甲殼素清潔生產過程中檸檬酸鈣回收工藝研究

劉 峰,李 麗,方旭波,陳小娥,*,胡道亨

(1.浙江海洋大學食品與醫藥學院,浙江舟山 316022; 2.浙江國際海運職業技術學院,浙江舟山 316104; 3.舟山市海圣生物有限公司,浙江舟山 316105)

甲殼素,廣泛存在于甲殼類動物殼內,是當前自然界中除纖維素外含量最豐富的生物聚合物,被廣泛應用于食品、醫藥等諸多領域[12]。酸堿法作為甲殼素的傳統生產方法,工藝簡單,操作方便,但生產過程中伴隨著大量含有蛋白質和無機鹽的酸堿廢水產生,處理難度較大,尤其是酸性廢水中氯離子含量高,廢水往往不能達標排放,成為困擾行業的共性問題[34]。

鑒于此,近年來有專家開始致力于應用檸檬酸替代鹽酸清潔生產甲殼素的新工藝研究,以減少高氯離子污染廢水排放。陳利梅等[5]用檸檬酸和氫氧化鈉從南美白對蝦中提取甲殼素,避免了氯含量高的酸性廢水產生,但由于堿煮脫蛋白對環境污染仍然較大,其生產工藝尚有待改進。許慶陵等[6]利用Alcalase酶脫蛋白、檸檬酸脫鈣從蝦殼中提取甲殼素,柏韻等[7]通過檸檬酸和堿性蛋白酶的作用從中國對蝦蝦殼中制備甲殼素,并通過響應面設計優化了檸檬酸脫鈣工藝,但這些研究均未涉及到檸檬酸鈣副產物的回收利用,且工藝時間較長,不利于產業化應用。研究表明,超聲波具有強烈的空化和機械效應[8],能破壞原料的組織結構,有利于促進有效物質的釋放、溶解[9],既能提高生產效率,又能大大縮減生產時間,達到減少能耗的目的。

因此,本實驗以紅蝦蝦殼為原料,選用檸檬酸代替傳統工藝的鹽酸,在堿性蛋白酶脫除蛋白質、檸檬酸脫除鈣鹽制備甲殼素工藝基礎上,結合超聲波輔助法,以檸檬酸鈣得率為指標,通過響應面優化實驗對其副產物檸檬酸鈣回收工藝條件進行優化。在制備甲殼素的同時回收了檸檬酸鈣,副產物檸檬酸鈣品質良好,可作為鏊合劑、組織穩定劑等,具有廣闊的應用前景[10]。本研究旨在為甲殼素清潔生產過程中檸檬酸鈣的回收利用提供科學的理論參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

紅蝦蝦殼 舟山市海圣生物有限公司提供;堿性蛋白酶(20萬 U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;檸檬酸(食品級) 河南興源化工產品有限公司;氫氧化鈣(食品級) 上海緣鈦化工產品有限公司;乙二胺四乙酸二鈉、鈣指示劑、高氯酸、硝酸、氯化銨等 均為國產分析純。

GZX9240MBE型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;JR22 實驗室用絞肉機 諸城市匯豐食品機械有限公司;THYP1004型消化爐 上海纖檢儀器有限公司;KSW4011 型灰化爐 上海博迅實業有限公司;Nicolet 6700 型傅立葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet 公司;EL303電子天平 梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;JJ1A 精密增力電動攪拌器 上海凌托儀器設備有限公司;DL180B 型超聲清洗儀 上海之信儀器有限公司;DFT250 高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;HH4 數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅蝦蝦殼預處理 蝦殼原料經擠壓破碎后,堿性蛋白酶酶解,酶添加量為5000 U/g,在反應溫度60 ℃、液料比10∶1 mL/g、pH8.5下反應6 h后,過濾、清洗、得到脫蛋白的蝦殼,干燥、粉碎,備用[4]。

