柘樹植物酵素中氨基酸分析及抗氧化性能研究

程勇杰,陳小偉,張沙沙,樓 堅,張 婷,王珍珍,毛旸晨,沙如意,*,毛建衛,*

(1.浙江科技學院生物與化學工程學院,浙江杭州 310023;2.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室,浙江杭州 310023;3.浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心,浙江杭州 310023;4.杭州醫學院,浙江杭州 310053)

食用植物酵素(Plant Jiaosu)是以一種或多種新鮮蔬菜、水果、谷豆類、海藻類、藥食兩用本草類等食材為原料,加(或不加)糖類物質,經多種有益菌通過較長時間發酵而生產的功能性微生物發酵產品[14],含有豐富的次生代謝產物、植物本身營養成分和益生菌等功能成分,特別是小分子功能成分[57]。

氨基酸是食用植物酵素品質的組成成分之一。蛋白質并不能被人體直接利用,而是在消化酶的作用下分解成低分子的多肽或氨基酸才被吸收利用。氨基酸可以保持體內總氮平衡、轉化成糖或者脂肪以提供能量以及參與激素、酶等的合成[89]。氨基酸不僅是合成蛋白質的物質基礎,還可以保障機體正常的新陳代謝,維持生命。無論人體缺乏任何一種必需氨基酸還是非必需氨基酸,都會導致代謝功能的異常,產生代謝功能障礙,甚至產生某些疾病[10]。目前對于食用植物酵素中的氨基酸研究甚少,且氨基酸的種類多,含量差別大,影響因素多,這些都直接影響了對食用植物酵素功能性的評價。

柘樹(CudraniatricuspidataBur.)為?？?Moraceae)柘屬(Cudrania)植物[11]。柘樹植物全身都是寶,其莖皮可作造紙原料,木材可作染料,心材可作高檔家具,葉可來飼喂蠶蟲,根皮可藥用,治腎虛耳鳴、腰膝冷痛、黃痘、瘡巧、咯血等[1214]。柘樹果實可煎湯內服亦可直接食用,可外敷,具有清涼活血,舒經活絡的作用[15]。目前從柘樹植物中分離出大量異戊烯基氧雜蒽酮化合物、黃酮類化合物、異黃酮類化合物和生物堿[1619]等具有顯著的抗氧化、抑菌、抗炎、抗腫瘤等[2022]生物活性。國外僅有少數關于柘樹提取物抗氧化活性及其在防止肥胖上的應用研究報道[2325],國內對柘樹植物活性物研究極少,對于柘樹的果實、花和葉子及加工利用的研究尚未見報道。本文以柘樹為原料制備食用植物酵素,研究其發酵產物中氨基酸成分變化與抗氧化的相關性,對于柘樹的高值化生物利用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柘樹小青果、花、葉 2016年5月10日采自浙江省長興縣柘樹合作社;復合糖漿 浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室制備；鹽酸(優級純)、重蒸苯酚(分析純)、檸檬酸鈉緩沖液、檸檬酸(優級純)、氫氧化鈉(優級純)、冰乙酸(色譜純)、茚三酮(分析純)、抗壞血酸(分析純) 國藥化學試劑有限公司(上海,中國);α,α二苯基β-苦苯肼(DPPH)、2,2聯氮基雙(3乙基苯并噻唑啉6-磺酸)二氨鹽(ABTS) 美國Sigma公司;混合氨基酸標準液 日本和光純業工業株式會社。

PHS3C精密酸度計 杭州齊威儀器有限公司;HZTB3002電子稱、PTXFA210電子天平 福州華志科學儀器有限公司;GZX9140MBE電熱恒溫鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;SWCJ型超凈工作臺 無錫易純凈化設備有限公司;KQ300E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;L8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司;真空干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 柘樹植物酵素的制備 用無菌水輕輕沖洗除去柘樹小青果、花和葉表面的沙子和灰塵,常溫晾干。柘樹小青果、花和葉分別與糖漿按質量比3∶4,加入到已滅菌的玻璃發酵瓶中,封口,放在暗處,常溫下發酵150 d,取液體樣,于10000 r/min離心10 min后,保留上清液待用。

