羊傳染性膿皰病毒ORF047基因表達及其蛋白在細胞中的定位分析

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羊傳染性膿皰(Contagious ecthyma，CE)俗稱羊口瘡(Orf)，是由痘病毒科(Poxviridae)副痘病毒屬(Parapoxvirus)成員羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)引起的一種高度嗜上皮性人獸共患病[1]。主要感染羔羊和幼羊，以口、唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水皰、膿皰、痂皮為主要特征。ORFV 也能感染人[2-3]，是目前廣泛流行于我國，且危害較嚴重的人獸共患痘病毒病。由于ORFV結構復雜、編碼蛋白種類繁多，限制了人們對ORFV入侵相關機制的研究。

痘苗病毒(VACV)是痘病毒研究的模式病毒， VACV 的L1R蛋白含有250AA，N端包含有2個豆蔻?；稽c(GlyxxxSer/Thr)，而在ORFV基因組上ORF047命名為L1R，其編碼的蛋白含有245AA,含有3個豆蔻?；稽c。全長與VACV基因組中的L1R在核苷酸水平上相似性為56.9%，氨基酸水平的同源性為59.8%，在N端的前20個AA中的二者的同源性達70%，而且存在相似的結構。我們推測ORFV ORF047基因編碼的蛋白可能是VACV L1R蛋白的同系物。因此，我們克隆了ORF047基因，并構建到真核表達載體上，轉染細胞，了解其表達和定位情況，為今后后續篩選與其相互作用的蛋白及該基因在在入侵宿主細胞過程中的作用研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1細胞株與病毒株HEK-293T細胞、Vero-E6細胞和ORFV/QH02/2010分離株均由本實驗室保存。

1.2載體與試劑pEGFP-N1、pHcRed1-Nuc、pHcRed1-Mito和pHcRed1-ER等載體均購自clontech公司；DNA Marker、Primer STARTM GXL DNA聚合酶、dNTPs及病毒DNA快速提取試劑盒等相關試劑，均購自寶生物工程 (大連) 有限公司；無內毒素質粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒和PCR產物純化試劑盒、增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒均購自天根生化科技有限公司；青霉素、鏈霉素、氨芐霉素(Amp)和卡那霉素(Kan)等抗生素均購自北京索萊寶科技有限公司；EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA連接酶、預染蛋白Marker、胎牛血清(FBS)、DMEM培養基、無血清OPTI-MEM培養基，脂質體3000(LipofectamineTM 3000)轉染試劑等均購自英濰捷基(上海)貿易有限公司；EGFP抗體購自Santa cruz生物技術公司；PVDF膜購自Millipore公司。

1.3引物設計與合成根據在 GenBank 中OV-SA00毒株(NC-005336.1)ORF047基因序列，利用Primer 5.0生物信息學軟件設計2對引物?？寺∫铮篛RF 047 F：5′-CGT GAACCA GAC CGT CGT C-3′， ORF 047 R：5′-CCAGTGCACCAC GGG CTT C-3′，用于克隆ORFV ORF047基因，預計擴增片段為735 bp；表達引物：pEGFP-ORF047 F (HindIII)：5′-CCCAAGCTTGCCACCATGGGGGCCGCCG-3′，pEGFP-ORF047R (BamH I) 5′-CCGGATCCACGGACGGCGGAAATTC-3′，上述引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

1.4ORFV ORF 047基因的克隆按照病毒基因組DNA試劑盒說明書提取ORFV/QH02/2010株基因組DNA，并以此為模板， PCR擴增ORF047基因。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s、62 ℃退火1 min、72 ℃延伸50 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。 4 ℃終止反應后，用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳對產物進行檢測，并用 DNA 膠回收試劑盒純化PCR產物， 在4 ℃與pGEM-Teasy載體鏈接過夜，轉化DH5α感受態細胞，經EcoR I酶切鑒定為陽性的克隆，送上海生物公司測序，測序正確的重組質粒命名為pGEM-ORF 047。

