多交叉置換擴增技術在單增李斯特菌檢測中的應用及評價

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單增李斯特菌(L.monocytogenes)是一種革蘭陽性、兼性厭氧的食源性致病菌，廣泛分布于自然界，常見于生冷食品中[1]。它主要通過污染食品使老年人、孕婦、新生兒和免疫力低下等易感人群感染，并誘發敗血癥、腦膜炎、早產甚至死亡等嚴重病發癥[2]。因此，簡單、快速、敏感和特異的檢測方法對李斯特菌的監測尤為重要。傳統的分離培養方法是檢測單增李斯特菌的金標準，但其過程繁瑣、耗時長[3]。隨后，聚合酶鏈式反應(PCR)、多重PCR和熒光定量PCR等雖優于分離培養方法，但仍然耗時、繁瑣且受昂貴實驗室設備的限制[4-5]。相比于PCR方法，恒溫擴增檢測方法克服了以上劣勢并且能夠在野外、臨床和實驗室中高效地檢測目的病原菌[6]。多交叉置換擴增(MCDA)是本實驗室近期建立的一種新型恒溫擴增技術[7]，它能夠在恒溫(60～67 ℃)條件下、1 h內快速、敏感和特異地擴增核酸，明顯提高了檢測效率。

在本實驗中，以單增李斯特菌種特異性基因lmo0733為靶標，應用MCDA方法建立了一個快速、敏感和有效的診斷方法，并驗證了該方法的特異性和敏感性。同時與LAMP和CPA方法進行了檢測閾值的比較，評價了本方法對實際樣本的檢測能力。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株55株單增李斯特菌和28株非單增李斯特菌被用于本研究，見表1。所有菌株使用前在腦心浸液(BHI)瓊脂平板37 ℃過夜生長。

1.1.2試劑與儀器FRASER BROTH BASE、BRILLIANCETMLISTERIA AGAR BASE培養基購自英國OXOID公司；API Listeria生化試劑條購自法國bioMérieux公司；腦心浸液購自北京陸橋技術有限公司；細菌基因組提取試劑盒(Bacteria Gene DNA kit)購自北京康為世紀生物科技有限公司；DL100DNA Marker購自大連寶生物公司；Loopamp○RDNA反應試劑盒與Loopamp○R熒光檢測試劑購自北京葵沫生物科技有限公司。凝膠成像系統(GEL Doc2000)購自美國Bio-rad公司；Loopamp○R實時濁度儀LA-320C購自于榮研生物科技(中國)公司；引物合成由北京擎科生物科技公司完成。

表1本研究所使用的菌株
Tab.1Bacterial strains used in this study

aU，未知血清型；bATCC，美國標準生物品收藏中心；NCTC，國際生物品收藏中心；ICDC，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所。

aU,unidentified serotype.bATCC, American Type Culture Collection; NCTC, National Collection of Type Cultures; ICDC, National Institude for Communicatable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention.

1.1.3DNA模板制備細菌基因組按試劑盒說明書進行提取，制備好的菌株DNA模板保存于-20 ℃備用。

1.2方法

1.2.1引物設計本研究單增李斯特菌EGD-e菌株的lmo0733基因(Genbank number: NC_003210.1)作為檢測靶標，使用PRIMERPRIMER 5.0 軟件設計引物，序列見表2。

1.2.2單增李斯特菌-MCDA檢測MCDA反應體系為25 μL：F1和F2引物各0.4 mmol/L，C1和C2引物各0.8 μmol/L，R1、R2、D1和 D2引物各1.2 μmol/L，CP1和CP2引物各2.4 μmol/L，2×reaction mix 12.5 μL，Loopamp熒光檢測試劑12.5 μL，BstDNA聚合酶(10U)1.25 μL，DNA模板1 μL。MCDA產物采用三種方法判斷結果：熒光染料的顏色變化觀察、瓊脂糖凝膠電泳和Loopamp 實時熒光濁度儀LA-320C(Eiken Chemical Co., Ltd, Japan)濁度檢測。

