基于SNP標記的短須裂腹魚自然群體遺傳多樣性分析

李光華　金方彭　周　?！∥湎閭ァ强☆R　冷　云　高海濤　張文魁

(1. 云南省漁業科學研究院, 昆明 650111; 2. 云南農業大學, 昆明 650000)

SNP是指在基因組水平上由單個核苷酸堿基的轉換或顛換引起的DNA序列多態性, 由于基因組DNA的任何堿基均有可能發生變異, 所以SNP幾乎遍布整個基因組, 是動植物中普遍存在的一種分子標記; SNP具有數量多、分布廣泛、代表性強、遺傳穩定性好、便于高通量、高度自動化檢測分析等優點, 通過研究其在生物基因組中的分布即能夠全面地反映群體的遺傳及變異水平[1]。

短須裂腹魚[Schizothoraxwangchiachii (Fang)]隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)裂腹魚亞科(Schizothoracinae)裂腹魚屬(Schizothorax),分布于金沙江水系, 且其肉質細嫩, 味道鮮美, 是金沙江及其所屬支流的主要經濟魚類之一[2]。短須裂腹魚也是金沙江中游龍開口水電站和阿海水電站進行增殖放流的土著魚類之一。因此, 短須裂腹魚具有相對較高的經濟價值與生態價值[3]。但近年來, 因其棲息地建設水壩, 棲息環境遭破壞, 加之人類活動影響等原因致使短須裂腹魚的自然種群資源量急劇下降。目前, 對短須裂腹魚的研究主要集中在人工馴養、人工繁殖[4]、幼魚行為學[5]、胚胎發育和仔魚早期發育特性研究[6]等方面, 還未見短須裂腹魚的SNP標記開發與遺傳多樣性水平的研究報道。

本文采用SLAF-seq技術開發了短須裂腹魚的SNP標記, 并進一步分析了金沙江短須裂腹魚自然種群的遺傳多樣性水平。本研究為短須裂腹魚的種質資源保護與開發利用提供了有效工具及理論依據。

1　材料與方法

1.1　材料

2016年7月于短須裂腹魚主要分布區域金沙江阿海(N26°50′; E100°42′)和龍開口江段(N27°23′;E100°31′)采集樣本20尾, 體長10—15 cm, 體重100—150 g, 取魚尾鰭固定于液氮中, 并及時保存于-85℃冰箱中備用。

1.2　基因組DNA制備

采用傳統的酚-氯仿方法抽提基因組DNA[7], 采用紫外分光光度法與瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提質量并測算基因組DNA的的濃度。抽提的基因組DNA置于-20℃冰箱中備用。

1.3　SLAF-seq文庫構建及高通量測序

根據Sun等[15]的方法構建短須裂腹魚SLAF-seq文庫。選擇斑馬魚基因組(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Zebrafish)作為參考基因組進行基因組電子酶切預測, 內切酶的選擇原則為： 避免具重復序列的酶切片段, 酶切片段均勻分布于基因組上, 并使酶切片段數符合預期SLAF標簽數。操作流程為： 在酶切片段3′端加poly (A)、連接Dualindex專用測序接頭、PCR擴增、純化、混樣、切膠回收目的片段, 并將目的片段使用Illumina Hiseq 2500進行雙末端測序(PE100)。選用日本晴水稻(Oryza sativa ssp. japonica)基因組(http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/)為對照組(Control)(選日本晴水稻(Oryza sativa ssp. japonica)基因組作為對照組是因為它的全基因組序列質量非常好, 比對準確率高), 進行同樣流程的測序, 以評估建庫方案的準確性。

1.4　SNP標記開發

根據序列相似度, 將聚類于一起的reads定義為一個SLAF標簽。根據SLAF標簽在不同樣品間的等位基因數和基因序列間的差異程度篩選多態性的SLAF標簽, 并以每個SLAF標簽中測序深度最高的序列類型作為參考序列, 利用bwa[16]將測序reads比對到參考基因組上, 并使用GATK[17]和samtools[18]2種方法開發SNP, 以2種方法得到的SNP標記交集作為最終可靠的SNP標記數據集。