1.5pEGFP-ORF047重組真核表達質粒的構建利用合成的表達引物，以pGEM-ORF 047質粒為模板，PCR擴增目的片段，利用HindIII和BamH I限制性內切酶雙酶切 PCR產物和pEGFP-N1質粒，分別回收、純化目的基因片段和載體片段，再利用T4 DNA連接酶，將 ORF047基因定向插入pEGFP-N1載體，轉化大腸桿菌 DH5α感受態細胞，挑取單菌落接種于含KanLB培養基，37 ℃過夜搖菌，提取質粒，經HindIII和BamH I進行酶切鑒定后，送上海生工生物工程有限公司測序，測序正確的重組質粒命名為pEGFP-ORF047。

1.6重組質粒pEGFP-ORF047轉染293T細胞用QIAGENE 公司的QIAprep spin Mininprepkit 質粒提取試劑盒提取重組質粒, 并用紫外分光光度計測其濃度和純度。按照LipofectamineTM3000說明書，轉染至293T 細胞，同時設空白、不含插入片段的空載體pEGFP-N1作對照，轉染 24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達情況。

1.7SDS-PAGE電泳檢測和Western-blot分析ORFV ORF047基因的表達轉染293T細胞48 h后收集細胞，用預冷的細胞裂解液裂解細胞，14 000 r/min離心 10 min，收集沉淀，經SDS-PAGE電泳檢測后轉印到PVDF膜上，進行Western bloting檢測，分析蛋白的表達情況，具體操作參見文獻[4]。用PBST洗滌3次，每次10 min，加入1∶400稀釋的兔抗EGFP IgG(一抗)，室溫作用1 h，洗滌3次后，加入1∶8 000羊抗兔HRP IgG 二抗，室溫孵育1 h，再用上述方法洗滌后加加入DAB顯色液，均勻滴加到PVDF膜上，顯色。

1.8ORF047基因編碼蛋白亞細胞定位觀察及分析同1.5中確定pEGFP-ORF047能夠在細胞內表達，試驗前在24孔細胞培養板中加入滅菌的細胞爬片，按照轉染293T細胞的方法，將pEGFP-ORF047質粒與pHcRed1-Nuc、pHcRed1-Mito、pHcRed1-ER質粒分別共轉染Vero-E6細胞。轉染36h后，棄掉培養基，用PBS輕輕沖洗兩次，最后加入PBS維持，輕輕用鑷子夾出細胞爬片，置于激光共聚焦顯微鏡下對樣品進行掃描觀察熒光蛋白表達狀況，結果用LSM Image Browser軟件進行分析。

2　結　果

2.1ORF-047基因擴增以提取的病毒基因組DNA作為模板，經PCR成功地擴增包含有ORFV ORF047基因完整開放閱讀框的基因片段，見圖1，與預計大小相符。

M: DL2000 DNA marker; 1-2: PCR products圖1　 ORF-047 PCR 產物電泳結果Fig.1　Agarose gel electrophoresis of PCR products

2.2pEGFP-ORF047重組質粒的鑒定以質粒 pEGM-ORF047為模板， PCR 擴增后得到約 750 bp左右的基因片段， 酶切后插入真核表達載體 pEGFP-N1，得到pEGFP-ORF047重組質粒。pEGFP-N1質粒及PCR片段經HindⅢ和BamHⅠ酶切后得到約為 4. 7 kb 的 pEGFP-N1 片段和約 735 bp的 ORF047 基因片段，測序證實目的基因ORF準確插入到載體中，見圖2。

M: DL2000 DNA marker; 1: PCR products; 2: Product digested by BamHI+Hind III圖2　pEGFP-ORF-047重組質粒酶切鑒定結果Fig.2　Restriction enzyme analysis result of recombinant plasmid pEGFP-ORF-047

2.3Western bloting結果利用倒置熒光顯微鏡觀察轉染效率。 轉染48 h后收集的細胞SDS-PAGE電泳后，Western bloting檢測結果：pEGFP-N1空載體出現約27Kd的目的條帶，而細胞對照無條帶, 推測ORF047與EGFP 融合蛋白相對分子質量約為 54Kd，結果在相應的位置出現 1 條特異性的蛋白雜交帶，說明目的蛋白得到正確表達，見圖3A、B。