1.2.2 甲殼素清潔生產過程中檸檬酸鈣的回收 準確稱取脫蛋白后紅蝦蝦殼25 g,在本次研究設定的條件(超聲時間、超聲溫度、液料比、檸檬酸濃度)下進行超聲處理,并攪拌,超聲工作頻率60 kHz,額定功率240 W。經過濾后,取酸濾液,測酸濾液鈣含量,計算檸檬酸鈣得率。濾渣經去離子水洗滌至中性后,干燥得甲殼素成品,計算得率并測定其主要質量指標。

取酸濾液,水浴加熱至70 ℃,邊攪拌邊加入氫氧化鈣調節濾液體系pH至6.5左右,室溫靜置24 h,待沉淀完全后過濾得白色檸檬酸鈣,去離子水洗滌以除去其表面附著的殘留物后,120 ℃烘干2～3 h,研細、過篩得白色粉狀檸檬酸鈣成品[11]。

1.2.3 單因素實驗 依據1.2.2中方法,綜合考察檸檬酸濃度、超聲時間、超聲溫度、液料比四個因素對檸檬酸鈣得率的影響。檸檬酸鈣回收的實驗條件為:固定液料比8∶1 mL/g、檸檬酸濃度為10%、超聲溫度50 ℃,考察不同超聲時間(20、30、40、50、60 min)對檸檬酸鈣得率影響;固定超聲時間30 min、液料比8∶1 mL/g、超聲溫度50 ℃,考察不同濃度檸檬酸(8%、10%、12%、14%、16%)對檸檬酸鈣得率影響;固定超聲時間30 min、檸檬酸濃度為10%、超聲溫度50 ℃,考察不同液料比(6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1 mL/g)對檸檬酸鈣得率影響;固定檸檬酸濃度為10%、液料比8∶1、超聲時間30 min,考察不同超聲溫度(40、50、60、70、80 ℃)對檸檬酸鈣得率影響。

1.2.4 檸檬酸鈣回收響應曲面優化實驗設計 依據單因素實驗結果,選取檸檬酸濃度、超聲時間、液料比為實驗因子,以檸檬酸鈣得率為指標,利用DesignExpert V 8.0.6軟件對所得結果進行分析與優化[12],以得到甲殼素清潔生產過程中檸檬酸鈣回收的最佳工藝條件。實驗因素水平設計見表1。

表1 響應面分析實驗設計因素與水平Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

1.2.5 蝦殼中鈣含量測定

1.2.5.1 蝦殼消化方法 稱取蝦殼2.5 g放入盛有50 mL消化液(硝酸∶高氯酸=4∶1)燒瓶內,放入電熱套內加熱消化,溶液透明后停止加熱,冷卻、定容備用[13]。

1.2.5.2 鈣含量測定 采用EDTA絡合滴定法測定蝦殼中鈣含量[14]。鈣含量由式1得到。

式(1)

式中:C為待測酸濾液中的鈣離子含量,mol/L;C1為EDTA物質的量濃度,mol/L;V1為EDTA消耗體積,L;V2為待測酸濾液體積,L。

1.2.6 檸檬酸鈣得率的計算 取酸濾液,按照上述1.2.5.2中的方法測其鈣含量,由式2和式3計算檸檬酸鈣得率[15]。

m(g)=M×19.8%

式(2)

式(3)

式中:m為蝦殼中鈣離子含量,g;M為脫蛋白后蝦殼質量,g;y為檸檬酸鈣得率,%;M0為鈣離子的摩爾質量,g/mol;V為酸濾液總體積,L。

1.2.7 甲殼素得率的計算 甲殼素得率由式4得出[16]。

式(4)

式中:R為甲殼素得率,%;m1為甲殼素成品質量(以干重計),g;m2為紅蝦蝦殼質量(以干重計),g。

1.2.8 甲殼素成品灰分含量測定 參照GB 5009.4-2016《食品中灰分的測定》,采用灼燒法測定甲殼素中灰分含量[17]。

1.2.9 甲殼素水分含量測定 參照GB 5009.32016《食品中水分的測定》,采用直接干燥法測定甲殼素中水分含量[18]。

1.2.10 蛋白質含量測定 參照GB 5009.52016《食品中蛋白質的測定》,采用凱氏定氮法測甲殼素中蛋白含量[19]。

1.2.11 檸檬酸鈣的紅外光譜定性分析 取少量檸檬酸鈣成品粉末與KBr混合后,經過研磨處理,由壓片模具進行壓片,通過傅立葉變換紅外光譜儀在400～4000 cm-1掃描范圍內測定紅外光譜[20]。