1.5　群體遺傳多樣性分析

對獲取的SNP位點進行篩選, 標準為次要基因型頻率(MAF)大于0.05、完整度大于0.8; 使用符合條件的SNP用于短須裂腹魚群體遺傳多樣性和遺傳結構分析。

使用Power-Marker V3.25軟件計算觀測等位基因數(Observed allele number, No)、期望等位基因數(Expected allele number, Ne)、觀測雜合度(Observed heterozygosity, Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity, He)、多態性信息含量(PIC); 使用Admixture軟件[9]分析短須裂腹魚的群體結構, 使用Cluster軟件[10]進行主成分分析, 使用SPAGeDi軟件[11]進行個體間的親緣關系分析, 使用MEGA5軟件[8]與Neighbor-Joining算法構建個體間的進化關系分析。

2　結果

2.1　SLAF-seq酶切方案及建庫分析

通過對斑馬魚基因組進行酶切預測, 選擇RsaⅠ+HaeⅢ內切酶組合酶切短須裂腹魚基因組,目標酶切片段長度為414—464, 預測可獲得144842個SLAF標簽(表1)。測序獲得日本晴水稻(Control)數據量為0.72 Mreads, 與參考基因組比對,Paired-end mapped reads、single-end mapped reads和unmapped reads占總reads的比例分別為94.73%、1.38%與3.89%(表2); 由此可知, 雙端比對效率較高, 比對結果較好。另外, 日本晴水稻測序reads插入片段中殘留酶切位點的比列為5.27%, 酶切效率為94.73%, 表明酶切效果較好。上述數據顯示本研究的SLAF-seq測序文庫構建正常。從20個短須裂腹魚樣本中共獲得80.08百萬序列(MReads)數據, 平均Q30(測序正確率為99.9%的堿基比例)為94.79%, 平均GC含量為40.16%, 表明測序質量較高, 測序結果可靠。

2.2　短須裂腹魚SNP標記開發

從20個短須裂腹魚樣本中共獲得709758個SLAF標簽, 平均每個樣本獲得240498個SLAF標簽,平均測序深度為95.9 1x; 其中多態性SLAF標簽共有243304個。從20個樣本的SLAF標簽中共鑒別777082個SNP標記, 每個樣本獲得到409005—564000個SNP標記, 平均每個樣本獲得515493個SNP標記; 樣本中SNP位點的雜合率為20.08%—26.09%, 平均雜合率為24.11%; 樣本中SNP位點的完整度(SNP位點在所有樣本中的信息完整度)為52.63%—72.57%, 平均完整度為66.33%。根據選擇標準, 從獲得SNP標記中選擇598354個有效SNP進行群體遺傳多樣性分析, 詳見表1。

2.3　群體遺傳多樣性分析

根據得到的原始SNP計算各遺傳多樣性參數的平均值, 得到的統計結果是觀測等位基因數(Observed allele number)為2.00, 期望等位基因數(Expected allele number)為1.52, 觀測雜合度(Observed heterozygosity)為0.20, 期望雜合度(Expected_heterozygosity)為0.31, 多態性信息含量(PIC)為0.25,次要等位基因頻率(MAF)為0.23。

2.4　群體聚類與遺傳距離分析

Neighbor-joining (Kimura 2-parameter模型,1000次bootstrap)進化樹顯示20尾短須裂腹魚樣本來源于2個亞群(圖1)。

2.5　群體聚類分析

admixture[9]軟件分析短須裂腹魚的群體結構,假設群體的分群數(K值)為1—20, 結果顯示K=8時cross-validation errors的數值最大, 表明本研究采集的20尾短須裂鰒魚樣本并非來源于同一群體, 金沙江阿海到龍口江段的短須裂腹魚群體遺傳背景較復雜, 群體間存在混合現象, 這可能是人工增殖放流后和野生資源共存的結果。對聚類結果的交叉驗證結果(圖2)表明, 當K=1時交叉驗證錯誤率最小, 說明最優分群數為1, 可以推測金沙江阿海到龍口江段的短須裂腹魚可能來自于同一個原始祖先。

表1　樣品SLAF標簽和SNP信息統計Tab. 1　SLAF number and SNP information statistics of samples

圖1　短須裂腹魚遺傳進化樹Fig. 1　The phylogenetic tree of Schizothorax wangchiachii

主成分分析(PCA)是一種純數學的運算方法,可以將多個相關變量經過線性轉換選出較少個數的重要變量, 其結果可以用于與其他聚類方法的結果相互驗證。本研究中主成分分析(Principal components analysis, PCA)結果表明20個短須裂腹魚個體分布在較大的聚類空間上, 部分個體之間的遺傳異質性較大(圖3、4), 這與admixture軟件的分析結果相一致。