1.2.2 氨基酸定性定量分析 氨基酸分析的條件參考國標GB/T 5009.1242003[26],略有改進,具體分析條件如下:氨基酸分析儀;色譜柱:磺酸型陽離子樹脂分離柱(4.6 mm×60 mm×3 μm);檢測器:熒光檢測器;流動相:檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液;流速:0.4 mL/min;分離柱柱溫:57 ℃;反應柱柱溫:135 ℃;進樣量:20 μL;檢測波長:通道一570 nm,通道二440 nm。

取1 mL樣品加到玻璃水解管中,加入10 mL 6 mol/L的HCl溶液,加重蒸酚3～4滴,冷卻5 min,向水解管中充入一定量的氮氣,在氮氣環境下迅速封管,在110 ℃下水解22 h。冷卻之后打開水解管,將水解液全部移至50 mL容量瓶中,用去離子水清洗、過濾及定容。再取2 mL濾液真空干燥,反復2次,最后蒸干,然后加0.02 mol/L檸檬酸鈉緩沖液1 mL,過0.22 μm濾膜過濾后上機。

采用外標法測定柘樹三種酵素的氨基酸種類及含量。

1.2.3 營養評價 氨基酸的含量以濃度(mg/mL)表示,計算樣品中的必需氨基酸的比值(RAA)、氨基酸比值系數(RC)及比值系數分(SRC)。其中RAA及RC的數值越趨向1,表示該樣品的氨基酸越接近WHO/FAO的推薦值;SRC作為評判營養價值的指標,其值越接近100,則表示該樣品的各種必需氨基酸的含量越均衡,營養價值就越高[2729]。

1.2.4 ABTS自由基清除能力測定 參考Re R[30]的方法,略有改動。將過硫酸鉀溶液加入到7 mmol/L ABTS(用5 mmol/L的pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制),使得ABTS最終濃度為2.45 mmol/L,在室溫下黑暗處放置12～16 h。使用前利用PBS緩沖液將ABTS溶液稀釋至吸光度為0.7±0.02(734 nm)。

分別取1、2、3、4、5 μL樣品,添加磷酸鹽緩沖液至300 μL,再加入5 mL上述ABTS稀釋液,在30 ℃下,反應1 h。以去離子水為參比溶液,以VC(4 mg/mL)為對照。在734 nm下測定吸光度,并計算IC50。

ABTS自由基清除能力(%)=[1(A1A2)/(A0A2)]×100

式中:A0:空白對照液的吸光度;A1:樣品測定管的吸光度;A2:樣品本底管的吸光度。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測定 參考Blois[31]方法,略有改進,具體方法如下:分別取5、10、15、20、25、30 μL樣品,加純水至2 mL,分別加入到4 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液中,再加入450 μL 50 mmol/L TrisHCl buffer,25 ℃下恒溫水浴30 min。以去離子水為參比溶液,以VC(4 mg/mL)為對照。在517 nm下測定吸光度,并計算IC50。

DPPH自由基清除能力(%)=[1(B1B2)/(B0B2)]×100

式中:B0:空白對照液的吸光度;B1:樣品測定管的吸光度;B2:樣品本底管的吸光度。

1.2.6 羥基自由基清除能力測定 參考Liu W[32]方法,略有改進,具體方法如下:分別取25、50、100、150、200 μL樣品,加純水至2 mL,再加入1.4 mL 6 mmol/L H2O2溶液,然后加入0.6 mL 20 mmol/L 水楊酸鈉和2 mL 1.5 mmol/L硫酸亞鐵,混勻,37 ℃下恒溫水浴1 h。以去離子水為參比溶液,以VC(8 mg/mL)為對照。在510 nm下測定吸光度,并計算IC50。

羥基自由基清除能力(%)=[1(C1C2)/(C0C2)]×100

式中:C0:空白對照液的吸光度;C1:樣品測定管的吸光度;C2:樣品本底管的吸光度。

1.2.7 還原力測定 參考Yildirim[33]方法,略有改進,具體方法如下:分別取5、10、15、20、25 μL樣品加磷酸緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)至2.5 mL,然后加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀,混合均勻,50 ℃下恒溫水浴30 min,再加入2.5 mL 10%三氯乙酸,混合均勻,靜置10 min,立即取2.5 mL上清液,加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵,混勻,以去離子水為參比溶液,以VC(4 mg/mL)為對照。在700 nm下測定,并計算IC50(吸光度為0.5)。吸光度值越高則表示還原力越強。