1.2.12 檸檬酸鈣主要質量指標檢測 檸檬酸鈣成品,外觀、含量(以干基計)、鉛(Pb)含量、干燥減量、氟化物、砷(As)的檢測,均參照GB 1903.142016《食品安全國家標準 食品營養強化劑 檸檬酸鈣》[21]。

1.3 數據處理

本實驗中,采用Origin 8.5作圖,應用SPSS 17.0進行數據分析,用DesignExpert V 8.0.6軟件優化實驗結果。

2 結果與分析

2.1 蝦殼中鈣含量

脫蛋白后的紅蝦蝦殼經消化后,通過EDTA絡合滴定法測得鈣含量為19.8%,鈣含量較高,因此,本次實驗在制備甲殼素工藝基礎上對檸檬酸鈣回收,有利于充分挖掘蝦殼中的鈣資源,變廢為寶,為甲殼素清潔生產過程中副產物綜合利用提供一條有效途徑。

2.2 檸檬酸鈣回收單因素實驗

2.2.1 超聲時間對檸檬酸鈣得率的影響 由圖1可知,檸檬酸鈣得率隨超聲時間的增加而提高。當超聲時間為40 min時,檸檬酸鈣得率達78.24%,之后隨著超聲時間的增加,檸檬酸鈣得率幾乎不再提高。這表明增加超聲時間,能提高檸檬酸分子與蝦殼中鈣離子碰撞幾率,生成的檸檬酸鈣越來越多,檸檬酸鈣得率相應提高,但超過一定時間,底物鈣濃度降低,檸檬酸鈣的生成速率有所降低,最終趨于平衡,檸檬酸鈣得率幾乎沒有變化[14]。故實驗中超聲時間約40 min比較適宜。

圖1 超聲時間對檸檬酸鈣得率的影響Fig.1 Effect of ultrasound time on the yield of calcium citrate

2.2.2 檸檬酸濃度對檸檬酸鈣得率的影響 由圖2可以看出,隨著檸檬酸濃度增加,檸檬酸鈣得率隨之提高。當檸檬酸濃度達12%時,檸檬酸鈣得率達最高值76.44%,后隨檸檬酸濃度增加,檸檬酸鈣得率有小幅度下降,但總體趨于平穩。分析原因,在8%～12%的檸檬酸濃度范圍內,底物濃度的增加,有利于檸檬酸鈣的生成,檸檬酸鈣得率提高。超過12%,反應趨于平衡,可能由于檸檬酸中的氫離子不能完全游離出來與碳酸鈣進行反應,檸檬鈣得率反而略有下降。因此,本實驗檸檬酸濃度12%左右較為適合。

圖2 檸檬酸濃度對檸檬酸鈣得率的影響Fig.2 Effect of citric acid concentration on the yield of calcium citrate

2.2.3 液料比對檸檬酸鈣得率的影響 圖3表明,當液料比小于10∶1 mL/g時,檸檬酸鈣得率隨液料比增加而明顯提高。液料比的增加有利于檸檬酸與蝦殼中的鈣鹽充分接觸,加速鈣鹽的析出,濾液中鈣含量隨之變大,檸檬酸鈣得率也隨之提高。當液料比達10∶1 mL/g后,檸檬酸鈣得率上升趨勢減緩,幾乎不再提高,因此實驗中選液料比10∶1 mL/g較佳。

