蒿鱉養陰軟堅方對刀豆球蛋白A誘導的肝纖維化Nrf2/HO-1信號通路影響

盧娜，方步武

（天津醫科大學藥理學系，天津300070）

肝纖維化是肝臟對持續性肝損傷的創傷再修復反應的病理產物，其病理特征主要表現為肝臟內細胞外基質（extracellular matrix,ECM）的過度異常沉積[1]。肝纖維化是慢性肝病發展為肝硬化甚至是肝癌的必經階段，美國Friedman等[2]指出肝纖維化是一個可逆的過程，因而通過有效的抗肝纖維化治療，早期的肝纖維化可以得到很好地逆轉。氧化應激是肝纖維化發生的重要機制，Nrf2、HO-1蛋白是調節氧化應激的關鍵蛋白[3]。蒿鱉養陰軟堅方（HYRP）是一種養陰活血軟堅、涼血清熱解毒的中藥復方。本課題組以往研究發現，HYRP可以抑制肝星狀細胞活化，降低肝細胞的炎癥反應和氧化應激水平[4-5]。我國是乙肝大國，目前，多數學者認為乙型肝炎病毒感染引起的肝損傷主要與機體免疫應答有關，免疫性肝損傷是多種急慢性肝病和繼發的肝纖維化發生的共同病理基礎，刀豆球蛋白A（ConA）誘導的小鼠急性肝損傷模型已被證實為以T淋巴細胞為主介導的免疫性肝損傷[6]。因此，本實驗擬通過蒿鱉養陰軟堅方對ConA誘導小鼠肝纖維化模型中肝臟組織病理及肝纖維化指標、Nrf2和HO-1蛋白的表達作用，探討該方是否能夠激活Nrf2/HO-1信號通路，降低肝纖維化水平，抑制免疫性肝損傷。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物Balb/c小鼠240只，SPF級，雌雄各半，體質量為18~22 g，購自解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。飼養過程中自由進食水和食物，室溫20~22℃，適應環境3 d后用于實驗。

1.1.2儀器設備CX31-12C04型光學顯微鏡（日本Olympus公司），VIS-7220紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司），HZS-H型水浴振蕩器，電熱鼓風干燥箱。

1.1.3試劑蒿鱉養陰軟堅方制備成原料藥粉，用前配成混懸液；ConA、秋水仙堿和L-羥脯氨酸（Hyp）均為美國Sigma公司產品，批號分別為：C5275，C391，56250；烏來糖：上海潤捷化學試劑有限公司；氯胺T：天津市化學試劑一廠，批號010708；高氯酸、對二甲氨基苯甲醛：天津市光復精細化工研究所；DAB顯色試劑盒：博士德生物，批號AR1002；超敏二步法免疫組化檢測試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司，批號PV-9001；Nrf2兔源多克隆抗體：北京博奧森生物技術有限公司，批號bs-1074R；HO-1鼠源單克隆抗體：美國Santa Cruze公司，批號sc-390991；二甲苯、無水乙醇：天津市天新精細化工開發中心；過氧化氫、磷酸氫二鈉、氯化鈉：天津市江天化工技術有限公司；枸櫞酸、磷酸二氫鈉、三水醋酸鈉、鹽酸：天津市光復科技發展有限公司；異丙醇、檸檬酸三鈉：天津市風船化學試劑科技有限公司；中性樹脂：國藥集團化學試劑有限公司，批號10004160；生物染色劑：Mayer蘇木素染液、蘇木精染液、伊紅染液、天狼猩紅-飽和苦味酸液、天青石藍液。

1.2方法

1.2.1ConA模型制備及實驗分組實驗分為6組，即正常、模型、秋水仙堿（0.13 g/kg）和蒿鱉養陰軟堅方低、中、高劑量（1.16 g/kg3、.36 g/kg、11.58 g/kg）組，ConA用量15 mg/kg，溶解于無菌無熱源的0.9%NaCl生理鹽水注射液中，配制成1.5mg/mL，經0.22μm微孔濾器過濾除菌。尾靜脈注射10 μL/g ConA進行造模，每周1次，持續10周，末次注射后1周內處死小鼠。各組復制模型開始即同時經口灌胃相應藥物，灌胃體積為0.1 mL/10 g體質量，正常組和模型組均經口灌胃相應體積的蒸餾水，每日1次，每周用藥6 d至實驗結束。