1.3 數據處理

實驗中每個處理重復三次,數據以平均值±標準差的形式呈現(n=3),采用單因素方法分析進行顯著性差異分析,采用SPSS 16.0軟件進行數據的IC50計算以及相關性分析,應用Excel軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 色譜分析

氨基酸標品的色譜圖見圖1,從圖1中可以看出各種氨基酸可以有效分離。由表1可以看出,柘樹小青果、柘樹花、柘樹葉三種酵素中含有豐富的氨基酸,其總含量分別為12.667、2.870、1.198 mg/mL,其中人體必需的八種氨基酸(賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸)總含量分別為4.156、0.943、0.479 mg/mL,營養價值豐富。柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素中的氨基酸主要是以天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和賴氨酸為主;半胱氨酸和蛋氨酸含量極少,柘樹葉酵素中在檢測限范圍內未檢出半胱氨酸和蛋氨酸;柘樹小青果酵素和柘樹花酵素含有17種氨基酸,柘樹小青果酵素無論在氨基酸總量還是單個氨基酸含量均顯著高于柘樹花酵素和柘樹葉酵素。

圖1 氨基酸標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard amino acids

表1 柘樹小青果酵素、柘樹花酵素、柘樹葉酵素中氨基酸的種類與含量分析Table 1 Analysis of types and concentration for amino acids from Jiaosu of Cudrania tricuspidata fruits,flowers and leaves

由表2可知,柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素中Met+Cys和Phe+Tyr占總氨基酸的質量分數均低于WHO/FAO模式譜標準;柘樹小青果酵素除了以上兩種之外,其他必需氨基酸均高于WHO/FAO模式譜標準。三類酵素均較符合WHO/FAO模式譜標準,柘樹小青果酵素和柘樹花酵素的Ile的含量較高,柘樹葉酵素的Thr、Val和Lys含量較高。通過計算SRC,得到柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素的SRC分別為54.31、31.65和46.49。說明柘樹小青果的氨基酸含量更加均衡,營養價值更高。

表2 柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素中人體必需氨基酸的比例與模式譜比較Table 2 Essential amino acid composition and pattern spectrum in Jiaosu of Cudrania tricuspidata fruits,flowers and leaves

2.2 柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素自由基清除能力

2.2.1 柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素對ABTS自由基清除能力 向含有ABTS衍生陽離子的溶液中加入抗氧化劑使其在734 nm處的吸光度降低,可用于檢測抗氧化劑的ABTS清除能力。柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素對ABTS自由基清除能力的測定結果,如圖2所示。

圖2 三種酵素對ABTS自由基清除能力的影響Fig.2 Effect of three plant Jiaosu on ABTS radical scavenging ability

由圖2可知,柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素對ABTS自由基均具有優異的清除能力,隨著樣品量的增加,對ABTS自由基清除能力具有顯著的樣品加入量依賴性。在本研究的樣品加入量范圍內,柘樹小青果酵素對ABTS自由基清除能力明顯優于柘樹花酵素和柘樹葉酵素。柘樹小青果酵素和柘樹花酵素對ABTS自由基清除能力高于VC對照組,而柘樹葉酵素對ABTS自由基的清除率略低于VC對照組。經計算,柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素對ABTS自由基的清除力IC50分別為:1.844、2.988和5.107 mg VC當量/mL。依據IC50來看,ABTS自由基清除能力大小順序依次是:柘樹小青果酵素>柘樹花酵素>VC(4 mg/mL)>柘樹葉酵素。

2.2.2 柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素對DPPH自由基的清除能力 柘樹果實酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素對DPPH自由基清除能力的測定結果如圖3所示。

圖3 三種酵素對DPPH自由基清除能力的影響Fig.3 Effect of three plant Jiaosu on DPPH scavenging ability