圖3 液料比對檸檬酸鈣得率的影響Fig.3 Effect of solidliquid on the yield of calcium citrate

2.2.4 超聲溫度對檸檬酸鈣得率的影響 從圖4可以看出,隨著超聲溫度的增加,檸檬酸鈣得率隨之提高,當超聲溫度為50 ℃時,檸檬酸鈣得率達68.12%,超過50 ℃,檸檬酸鈣得率變化趨勢不明顯,且超聲溫度對檸檬酸鈣得率影響相對較小。綜合考慮能耗和檸檬酸鈣得率,后續響應面實驗中選擇最佳超聲溫度為50 ℃。

圖4 超聲溫度對檸檬酸鈣得率影響Fig.4 Effect of ultrasound temperature on the yield of calcium citrate

2.3 響應面優化檸檬酸鈣回收回收工藝參數

2.3.1 BoxBehnken 實驗設計與結果 依據單因素實驗結果,固定超聲處理溫度為50 ℃,檸檬酸濃度、超聲時間、液料比為實驗因子,以檸檬酸鈣得率為指標,通過響應面法優化檸檬酸鈣回收工藝,響應面實驗設計與結果見表2。

表2 響應面實驗設計與結果Table 2 Response surface experimental design and results

2.3.2 回歸方程擬合與方差分析 通過回歸擬合分析,得到檸檬酸鈣得率對超聲時間、檸檬酸濃度、液料比3個因素的二次多項式回歸模型為:Y=86.50+6.06A+2.66B+6.55C2.30AB+0.091AC2.66BC-4.00A21.33B24.56C2。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model

2.3.3 響應面圖分析 利用軟件DesignExpert獲得各響應曲面圖和等高線圖,如圖5～圖7所示。觀察圖中等高線圖,如果其形狀呈現出橢圓形狀且排列越密集,說明該因素對實驗結果影響較大,呈現出圓形且排列稀疏,說明該因素對實驗結果影響較小[22];觀察圖中響應曲面,如果其所在坡度越陡,說明相對應的工藝參數對實驗結果影響較大,其所在坡度越平緩,說明其相對應的工藝參數對實驗結果影響越小[23]。從圖5～7可以看出,圖5中檸檬酸濃度和超聲時間所對應的響應曲面坡度較陡,圖7中檸檬酸濃度和液料比所對應的響應曲面坡度也較陡,表明超聲時間和檸檬酸濃度、檸檬酸濃度和液料比的交互作用較顯著,此分析得出的結論對比于二次回歸方程分析所得的結論,兩者相一致。

圖5 檸檬酸濃度和超聲時間對檸檬酸鈣得率影響的響應面與等高圖Fig.5 Response surface and contour plots for citric acid concentration and acid leaching time on the yield of calcium citrate

圖6 超聲時間和液料比對檸檬酸鈣得率影響的響應面與等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for ultrasonic time and ratio of liquid to solid on the yield of calcium citrate

圖7 檸檬酸濃度和液料比對檸檬酸鈣得率影響的響應面與等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for citric acid concentration and ratio of liquid to solid on the yield of calcium citrate

從圖5可知,檸檬酸濃度處于較低水平時,增加超聲時間,檸檬酸鈣得率逐漸提高后趨于平穩。增加檸檬酸濃度,檸檬酸鈣得率隨著超聲時間的增加先提高,后略有降低。隨著檸檬酸濃度的增加,紅蝦蝦殼中的鈣鹽同檸檬酸反應逐漸趨于完全,反應體系呈酸性,檸檬酸鈣沉淀溶解,測得酸濾液中鈣含量變大,檸檬酸鈣得率隨時間的增加而提高,后趨于穩定。

由圖6可見,增加液料比,檸檬酸鈣得率也相應提高;超聲時間增加,隨著液料比的增加,檸檬酸鈣得率先提高后略有降低?？梢钥闯?當液料比較低時,由于檸檬酸隨反應的進行而被消耗,導致溶液pH變大,檸檬酸鈣析出吸附于甲殼素上,測得酸濾液中鈣含量變少,檸檬酸鈣得率較低;增加液料比,反應溶液體系呈酸性,檸檬酸鈣沉淀溶解,測得酸濾液中鈣含量變大,檸檬酸鈣得率也相應提高,超聲時間和液料比存在相互作用。