M: Protein mark; 1 pEGF-ORF-047-N1 plasmid transfected into 293T cells; 2:293T cells; 3: pEGFP-N1 plasmid transfected into 293T cells圖3A　pEGF-PORF-047重組質粒轉染293T細胞Fig.3A　pEGF-ORF-047 plasmid transfected into 293T cells圖3B　pEGF-PORF-047重組質粒轉染293T細胞表達的western blotting鑒定Fig.3B　Western blotting of pEGF-ORF-047-N1 plasmid transfected into 293T cells

2.4ORF047基因編碼蛋白亞細胞定位pEGFP-ORF047質粒與pHcRed1-Nuc、pHcRed1-Mito、pHcRed1-ER分別共轉染Vero-E6細胞，36h后熒光共聚焦顯微鏡觀測結果顯示，在共轉染pEGFP-ORF047+pHcRed1-Nuc質粒的細胞中，pEGFP--ORF047表達的帶有綠色熒光的蛋白，彌散性的分布于細胞的胞漿中，不能夠與靶向定位的pHcRed1-Nuc表達紅色熒光蛋白重疊；同樣pEGFP-ORF047表達的帶有綠色熒光蛋白也不能夠與pHcRed1-ER表達的發紅色熒光蛋白重合；但是部分與pHcRed1-Mito表達的紅色熒光蛋白有一定的重疊而顯示黃光，這說明ORF047基因編碼的蛋白主要定位在胞漿中，少量分布在線粒體中，見圖4。

紅色熒光為線粒體、細胞核、內質網熒光蛋白RFP發射熒光；綠色熒光代表綠色熒光蛋白GFP發射熒光；黃色代表共定位。a-c: pEGFP-ORF047+ pHcRed1-Nuclear plasmid transfected into vero-E6 cell; d-f: pEGFP-ORF047+pHcRed1-Endoplasmic reticulum transfected into vero-E6 cell; h-j: pEGFP-ORF047+pHcRed1-Mtochondria transfected into vero-E6 圖4　共聚焦顯微鏡下觀察 pEGFP-ORF047表達蛋白在Vero-E6細胞中的定位Fig.4　Results of pEGFP-ORF047 expressed protein subcellular localization in Vero-E6 cell by cofocal (Scale bar=10 μm)

3　討　論

ORFV是痘病毒科、副痘病毒屬的成員，可引起人、綿羊、山羊以及多種野生動物接觸性感染，羊傳染性的暴發和流行不但嚴重危害養羊產業的健康發展而且威脅人們的身體健康[5-6]。

在VACV中 L1R蛋白是參與入侵融合復合物的重要蛋白之一，其暴露于MV的表面。研究表明，針對L1R的特異性抗體、單克隆抗體可以減弱VACA誘導的細胞融合，也可抑制病毒的入侵，強烈中和病毒的感染[7]。L1R蛋白在N端有一甘氨酸殘基發生豆蔻?；?個分子內二硫鍵，如果突變N 端的甘氨酸不僅阻止VACA的感染，也改變了L1R在胞內的位置，減少了胞內二硫鍵結合的構象，這證明了L1R在形成復合物的重要性[8]。也有研究證實L1R蛋白是細胞入侵和膜融合的必需分子，且不依賴細胞表面的GAG[9]。此外，表達的可溶性的L1R蛋白可阻斷病毒的入侵，并且能與細胞表面結合，因此證明L1R蛋白是一種細胞表面受體結合蛋白[10-11]。

VACV的L1R研究的較多，但是對于羊口瘡ORF047編碼的L1R還未見有研究報道。本研究先克隆了ORFV ORF047基因，與參考的序列核苷酸/氨基酸序列一致性達到98%以上。將該基因片段插入pEGFP-N1，構建了pEGFP-ORF047真核表達載體，瞬時轉染細胞后經過培養，在熒光顯微鏡下觀察到已經表達融合蛋白的細胞，通過 Western blotting 試驗驗證了融合蛋白的大小。本試驗對 pEGFP-ORF047表達蛋白的研究中也利用熒光共聚焦顯微鏡觀測不僅可以觀察到重組質粒pEGFP-ORF047在Vero-E6細胞中成功表達而且明確其主要表達的位置在胞漿中，線粒體中也有少量的表達。

本研究的結果，對后續研究ORFV編碼的L1黏膜蛋白是否與VACV上編碼的L1在其入侵過程中發揮一樣作用機制提供一定的基礎。

參考文獻：

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