由圖3可知,柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素對于DPPH自由基都具有良好的清除能力,在實驗濃度范圍內,柘樹小青果酵素對DPPH自由基清除能力基本都優于柘樹花酵素和柘樹葉酵素,在取樣量在5～15 μL時,柘樹葉酵素的DPPH自由基清除能力高于柘樹花酵素,在取樣量在20～30 μL時,柘樹葉酵素的DPPH自由基清除能力低于于柘樹花酵素。經計算,柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素的IC50分別為:4.027、4.990和5.854 mg VC當量/mL。依據IC50來看,DPPH自由基清除能力大小順序依次是:VC(4 mg/mL)>柘樹小青果酵素>柘樹花酵素>柘樹葉酵素。Billaud S C C等[34]發現葡萄糖與半胱氨酸產生的美拉德反應產物抗氧化性較好,要歸因于半胱氨酸巰基對DPPH自由基的清除能力。

2.2.3 柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素對羥基自由基的清除能力 柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素對羥基自由基的清除能力測定結果,如圖4所示。

圖4 三種酵素對羥基自由基清除能力的影響Fig.4 Effect of three plant Jiaosu on ydroxyl radical scavenging ability

由圖4可知,當加樣量在25～150 μL之間,柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素明顯優于VC對照,而當樣品加入量達到200 μL時,VC對照的羥基自由基清除能力高于柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素。經計算,柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素的對羥基自由基清除率的IC50分別為:2.846、7.614和4.726 mg VC當量/mL。依據IC50來看,羥基自由基清除能力大小順序依次是:柘樹小青果酵素>柘樹葉酵素>VC(8 mg/mL)>柘樹花酵素。相對于其他的自由基清除能力,柘樹葉酵素對羥基自由基的清除能力比柘樹花酵素更高,可能是由于柘樹葉酵素發酵液中存在高效清除羥基自由基的活性物質。羅海英等[35]研究發現,Gly、Ala、Glu對羥基自由基有較強的清除作用,3種nanoSe-氨基酸溶膠對羥基自由基具有 一定的清除作用,在一定濃度范圍內隨溶膠劑量的增加而增加,然后趨于平緩。胡文琴等[36]研究表明,許多氨基酸及其衍生物有清除自由基的能力,如:Lys、His、Tyr、Met、Pro、Arg、Glu、Cys等,而含有Tyr、His、Lys、Pro等氨基酸的多肽一般具有較強的清除羥基自由基能力。

2.2.4 柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素還原力測定 柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素還原力測定結果,如圖5所示。

圖5 三種酵素對還原力的影響Fig.5 Effect of three plant Jiaosu on reducing power

由圖5可知,柘樹小青果酵素還原力明顯優于柘樹花酵素和柘樹葉酵素,都具有一定的濃度依賴性,均低于VC對照組。經計算,柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素的IC50分別為:4.902、9.467和10.629 mg VC當量/mL。依據IC50來看,還原力大小順序依次是:VC(4 mg/mL)>柘樹小青果酵素>柘樹花酵素>柘樹葉酵素。雖然柘樹花酵素的氨基酸含量(2.869 mg/mL)比柘樹葉酵素氨基酸含量(1.198 mg/mL)高,但從圖5來看,兩種酵素的還原力并無顯著性差異,可能是還原力的大小不僅與自由基的清除有關,還與過氧化物降解等因素有關。張曉溪等[37]研究發現,Cys本身就存在還原能力,其余三種氨基酸經過美拉德反應之后還原能力增強。

2.3 柘樹酵素氨基酸含量與抗氧化性相關分析

為了解三種拓樹酵素氨基酸與抗氧化活性指標的相互關系,分析柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素中氨基酸組成和含量與還原力、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和羥基自由基清除率的相關性,結果如表3所示。

表3 柘樹酵素氨基酸含量與抗氧化性相關分析Table 3 Correlation between amino acid content and antioxidant activity of Cudrania tricuspidata Jiaosu