表2本研究使用的單增李斯特菌-MCDA引物
Tab.2L. monocytogenes-MCDA primers used in this study

引物Primers序列Sequence(5′?3′)長度LengthCP1ACAGTCCTTGCTCCCATTTAGA?AGAAAT?TGCCATCAAACTGAA43merCP2GCTTGAAACACCAGTAAGCACT?TTCG?GAAATTGCTTTTACATCA44merF1AAATCAAAAGGACTTTCGCA20ntF2CAAACTGTAAGTTTATAATCTCCAG25ntC1ACAGTCCTTGCTCCCATTTAGA22ntD1GATTGTTTGTCGCACCACA19ntR1ATATCGGAATCAGGAACTG19ntC2GCTTGAAACACCAGTAAGCACT22ntD2CTTGGAGAAACTGTTATGGT20ntR2GTTAATCTCCATATCGGAAGT21ntP1AGAAATTGCCATCAAACTGAA21ntP2TTCGGAAATTGCTTTTACATCA22nt

單增李斯特菌-MCDA最佳反應條件確定：分別在60 ℃～67 ℃ 8個溫度下恒溫擴增1 h，然后95 ℃加熱5 min后終止反應。實驗使用單增李斯特菌EGD-e作為陽性對照，豬鏈球菌(革蘭陽性菌)和腸侵襲性大腸桿菌(革蘭陰性菌)作為陰性對照，蒸餾水作為空白對照，各取1 μL DNA模板用于實驗。

1.2.3單增李斯特菌-MCDA方法的特異性和敏感性驗證55株單增李斯特菌和28株非單增李斯特菌株(表1)用于確認MCDA方法的特異性。

將EGD-e 菌株DNA進行倍比稀釋(10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg)來評估MCDA方法的檢測下限。每個反應需1 μL稀釋好的模板，實驗至少重復兩次。同時比較MCDA、LAMP和CPA三種方法的敏感性。其中單增李斯特菌-LAMP和單增李斯特菌-CPA檢測下限值來自參考文獻[6, 8]。

1.2.4MCDA、LAMP、CPA和PCR方法對鼠糞便增菌培養物的檢測能力比較本實驗室另一項研究中使用ISO11290-1方法[6]對153份鼠腸道糞便進行了單增李斯特菌檢測，結果為24份單增李斯特菌陽性，129份為單增李斯特菌陰性(結果未發表)。將該研究中153份糞便標本在Fraser培養基中的增菌培養物1 mL提取DNA(100 ℃金屬浴10 min)，同時使用針對單增李斯特菌的MCDA、LAMP、CPA 和PCR方法進行檢測。其中LAMP、CPA和PCR的操作方法見參考文獻[6, 8-9]。

2　結　果

2.1單增李斯特菌-MCDA檢測引物該方法共5對引物，其引物特異性通過 NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 驗證，具體信息見表2。

2.2單增李斯特菌-MCDA產物的檢測與驗證陽性擴增結果如圖1A和1B。在擴增反應60 min后，產物顏色由亮灰色變為綠色；在2%的瓊脂糖凝膠電泳上顯示為典型的階梯狀分布圖像。僅單增李斯特菌分離陽性的反應管出現陽性擴增結果，而空白對照和陰性對照無上述現象。最佳反應溫度，本研究的其它評估檢測均在此溫度下進行。

(A)單增李斯特菌MCDA反應管的顏色變化：1，陽性擴增；2、3和4分別為陰性對照(豬鏈球菌和侵襲性大腸桿菌)和空白對照。(B)單增李斯特菌MCDA產物的瓊脂糖凝膠電泳圖結果：1，單增李斯特菌擴增產物；2，豬鏈球菌(陰性對照)擴增產物；3，侵襲性大腸桿菌(陰性對照)擴增產物；4，空白對照；M，100 bp DNA marker。(A) Color change of the L. monocytogenes-MCDA tubes; tube 1, positive amplification; tube 2, 3, 4, negative control (Streptococcus suis), negative control (Enteroinvasive E. coli) and blank control, respectively. (B) 2% agarose gel electrophoresis of the lmo0733-MCDA products; lane 1, MCDA products of L. monocytogenes; lane 2, MCDA products of Streptococcus suis (negative control); lane 3, MCDA products of Enteroinvasive E. coli (negative control); lane 4, blank control; lane M, DNA marker DL 100 bp.圖1　MCDA產物的驗證和鑒定Fig.1　Verification and identification of MCDA products