2.6　親緣關系和遺傳多樣性分析

使用SPAGeDi[11]軟件可以對自然群體兩兩個體間的親緣關系(Relative kinship)進行估計。親緣關系本身是定義兩特定材料之間的遺傳相似度與任意材料之間的遺傳相似度的相對值, 因此當結果出現兩材料之間的親緣關系值小于0時, 則直接定義為0[12]。親緣關系值Kinship的頻率分布見圖5,20尾短須裂腹魚樣本中, 親緣關系位于0—0.05的頻率較高, 但有少部分樣本的Kinship值位于0.05—0.15, 表明20尾短須裂腹魚樣本中多數個體的親緣關系很近, 小部分樣本的親緣關系相對較遠, 這可能是由于繁殖時期洄游后雜交造成的。

圖2　短須裂腹魚Admixture各個K值的交叉驗證錯誤率Fig. 2　The error rate of Schizothorax wangchiachii admixture K value by cross validation

圖3　短須裂腹魚基于前3個主成分的樣品聚類圖Fig. 3　The error rate of K values for Schizothorax wangchiachii by cross validation

3　討論

3.1　短須裂腹魚序列變異位點分析

研究表明, 序列變異位點的轉換在魚類近親種間出現較頻繁, 而顛換則多在較遠緣種間發生; 而在同種魚不同個體間, 轉換往往在數量上遠超過顛換, 兩者比例為5∶1, 甚至高達10∶1[16]。在本研究短須裂腹魚轉換顛換比值(Ti/Tv)均大于1, 說明短須裂腹魚mtDNA控制區的變異更多的是發生在嘌呤與嘌呤或者嘧啶與嘧啶之間, 而嘌呤與嘧啶或嘧啶與嘌呤之間的顛換則發生得相對較少, 即轉換的發生率高于顛換。

3.2　多態性分析

多態信息含量(PIC)反映了位點在群體中的多樣性狀況, 一般認為 PIC＞0.5時為高度多態性位點,0.25＜PIC＜0.5時為中度多態性位點, PIC＜0.25時為低度多態性位點[17,18]。本研究中多態信息含量0.2562, 表明所選的個位點均為中度多態性位點, 多態性高; 期望等位基因數為1.5272, 觀測等位基因數為2.0050, 表明其等位基因分布均勻。適合短須裂腹魚的遺傳多樣性研究。

3.3　遺傳多樣性分析

雜合度的高低反映了群體遺傳一致性的程度,基因雜合度又稱為基因多樣度, 是度量群體遺傳變異的最合適參數之一, 其位點的平均雜合度近似反映了群體遺傳變異程度的高低[19,20]。雜合度越高的生物群體變異越大, 對環境變化和自然選擇的適應能力也越強[21,22], 在本研究中觀測雜合度和期望雜合度均值為0.2007和0.3160, 相比同為同一水系同為鯉科的金沙江觀音巖段圓日銅魚(均值為0.8520和0.8383)[23]以及長江水系巖元、攀枝花、宜賓、合江、木洞、宜昌的圓口銅魚群體(均值為0.8593和0.8405)[24]多態性較低。

多樣性指數是群落豐度的指標, 指數越高, 該群落越穩定(種群間聯系越緊密, 越多樣); 香濃指數是用來反應群體的多樣性的高低, 指數越大, 多樣性越高。本研究短須裂腹魚多樣性指數為0.3386,香濃指數為0.4827, 觀測雜合度遠低于期望雜合度,說明該江段短須裂腹魚群體的變異程度不高, 對環境變化和自然選擇能力不強; 多樣性指數較低, 說明該群體較不穩定; 香濃指數表明, 群體的多樣性偏低。整體分析表明, 該江段的短須裂腹魚群體處于較低的遺傳多樣性水平, 可能降低了其對環境變化的應對能力與適應能力。

圖4　短須裂腹魚樣品聚類結果Fig. 4　Sample clustering results of Schizothorax wangchiach

圖5　短須裂腹魚親緣關系圖Fig. 5　Genetic relationship figure of Schizothorax wangchiachii

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