氨基酸總量與ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率的IC50具有負相關性,但無統計學意義，與還原力IC50具有顯著的負相關性(p<0.05),Pearson相關系數r=0.998。氨基酸總量與ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率和還原力IC50呈負相關,意味著具有最高氨基酸含量的柘樹酵素具有最大的抗氧化性能。進一步分析影響抗氧化性能的氨基酸種類,發現Asp、Glu、Ala、His、Arg和Pro這六種氨基酸含量與還原力IC50呈顯著負相關關系,Pearson相關系數|r|>0.998,說明這六種氨基酸起著主要的抗氧化作用,而從氨基酸總量和各種氨基酸含量的相關性分析結果可以看出,這六種氨基酸總量與總氨基酸含量呈高度顯著正相關性,Pearson相關系數均為1.000,進一步證實了Asp、Glu、Ala、His、Arg和Pro等六種主要氨基酸在還原力抗氧化性能上起著主要的影響因素。這與Farvin等[38]報道的氨基酸序列上的His、Arg等具有抗氧化性的結果相一致,相似地,Martineztome等[39]在研究中也發現Asp、Glu、Ala、Pro等水溶性氨基酸具有抑制脂質過氧化的能力,但是在EDTAFe和羥基自由基的系統中,溶解在水中的Thr氨基酸卻具有顯著的促氧化活性。本研究中發現Thr氨基酸對于清除DPPH自由基、ABTS自由基和還原力維持等抗氧化性指標上具有相對較低的相關系數,具體原因還有待于進一步的實驗證實。所有這些結果表明氨基酸含量和種類可能是柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素抗氧化能力良好的預測因子。某些氨基酸含量與抗氧化性能有顯著線性相關性,這可以為氨基酸類抗氧化食品的開發提供一些有價值的信息。

至于氨基酸含量和種類與DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和羥基自由基清除率的相關性并不顯著,這可能與氨基酸并不是三種抗氧化評價特異性指標有關,而且在柘樹酵素中可能還存在著抗壞血酸、總酚、維生素E、總多糖、有機酸等活性成分,這也會對抗氧化劑起到協同或者增效的作用,導致具有相似氨基酸濃度的樣品可能具有顯著差異的抗氧化活性[40]。另一方面,本研究采用的為發酵150 d柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素,在發酵過程中,氨基酸作為初級代謝產物,也可以作為底物被合成不同的次級代謝產物,而且不同的氨基酸之間也會發生相互轉化,因此,在不同的發酵終點得到樣品的抗氧化性能可能明顯不同,而表現出最終的抗氧化測定結果與動力學參數評估不相符的現象[41]。

抗氧化劑可能通過幾種作用機制起到抗氧化作用,例如抑制自由基的產生,提高對自由基的清除能力,還原能力和金屬螯合能力等[42],需要綜合利用多種抗氧化指標進行抗氧化效果的評價,由于不同的抗氧化評價是基于不同的反應機制,因此在利用同一種抗氧化劑進行抗氧化評價時經常會得出完全不同的結果,為了可以從一種抗氧化評價指標預測到另一種抗氧化指標,需要對不同的抗氧化評價指標進行相關性分析。DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、羥基自由基清除率和還原力等四種抗氧化指標的相關性分析如表3所示。

無論基于何種反應機制,四種抗氧化評價之間均呈正相關性,其中還原力與DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和羥基自由基清除率具有良好的線性相關性,Pearson相關系數r>0.65,說明還原力的測定可以為本研究中評價柘樹酵素的抗氧化性提供有價值的信息。另一方面,羥基自由基清除率和DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率之間具有弱相關性,Pearson相關系數r>0.20,可能與在清除羥基自由基過程中存在的促氧化性物質有關。特別是DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率具有強的相關性,這點與許多研究不同抗氧化評價結果的相關性相一致[43],這也為柘樹酵素產品抗氧化評價提供了可靠的數據信息。

3 結論

本實驗通過測定柘樹酵素氨基酸種類與含量以及抗氧化性能得出,柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素含有豐富的氨基酸,且種類較齊全,總氨基酸含量分別為12.667、2.870和1.198 mg/mL,包含人體必需的八種氨基酸含量分別達4.156、0.943和0.479 mg/mL。其中柘樹小青果酵素中人體必需氨基酸的含量更均衡,營養價值更高?？寡趸钚匝芯勘砻鳎鸿蠘湫∏喙退刈杂苫宄芰炗阼蠘浠ń退睾丸蠘淙~酵素,除羥基自由基清除能力外，其他自由基清除能力的大小為柘樹小青果酵素>柘樹花酵素>柘樹葉酵素,且還原力、DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力和ABTS自由基清除能力均表現出明顯的劑量依賴性;柘樹酵素氨基酸含量與抗氧化性相關分析結果表明,可以通過測定拓樹酵素中的氨基酸含量來表征其抗氧化特性,Asp、Glu、Ala、His、Arg和Pro這六種氨基酸與柘樹酵素的還原力具有顯著相關性,起主要的抗氧化作用。所以在一定程度上可以說明柘樹酵素中的氨基酸具有良好的抗氧化效果,從而可以說明食用柘樹植物酵素具有功能定向保健食品的巨大潛力。本研究為進一步開發酵素類功能性產品提供實驗依據。

[1]蔣增良,毛建衛,黃俊,等. 葡萄酵素在天然發酵過程中體外抗氧化性能的變化[J]. 中國食品學報,2014,14(10):2934.