2.3單增李斯特菌-MCDA方法的最佳擴增溫度如圖2所示，61 ℃為單增李斯特菌MCDA方法的

2.4單增李斯特菌-MCDA方法特異性和敏感性特異性評估如圖3所示，單增李斯特菌株均為陽性擴增結果(在瓊脂糖凝膠電泳中呈現典型階梯狀分布圖像)，非單增李斯特菌為陰性結果。單增李斯特菌-MCDA方法的敏感度評估結果如圖4所示，MCDA的檢測下限為10 fg/反應，其中10 ng、10 pg和10 fg濃度的核酸模板分別于12、15和24 min反應時間即可檢測到。

通過已有文獻報道和本研究方法的敏感度檢測，LAMP、CPA和MCDA方法對lmo0733 的檢測下限分別為250 fg/反應、2.5 pg/反應和 10 fg/反應[11, 14]。

2.5MCDA、LAMP、CPA和PCR方法對鼠糞便標本增菌培養物的檢測比較檢測結果見表4。MCDA的檢測能力優于LAMP、CPA和PCR方法，其分離結果與傳統分離培養技術得出的24份陽性分離株一致。

表4MCDA、LAMP、CPA和PCR方法對鼠糞便標本增菌培養物的檢測
Tab.4Identification of L. monocytogenes for the rat feces samples by MCDA, LAMP, CPA and PCR methods

No．ofL．monocytogenespositivesamples(陽性樣本數)PCRCPALAMPMCDASecondenrichmentbrothsample?(二次增菌液樣本)1281724

*153份老鼠腸道糞便增菌液樣本，傳統分離培養方法檢測為24份單增李斯特菌陽性。

*24L.monocytogenespositive second enrichment broth samples were come from the 153 rat intestinal feces samples based on culture-biotechnical method.

MCDA反應通過實時濁度檢測進行分析，并顯示相應的DNA濃度曲線。閾值> 0.1視為陽性擴增。在不同溫度(60-67 ℃)下獲得8個動力學圖(A-H)，每個反應中模板為1 pg，A到F圖顯示出良好的擴增。The MCDA reactions were analyzed by means of real-time turbidity detection and the corresponding curves of DNA concentrations were shown in the figure. The threshold value of >0.1 was regarded to be positive. Eight kinetic graphs (A-H) were obtained at different temperature (60-67 ℃)with L. monocytogenes DNA at the level 1 pg per reaction and from A to F graphs displayed robust amplification.圖2　MCDA方法的最佳反應溫度Fig.2　The optimal temperature for MCDA assay