1.2.2標本采集末次用藥24 h后，小鼠用乙醚麻醉，留取肝右葉組織（1.0 cm×1.0 cm）2塊。一部分以10%福爾馬林中性緩沖液固定后石蠟包埋切片；另一部分置于氯仿-甲醇脫水脫蠟液（V/V=2:1）中，每天換液1次，持續6 d，備測Hyp濃度。

1.3指標測定

1.3.1小鼠一般狀態每日注意觀察小鼠的精神狀態、活動、進食量、體質量變化等情況。

1.3.2肝組織病理學觀察常規石蠟切片做HE染色檢查肝組織結構和Siriusred染色觀察膠原纖維形成的情況。

1.3.3肝組織羥脯氨酸濃度測定采用Jamall氏法[7]。

1.3.4肝組織Nrf2、HO-1蛋白的表達情況采用免疫組化法，光鏡下觀察Nrf2、HO-1蛋白的表達情況。

1.4統計學分析利用SPSS 16.0軟件分析處理數據，各項計量數據均以±s表示，兩組間樣本比較采用t檢驗，P＜0.05時，差異具有統計學意義。

2　結果

2.1小鼠一般情況及死亡情況正常組小鼠一般狀態良好，皮毛柔順有光澤，飲食量正常；模型組小鼠隨著給藥時間延長，活動量減少，精神萎靡，皮毛松弛無光澤，飲食量減少，體質量減輕；各治療組小鼠一般狀態明顯好于ConA模型組，皮毛少光澤，體質量減輕。

2.2蒿鱉養陰軟堅方對ConA模型小鼠肝組織病理學的影響HYRP對ConA模型小鼠肝組織形態的影響見圖1；HYRP對ConA模型小鼠肝臟膠原纖維的影響見圖2。

圖1　HYRP對Con A誘導肝纖維化小鼠肝組織形態的影響（HE 染色，×200）Fig 1　Effect of HYRP on histological profiles of liver tissues in mice with hepatic fibrosis induced by ConA(HE staining×200)

圖2　HYRP對ConA模型小鼠肝臟膠原纖維的影響（Siriusred染色，×500）Fig 2 Effect of HYRP on hepatic fibrosis induced by ConA(Siriusred staining,×500)

HE染色和Siriusred染色顯示正常組小鼠肝細胞形態大小正常，肝小葉結構正常，無炎性細胞浸潤，匯管區纖維組織無增生。模型組小鼠肝組織出現嚴重的損傷性病理改變，少數細胞腫脹及嗜酸性變，散在不同程度的小葉內壞死，有較多炎性細胞浸潤，肝小葉結構紊亂，肝細胞索排列紊亂，匯管區纖維組織增生，并可見厚薄不一的纖維間隔形成。與模型組比較，蒿鱉養陰軟堅方各劑量組和秋水仙堿組小鼠肝組織損傷性病理改變明顯減輕，炎性細胞浸潤和壞死減少，肝小葉結構接近正常，肝細胞索排列接近正常，匯管區纖維組織增生減少。

2.3蒿鱉養陰軟堅方對ConA模型小鼠肝組織羥脯氨酸濃度的影響與正常組相比，模型組小鼠肝組織羥脯氨酸濃度顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組羥脯氨酸濃度均有不同程度的降低（P＜0.05）。結果見表 1。

表1　HYRP對ConA模型小鼠肝組織羥脯氨酸濃度的影響（±s）Tab 1 Effect of HYRP on hydroxyproline concentration in mice with hepatic fibrosis induced by ConA（±s）

表1　HYRP對ConA模型小鼠肝組織羥脯氨酸濃度的影響（±s）Tab 1 Effect of HYRP on hydroxyproline concentration in mice with hepatic fibrosis induced by ConA（±s）

與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

實驗分組n羥脯氨酸濃度/（μ g/m L）正常組　6　0.2 3±0.0 4模型組　1 0　0.7 0±0.3 5**蒿鱉養陰軟堅方低劑量組　1 2　0.4 6±0.1 9蒿鱉養陰軟堅方中劑量組　9　0.4 1±0.1 8#蒿鱉養陰軟堅方高劑量組　6　0.3 7±0.1 5#秋水仙堿組　7　0.3 9±0.1 8#