由圖7可以看出,當增加檸檬酸濃度和液料比時,檸檬酸鈣得率呈現出先提高后略有下降的趨勢,響應面坡度較陡,檸檬酸濃度和液料比交互作用較顯著,對檸檬酸鈣得率的影響較大。

2.3.4 驗證實驗 通過模型并結合響應面曲線圖分析,得出甲殼素清潔生產過程中檸檬酸鈣回收最佳工藝條件為:檸檬酸濃度10.33%,液料比11.94∶1 mL/g,超聲時間50 min,預測的檸檬酸鈣得率93.62%,為了簡化實際操作,選取檸檬酸濃度10%,液料比12∶1 mL/g,超聲時間50 min,在該條件下,進行重復驗證實驗,得到檸檬酸鈣得率為93.49%±0.07%,與回歸方程預測所得的檸檬酸鈣得率相對誤差僅為0.14%,說明響應面法可以有效地優化甲殼素清潔生產過程中檸檬酸鈣回收工藝。在此條件下,甲殼素得率達18.93%±0.06%。

2.4 檸檬酸鈣成品紅外光譜分析

檸檬酸鈣成品紅外光譜圖,如圖8所示。檸檬酸的特征吸收峰有νCH3297.7 cm-1,νOH3496.4 cm-1,νC=O1700.9 cm-1,νCC1178.3 cm-1,δOH775.3 cm-1[24],圖中檸檬酸鈣的峰形與之對比,較為吻合,只是稍有偏移。其中OH伸縮振動減少56.01 cm-1,出現在3440.39 cm-1處;羰基峰吸收峰減少了161.98 cm-1,出現在1538.92 cm-1處,表明羧酸與鈣離子形成了配位鍵,檸檬酸同蝦殼中鈣反應生成了檸檬酸鈣。

圖8 檸檬酸鈣成品紅外光譜圖Fig.8 Infrared spectra of calcium citrate production in chitin clean production

2.5 檸檬酸鈣成品主要質量指標分析

參照GB 1903.142016對檸檬酸鈣成品進行質量指標分析,結果見表4?？梢钥闯?檸檬酸鈣成品主要質量指標符合GB 1903.142016要求,可作為生物活性螯合劑、緩沖劑等廣泛應用于食品行業,具有廣闊的應用發展前景。

表4 檸檬酸鈣成品的主要質量指標Table 4 The main quality indicators of calcium citrate products

2.6 甲殼素成品質量分析

甲殼素成品主要質量指標,如表5所示?？梢钥闯?甲殼素成品質量指標達到食品級標準[25]。在保證甲殼素成品質量的條件下,實現副產物檸檬酸鈣最大回收利用,既降低了環保壓力,又能合理利用資源。

表5 甲殼素成品質量分析Table 5 Quality analysis of chitin prepared by the optimum parameter

3 結論

本實驗在堿性蛋白酶脫蛋白、檸檬酸脫鈣制備甲殼素的工藝基礎上,結合超聲輔助法,采用響應面實驗設計對副產物檸檬酸鈣回收工藝條件進行優化,得到最優工藝條件:檸檬酸濃度10%,液料比12∶1 mL/g,超聲時間50 min,此時檸檬酸鈣得率達93.49%±0.07%,在此條件下,甲殼素的得率達18.93%±0.06%。檸檬酸鈣成品經傅立葉變換紅外光譜儀定性分析,并參照GB 1903.142016主要質量指標進行定量檢測,其檸檬酸鈣含量達97.61%,符合我國檸檬酸鈣食品添加劑要求,在食品行業中應用范圍廣。甲殼素成品主要質量指標經檢測,達到食品級標準。

本次研究在兼顧甲殼素質量的前提下,首次對甲殼素清潔生產過程中檸檬酸鈣回收工藝進行優化,有利于充分挖掘蝦殼的利用價值,提高生產廠家的利潤,因而具有較好的市場推廣應用價值。

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