空腸彎曲菌喹諾酮類抗生素敏感性檢測及其耐藥機理分析

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彎曲菌是主要的食源性病原菌，主要導致人類細菌性腸炎[1-2]。在歐美等發達國家，彎曲菌病是報道最多的食源性胃腸道疾病，其發病率甚至超過了沙門菌、志賀氏菌以及大腸桿菌O157∶H7[3-5]。彎曲菌病通常是自限性疾病，但是對于免疫力低下及病程遷延不愈的患者進行抗生素的治療是必須且有效的[6]。氟喹諾酮類藥物(如環丙沙星)和大環內酯類藥物(如紅霉素)是臨床上治療彎曲菌病的首選藥物[7]。但是目前彎曲菌對氟喹諾酮類抗生素耐藥嚴重。2013年，美國CDC將耐氟喹諾酮類和大環內酯類彎曲菌列為影響公共衛生的耐藥威脅之一[8]。2017年，WHO將氟喹諾酮耐藥彎曲菌列為優先2級(高度耐藥)[9]。

研究發現在編碼DNA回旋酶的gyrA基因內有一個被稱之為熱點的喹諾酮類耐藥決定區(QRDR)[10]。在這個區域內發生突變是彎曲菌產生喹諾酮耐藥的主要原因。另外研究發現，主動外排系統與多種抗生素的耐藥相關，可以造成彎曲菌的多重耐藥，也是導致彎曲菌對氟喹諾酮類抗生素耐藥的另一個重要的機制[11]。為進一步了解近年我國不同宿主來源分離菌株喹諾酮類耐藥現狀及耐藥機理機制，本研究通過對近期分離菌株萘啶酸、環丙沙星敏感性的分析以及耐藥菌株gyrA基因，gyrB基因的DNA序列分析，獲得我國近期分離菌株喹諾酮類抗生素耐藥現狀及主要耐藥機理。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗菌株分離于2015-2017年不同宿主來源234株空腸彎曲菌菌株，其中98株來源于腹瀉病人，20株來源于雞糞，59株來源于牛糞，46株來源于食品動物(雞肉，雞胗，雞腎，雞肝，豬肉)，11株來源于鴨糞。質控菌株C.jejuni(ATCC33560)為本研究室保存。

1.1.2試劑CAMPYLOBACTER AGAR BASE (Karmali) (CM0935)購自OXOID公司，脫纖維羊血購自北京蘭博瑞生物制品有限公司，DNA提取試劑盒QIAamp DNA Mini Kit (250)購自QIAGEN(北京)公司，Gelred 10 000×染料(Cat: 41003, Lot: 11G0127) 購自美國BIOTIUM公司，2×EsayTaq PCR SurperMix(CAT:AS111)購自全式金生物技術有限公司，Trans2K DNA Marker(BM101)購自全氏金生物技術有限公司，Regular Agarose G-10 (LOT:111860)購自法國BIOWEST公司，彎曲菌瓊脂稀釋法抗生素最低抑菌濃度(MIC)檢測試劑盒(ZC-CAMPY-013)購自青島中創生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細菌培養及藥敏試驗將菌株接種于含有 5%脫纖維羊血的Karmali培養基上，置于37 ℃微需氧(5%O2、10%CO2、85%N2)條件下培養48 h，挑取3代單克隆后增菌[12]。

根據CLSI推薦的彎曲菌瓊脂稀釋法(Agar Dilution Method)對菌株進行藥敏試驗。ATCC33560作為質控菌株。37 ℃微需氧培養48 h后讀取結果。根據NARMS-2014規定，萘啶酸≤16 μg/mL為敏感，32 μg/mL為中介，≥64 μg/mL為耐藥；環丙沙星≤1 μg/mL為敏感,2 μg/mL為中介，≥4 μg/mL為耐藥。

1.2.2gyrA和gyrB基因篩查gyrA基因篩查所用的引物：上游引物：5′-ATAGGTCGTGCTTTGCC-3′,下游引物：5′-GCTCTCATCTCTTACTTCAGA-3′，產物長度為700 bp；gyrB基因篩查所用的引物：上游引物5′-ATGGCAGCTAGAGGAAGAGA-3′，下游引物5′-GTGATCCATCAACATCCGCA-3′，產物長度為650 bp。50 μL PCR反應體系：2×EsayTaq PCR SurperMix 25 μL,上游引物(10 μmol/L)2.0 μL, 下游引物(10 μmol/L)2.0 μL，模板200 ng。按照以下程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個循環；72 ℃ 10 min。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，并送天一輝遠生物科技有限公司測序。

