉菌菌絲片段僅能刺激該細胞產生有限的同樣細胞因子。因此，其認為煙曲霉菌孢子可能通過抑制氣道上皮細胞釋放炎性因子，導致炎性細胞包括吞噬細胞向局部炎癥部位趨化減弱，逃避吞噬從而在肺內長期生存，再通過芽生釋放過敏原引起哮喘發作。這些研究均表明煙曲霉菌可通過氣道炎癥及免疫因素誘發及加重哮喘。

3　煙曲霉菌與哮喘治療

糖皮質激素是治療哮喘的一線抗炎藥物，其通過與糖皮質激素受體(GCR)結合而發揮抗炎作用；部分對激素治療效果不佳的哮喘稱為激素抵抗型哮喘。而對于煙曲霉菌致敏哮喘及慢性煙曲霉菌暴露的哮喘患者，激素治療效果及抗真菌治療效果如何，國內外有大量的相關實驗。周霞等[23]用煙曲霉菌致敏制造哮喘模型，通過測量大鼠肺組織中GCR mRNA和蛋白含量，發現煙曲霉暴露可降低哮喘大鼠肺組織GCR的表達。周霞等[24]的另一項實驗用地塞米松干預煙曲霉菌暴露大鼠，通過酶聯免疫吸附法及RT-PCR檢測肺組織中IL-33的表達情況，并將肺組織置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中觀察煙曲霉菌菌落生長情況；結果發現地塞米松可降低煙曲霉菌哮喘大鼠IL-33的表達，但培養基中煙曲霉菌菌落明顯生長，表明地塞米松有降低細胞因子的作用，但增加了氣道真菌定植的風險。鄭明睿[20]也在實驗中發現，煙曲霉菌孢子吸入能誘導大鼠肺組織內GCR表達下降。煙曲霉菌致敏及慢性煙曲霉菌暴露可能導致其GCR表達下降，從而使該類哮喘患者對糖皮質激素的治療不敏感。因此，煙曲霉菌感染可能是激素抵抗型哮喘的原因之一。

對于煙曲霉菌有關的哮喘患者抗真菌治療療效，目前國內外均有不同說法。Denning等[25]招募58例重癥哮喘患者(這些患者通過檢測伴有真菌感染且大多數為煙曲霉菌感染，不伴有過敏性支氣管肺曲霉菌病)，讓患者隨機口服伊曲康唑(200 mg，2次/d)或口服安慰劑32周；隨訪16周，發現口服抗真菌藥物對真菌致敏哮喘有較好的治療效果，其中大約60%的患者生活質量有了很大的改善。Chishimba等[26]認為，伊曲康唑對真菌致敏性哮喘患者在治療中存在40%失敗率和不良事件，而采用回顧性分析方法評估二線、三線抗真菌藥物伏立康唑或泊沙對真菌致敏性哮喘患者(大部分為煙曲霉菌致敏)生活質量的影響，發現該兩種藥可能改善哮喘控制并降低嚴重程度。李琳等[27]收集了2006～2011年上海市第一人民醫院符合真菌致敏嚴重哮喘的15例患者在口服伊曲康唑治療至少1個月后的肺功能、外周血嗜酸性粒細胞數等指標，發現完成6個月及以上治療療程的患者第1秒用力呼氣容積、呼氣峰流速有所增加，外周血嗜酸性粒細胞數及口服激素劑量均有降低，認為伊曲康唑治療真菌致敏性哮喘有較好的療效。然而Agbetile等[28]將65例煙曲霉菌致敏的哮喘患者(這些患者在過去1年中至少2次出現哮喘加重)隨機分配，其中32例服用伏立康唑(200 mg，2次/d)，27例接受安慰劑治療，持續治療3個月，隨訪9個月觀察兩組人群生活質量的改善情況，認為口服伏立康唑對煙曲霉菌致敏的中到重度哮喘患者未表現出明顯的有益效果。

由于煙曲霉菌相關性哮喘抗真菌藥物使用療程長、不良作用大且療效不確定，國內外對于煙曲霉菌感染的致病機制均有研究，并致力于通過多種實驗尋找新的治療靶點。馬寧[29]發現，煙曲霉菌可活化CD4+T細胞，該細胞活化所導致的miRNA-142-3P下調可明顯上調rictor的表達，最終通過增強INF-γ的分泌來增強抵抗煙曲霉菌的感染，提示miRNA-142-3P可能為煙曲霉菌感染提供一種新治療靶點和思路。Blease等[17]研究表明，對IL-13采取免疫中和治療在延長慢性哮喘誘發的時間點方面有顯著療效，且這種IL-13的免疫中和治療效果在停止治療后沒有被扭轉，故認為抗IL-13為煙曲霉菌致敏性哮喘治療提供了有吸引力的方法。雖然這些發現目前未在臨床上得到應用，但為煙曲霉菌致敏性哮喘、慢性煙曲霉菌暴露、煙曲霉菌長期定植于氣道上皮哮喘患者的治療提供了新的治療思路。

煙曲霉菌是空氣中廣泛存在的一種真菌，是哮喘重要的過敏原，它的存在與哮喘的急性發作、惡化加重甚至哮喘患者的死亡有著極大的關系。與其他過敏原所致哮喘相比，煙曲霉菌致敏性哮喘不僅能引起Th2細胞釋放大量的細胞因子，使巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞等炎性細胞聚集，引起大量IgE的釋放，導致氣道上皮損傷、氣道重塑；其還存在抑制氣道上皮細胞釋放炎癥因子，逃避巨噬細胞的吞噬作用而長期定植于氣道上皮，導致哮喘的慢性化的特點。對于慢性哮喘患者，反復的煙曲霉菌暴露會加重氣道炎性細胞浸潤、細胞因子的釋放及氣道高反應性。臨床研究[30]發現，煙曲霉菌等真菌致敏哮喘患者平均年齡低，重度哮喘比例高，且常存在對多種變應原敏感；這類哮喘患者住院時間、病程明顯延長，有特有的臨床表現，如憋喘較重、哮喘癥狀持續較久或病情反復、痰液黏稠呈拉絲狀、口腔伴有黑褐色或白色苔膜等。煙曲霉菌致敏哮喘以及慢性煙曲霉菌暴露的哮喘與真菌感染直接相關，其對糖皮質激素的治療效果欠佳，不僅需要做更多前瞻性臨床試驗明確抗真菌治療療效、安全性和對哮喘患者急性發作、惡化加重以及生活質量的有益影響，還需要進一步做更多基礎實驗探討其發病機制，為其治療提供新的方向。