2.4蒿鱉養陰軟堅方對ConA模型小鼠肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達的影響與模型組Nrf2細胞核內淺棕紅著色比較，蒿鱉養陰軟堅方各劑量組大部分細胞核內均呈較深棕紅色著色，且隨著藥物濃度的升高，Nrf2在胞核內的表達逐漸增強，甚至出現棕褐色著色（圖3）。與模型組HO-1細胞漿的微棕色著色比較，蒿鱉養陰軟堅方各劑量組大部分細胞胞漿內均呈較深棕黃著色，且隨著藥物濃度的升高，HO-1在胞漿內的表達逐漸增強（圖4）。

圖3　HYRP對ConA模型小鼠肝組織Nrf2蛋白表達的影響（×40）Fig 3 Effect of HYRP on expression of Nrf2 protein in liver tissues of ConA-induced hepatic fibrosis（×40）

圖4　HYRP對ConA模型小鼠肝組織HO-1蛋白表達的影響（×40）Fig 4 Effect of Haobie yangyin ruanjian prescription on expression of HO-1 protein in liver tissues of ConA-induced hepatic fibrosis

3　討論

在肝纖維化發展過程中，多種信號轉導通路的平衡被打破，多種促纖維化因子的合成增多、活性發生改變，而抗肝纖維化因子的作用減弱或受到抑制，最終導致細胞外基質代謝失衡而過度沉積，誘發肝纖維化的發生。

氧化應激是肝纖維化發生的重要機制。肝損傷時，細胞內活性氧（ROS）濃度顯著升高破壞了機體的氧化/抗氧化系統平衡，誘導肝細胞釋放大量的炎性細胞因子，進而活化肝星狀細胞，加劇肝纖維化的演變。Nrf2屬于Capncollar轉錄因子家族成員，具有亮氨酸拉鏈結構蛋白，可與細胞核內的小Maf蛋白形成異源二聚體，經乙?；冉Y構修飾后實現其高活性狀態，進而與抗氧化反應元件ARE結合啟動下游II相解毒酶及抗氧化蛋白基因的轉錄[8]。HO-1是II相解毒酶中最容易被誘導的抗氧化酶，它能夠將衰老或破損的紅細胞釋放的血紅素降解為膽綠素、Fe2+和一氧化碳，而這3種催化產物對于維持細胞內氧化平衡均有重要的作用[9-11]。

本研究選擇ConA作為誘導劑，建立小鼠自身免疫性肝纖維化動物模型。ConA誘導小鼠肝纖維化模型更適合用于研究人類自身免疫性肝病的病理機制和進行抗肝損傷的藥物篩選[12]。研究結果顯示，正常組小鼠肝小葉結構正常，模型組肝小葉結構紊亂，匯管區可見大量炎性細胞浸潤，纖維組織增生，Nrf2、HO-1弱陽性表達，而與模型組相比，蒿鱉養陰軟堅方治療組大部分肝小葉結構接近正常，肝細胞索排列接近正常，匯管區有少量炎性細胞浸潤，纖維組織增生減少，Nrf2、HO-1在細胞漿中的陽性表達明顯升高，呈深棕色，且Nrf2在細胞核中也有陽性表達，呈劑量依賴性。

蒿鱉養陰軟堅方為養陰活血軟堅、涼血清熱解毒中藥復方，由青蒿、鱉甲、生地、丹參、虎杖、白花蛇舌草等9味中藥組成，上述藥物在慢性肝?。ǜ卫w維化、肝硬化等）的臨床治療上使用頻率較高、療效好。前期研究表明，蒿鱉養陰軟堅方對牛血清白蛋白、血吸蟲病、酒精、CCl4復合因素所致的肝纖維化均有預防和治療作用[4-5,13-16]。本次研究發現，蒿鱉養陰軟堅方能夠減輕ConA誘導的肝纖維化增生程度，降低肝組織中羥脯氨酸濃度，抑制炎癥反應，誘導Nrf2和HO-1蛋白的表達。

綜上所述，蒿鱉養陰軟堅方具有改善ConA模型小鼠的臨床癥狀和病理學變化及對抗免疫性肝損傷的作用，其機制可能與蒿鱉養陰軟堅方能夠激活Nrf2/HO-1信號通路有關，這為臨床上治療肝纖維化提供了新的思路。

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