1.2.3統計學分析采用SAS9.4軟件對數據進行導入、整理和分析。對不同宿主來源菌株耐藥情況進行卡方檢驗分析，檢驗水準α=0.05。

2　結　果

2.1藥敏試驗結果234株空腸彎曲菌中共篩查到218株(93.16%)萘啶酸耐藥菌株，其中雞糞來源菌株耐藥率是100.00%，鴨糞來源菌株耐藥率是100.00%，腹瀉病人糞便來源菌株耐藥率是97.96%，食品動物來源菌株耐藥率是97.83%，牛糞來源菌株耐藥率是77.97%，耐藥率差異有統計學意義(P<0.05)，鴨糞和雞糞來源菌株耐藥率最高；211株(90.17%)環丙沙星耐藥菌株，其中雞糞和鴨糞來源菌株耐藥率均為100%，食品動物來源菌株耐藥率是95.65%，腹瀉病人糞便來源菌株耐藥率是91.84%，牛糞來源菌株耐藥率是77.97%，耐藥率差異有統計學意義(P<0.05)，雞糞和鴨糞來源菌株耐藥率最高。結果見表1。

表1空腸彎曲菌對萘啶酸和環丙沙星的耐藥情況
Tab.1Resistance for nalidixic acid and ciprofloxacin of Campylobacter jejuni

AntibioticsResistantisolates(%)Total(n/T)Humanfeaces(n/T)Chickenfeaces(n/T)Cowfeaces(n/T)Duckfeaces(n/T)Foodanimal(n/T)Nalidixicacid93．16(218/234)97．96(96/98)100．00(20/20)77．97(46/59)100(11/11)97．83(45/46)Ciprofloxacin90．17(211/234)91．84(90/98)100．00(20/20)77．97(46/59)100(11/11)95．65(44/46)

n, 耐藥菌株的數量；T, 檢測菌株的總數量

2.2基因測序分析結果選擇對萘啶酸(MIC≥64 μg/mL)或環丙沙星(MIC≥4 μg/mL)其中一種藥物耐藥或者是同時耐藥的菌株共102株進行gyrA基因和gyrB基因測序；選取空腸彎曲菌敏感菌株(萘啶酸MIC≤16 μg/mL并且環丙沙星MIC≤1 μg/mL)共27株進行gyrA基因測序。測序結果發現：

2.2.1耐藥菌株gyrA基因相關區域測序共發現23個突變位點，其中有義突變5個,分別是Thr-86-Ile，Val-149-Ile，Ser-203-Asn，Thr-206-Ala，Lys-285-Arg。所有耐藥菌株都存在Thr-86-Ile點突變，但所有敏感菌株不存在該點突變。除Thr-86-Ile突變外，耐藥菌株在Val-149-Ile，Ser-203-Asn，Thr-206-Ala，Lys-285-Arg位點也存在有義突變，但這些突變位點均不在喹諾酮類耐藥決定區范圍內(區間：69-120)[13]。并且與耐藥菌株相比，敏感菌株在Ser-203-Asn，Thr-206-Ala，Lys-285-Arg 3個點也存在有義突變，表明這3個點的突變均可能與耐藥無關。gyrA基因突變的詳細結果見表2。

2.2.2耐藥菌株gyrB基因相關區域測序顯示不存在有義突變，92.16%(94/102)的耐藥菌株存在Arg-389-Arg突變，89.22%(91/102)的耐藥菌株存在Leu-403-Leu突變，但都屬于無義突變。

表2耐藥及敏感空腸彎曲菌gyrA基因突變特征
Tab.2Mutations in the gyrA for both the resistant and sensitive C.jejuni

MutationResistantisolatesSensitiveisolatesThr?86?IleVal?149?IleSer?203?AsnThr?206?AlaLys?285?ArgSer?203?AsnThr?206?AlaLys?285?ArgIsolatesNo．102628997162710Proportion/%1005．8813．5997．066．867．771009．80