(A1-4)實時濁度檢測圖及相應DNA濃度曲線　閾值>0.1視為陽性擴增。(B1-4)2%瓊脂糖凝膠電泳成像圖，陽性擴增為典型階梯圖像　1-12，單增李斯特菌血清型1/2a(EGD-e)、1/2a(ATCC51772)、1/2b(ATCC-BAA-2658)、1/2c(ATCC51779)、3a(ATCC51782)、3b(ICDC)、4a(ATCC19114)、4b(ATCC19115)、4c(ATCC19116)、4d(ATCC19117)、4e(ATCC19118)、7(NCTC10890)；13-17，其它李斯特菌參考菌株-綿羊李斯特菌(ATCCBAA-678)、威爾李斯特菌(ATCC35897)、英諾克李斯特菌(ATCC-BAA-680)、格氏李斯特菌(ATCC25402)、西爾李斯特菌(ATCC35967)；18-32，豬鏈球菌、糞鏈球菌、腸球菌、肺炎鏈球菌、副傷寒沙門菌，類志賀鄰單胞菌、腸桿菌、普通變形桿菌、志賀菌、腸致病性大腸桿菌、腸產毒性大腸桿菌、腸聚集性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌。M，DL100-bp DNA marker。(A1-4) Specificity of L. monocytogenes-MCDA was detected by real-time measurement of turbidity and the corresponding curves of DNA concentrations were shown in figure. The threshold value of >0.1 was considered to be positive. (B1-2) The positive products of MCDA were able to produce a ladder-like pattern by 2% agarose gel eletrophoresis. Line (lane) 1-12, L. monocytogenes of serovar 1/2a (EGD-e),1/2a(ATCC51772),1/2b (ATCC-BAA-2658), 1/2c(ATCC51779),3a(ATCC51782),3b(ICDC),4a(ATCC19114), 4b(ATCC19115), 4c(ATCC19116), 4d(ATCC19117), 4e(ATCC19118), 7(NCTC10890); line(lane) 13-17, other Listeria reference strains of L. ivanovii(ATCCBAA-678), L. welshimeri(ATCC35897), L. innocua(ATCC-BAA-680), L. grayi(ATCC25402), L. seeligeri(ATCC35967); line(lane), 18-32, non-Listeria strains of Streptococcus suis, Streptococcus faecalis, Streptococcus oralis, Enterobacter cloacae, Streptococcus pneumoniae, Salmonella paratyphi, Plesiomonasshigelloides, Enteric bacilli, Proteusbacillus vulgaris, Shigelladysenteriae, Enteropathogenic E. coli, Enterotoxigenic E. coli, Enteroaggregative E. coli, Enteroinvasive E. coli, Enterohemorrhagic E. coli. Lane M, DL100-bp DNA maker.圖3　不同菌株驗證單增李斯特菌-MCDA方法特異性Fig.3　Specificity of L. monocytogenes-MCDA detection for different strains

(A)敏感性實時濁度檢測圖。MCDA方法的檢測下限為10 fg/反應。(B) lmo0733-MCDA敏感性驗證的瓊脂糖凝膠電泳圖，陽性擴增為典型階梯圖像。1，DL 100 bp DNA marker；2-6, EDG-e DNA濃度分別為10 ng、10 pg、10 fg、1 fg、0.1 fg；7，陰性對照(豬鏈球菌)；8，陰性對照(腸侵襲性大腸桿菌)；9，空白對照。(A) Sensitivity of lmo0733-MCDA was detected by real-time measurement of turbidity. The LoD for MCDA assay was 10 fg genomic DNA per reaction. (B)Sensitivity of lmo0733-MCDA was detected by 2% agrose gel electrophoresis and positive products produced a ladder-like pattern. Lane 1, DL 100-bp DNA marker. 2-6, 10 ng, 10 pg, 10 fg, 1 fg, 0.1 fg of EDG-e DNA; Lane 7, negative control (Streptococcus suis); Lane 8, negative control (Enteroinvasive E.coli), Lane 9, blank control.圖4　使用連續倍比稀釋的單增李斯特菌EGD-e DNA模板驗證lmo0733-MCDA方法的敏感性Fig.4　Sensitivity of lmo0733-MCDA assays using serially diluted genomic DNA with L. monocytogenes strain EGD-e as template

3　討　論

本研究以單增李斯特菌種特異性基因lmo0733為靶標，建立了一種快速、敏感和特異的多交叉置換擴增(MCDA)檢測方法。該方法操作簡便，僅需在61 ℃維持恒溫1 h。單增李斯特菌-MCDA方法的敏感度為10 fg，分別是LAMP和CPA方法的25倍和250倍[6, 8]。同時，該方法的高敏感度也在實際標本應用評價中得到了驗證。153份鼠糞便標本增菌培養物樣本中，MCDA方法的檢測能力優于LAMP、CPA和PCR方法，其檢測結果與傳統分離培養方法一致(24份單增李斯特菌陽性)，且僅需2次增菌液的水煮模板即可檢測。

此外，該方法具有良好的特異性。單增李斯特菌檢測的靶基因通常是hlyA和iap[12, 16-17]，但它們并非單增李斯特菌所特有，也存在于綿羊李斯特菌和希爾李斯特菌[2-3]。本研究靶標lmo0733是單增李斯特種特異性基因，并且在83株菌特異性評估中也成功地被驗證。因此，單增李斯特菌-MCDA方法能夠方便、快速、有效的檢測單增李斯特菌。

本研究可用于食品行業、臨床標本中單增李斯特菌的檢測，為監測和預防控制提供技術支持。

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