3　討　論

研究發現在臨床和獸醫藥中的不規范使用是導致彎曲菌喹諾酮類抗生素耐藥率升高的最主要原因[7]。歐美等發達國家彎曲菌對喹諾酮類抗生素的耐藥率要低于發展中國家。美國耐環丙沙星彎曲菌在1990年開始出現，1997年開始呈現增加趨勢[14]，2001-2002年美國腹瀉病人糞便源彎曲菌環丙沙星的耐藥率為13.5%，雞來源環丙沙星耐藥率為19%[15]。2011-2013年加拿大對腹瀉病人源空腸彎曲菌的耐藥率為30.8%，對結腸彎曲菌的耐藥率是41%[16]。印度在上個世紀90年代開始出現耐氟喹諾酮類彎曲菌[17]，在1994年未有對氟喹諾酮類耐藥彎曲菌的相關報道，2001-2006年升高到79%[17-18]2008-2010年高達到97%，耐藥情況非常嚴重[19]。

我國空腸彎曲菌對喹諾酮類抗生素的耐藥情況非常嚴重。1995-2010年腹瀉病人來源的空腸彎曲菌對環丙沙星的耐藥率為80.2%，對萘啶酸的耐藥率為79.3%，且隨著時間的推移，萘啶酸和環丙沙星的MIC有明顯增高的趨勢[20]。858株不同宿主來源的空、結腸彎曲菌對喹諾酮類抗生素的耐藥率接近95%[21]。2011年我國寧夏和山東兩個地區豬來源的結腸彎曲菌對環丙沙星的耐藥率高達95%以上[22]。最近研究表明，耐喹諾酮類彎曲菌在17年內增長迅速，在2000年就增長到93.7%-100%[23]。本研究中，234株空腸彎曲菌中共篩查到218株(93.16%)萘啶酸耐藥菌株，211株(90.17%)環丙沙星耐藥菌株，兩者都是鴨糞和雞糞來源菌株耐藥率最高為100.00%，是和在家禽的養殖過程中萘啶酸和環丙沙星作為飼料添加劑用于預防和治療細菌性疾病有關系。

空腸彎曲菌對喹諾酮類抗生素的耐藥與gyrA基因上QRDR特異性點突變密切相關[24-26]，且最重要最常見的是gyrA基因發生的Thr-86-Ile突變[27-30]。本研究中所有的耐喹諾酮類空腸彎曲菌均有Thr-86-Ile突變，且1株菌只發生Thr-86-Ile突變，其萘啶酸的MIC可達到512 ug/mL，環丙沙星MIC達到32 ug/mL，說明Thr-86-Ile突變是導致空腸彎曲菌對氟喹諾酮類抗生素的高水平耐藥的主要原因。

與喹諾酮類敏感菌株相比，耐喹諾酮類空腸彎曲菌除Thr-86-Ile突變外，Val-149-Ile也是特異性突變，雖然Val-149-Ile突變已有報道，但并未描述該突變是否可導致空腸彎曲菌對喹諾酮類抗生素高水平耐藥[29]。本研究中發生Val-149-Ile協同突變的菌株和未發生協同突變菌株相比，MIC值沒有增高。本研究測序結果顯示：菌株萘啶酸MIC值大于等于64 μg/mL，環丙沙星MIC值大于等于4 μg/mL時Thr-86-Ile已經發生突變；而菌株的萘啶酸MIC值大于64 μg/mL，環丙沙星MIC值為2 μg/mL時，也發生Thr-86-Ile突變，提示菌株gyrA基因發生Thr-86-Ile突變就可以導致萘啶酸和/或環丙沙星耐藥。

本研究中，未發現耐藥菌株存在gyrB基因的有義突變。研究結果與目前耐喹諾酮類空腸彎曲菌gyrB基因不存在有意義突變的報道一致[28]。

本研究通過對不同宿主來源空腸彎曲菌萘啶酸及環丙沙星的耐藥現狀及遺傳特點分析，確定所有耐藥菌株均存在gyrA基因QRDR的熱點突變Thr-86-Ile，該突變能引起空腸彎曲菌對喹諾酮類抗生素產生高水平耐藥。

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