[2]毛建衛,吳元鋒,方晟. 微生物酵素研究進展[J]. 發酵科技通訊,2010,39(3):4244.

[3]蔣增良,毛建衛,黃俊,等. 藍莓酵素在天然發酵過程中抗氧化性能的變化[J]. 食品工業科技,2013,34(2):194-197,201.

[4]中國生物發酵產業協會. T/CBFIA 080012016,酵素產品分類導則[S]. 北京:中國標準出版社,2016.

[5]王珍珍,沙如意,蔡成崗,等. 樹莓酵素中耐高滲酵母菌的分離鑒定及生長特性研究[J].食品工業科技,2017,38(8):178182,188.

[6]蔣增良,毛建衛,黃俊,等. 葡萄酵素在天然發酵過程中體外抗氧化性能的變化[J]. 中國食品學報,2014,14(10):2934.

[7]蔣增良. 天然微生物酵素發酵機理、代謝過程及生物活性研究[D]. 杭州:浙江理工大學,2013:16.

[8]邵士慧. 食品中氨基酸的作用及測定方法[J]. 湖南農機,2016(4):92.

[9]劉艷,王志宏,曲金瑤,等. 乙酰半胱氨酸口服溶液抑菌劑抑菌效力研究[J]. 齊魯藥事,2015(3):152155.

[10]張春曉,蔣瀅,黃美英,等. 不同肝臟疾病患者血漿游離氨基酸水平改變的模式[J]. 氨基酸和生物資源,2002,24(2):4345.

[11]張志,吳海健,皮恩浩,等. 柘樹黃酮體內外抗腫瘤作用研究[J].世界臨床藥物,2009,10:601605.

[12]李波,王美,譚亞南,等. HPLCDAD同時測定柘樹和構棘根與莖中4種黃酮類成分的含量[J]. 中國中藥雜志,2013,38(2):166170.

[13]吳海健. 柘樹總黃酮的質量標準及制劑研究[D]. 上海:復旦大學,2008.

[14]石磊. 柘樹化學成分及藥理作用的研究進展[J]. 曲阜師范大學學報:自然科學版,2010,36(3):8894.

[15]楊久琳,張巖. 柘樹化學成分及生物活性的研究進展[J].中國藥房,2015(6):861864.

[16]曹春廷,孫叢龍,白衛濱,等. 柘樹果實的抗乳腺癌活性部分的提取、分離及結構鑒定[J]. 食品科學,2015(13):4851.

[17]王枚博,黃建明,侯愛君. RPHPLC法測定柘樹根中四種異戊烯基口山酮的含量[J].復旦學報:醫學版,2006(4):559562.

[18]董國霞,陳靠山,石磊,等. 柘樹根多糖CPS1的分離純化及理化性質分析[J]. 中國藥學雜志,2006,41(23):18311833.

[19]皮恩浩. 柘樹抗腫瘤活性成分的藥代動力學研究[D]. 上海:復旦大學,2010.

[20]徐譽泰,張可煒,李艷,等. 柘樹黃酮對胃癌細胞株NKM大分子合成的影響[J]. 中醫藥學報,1998,26(5):4748.

[21]曹春廷. 柘樹果實抗氧化成分分析及其異黃酮Scandenolone誘導乳腺癌細胞凋亡通路研究[D]. 雅安:四川農業大學,2015.

[22]ChangHo Jeong.Invitroantioxidative activities and phenolic composition of hot water extract from different parts ofCudraniatricuspidata[J]. Preventive Nutrition and Food Science,2009,14(4):283289.

[23]DaeHun Kang. Antioxidant activities of extracts from fermented mulberry(Cudraniatricuspidata)fruit and inhibitory actions on elastase and tyrosinase[J]. Korean Journal of Food Preservation,2011,18(2):236243.

[24]Suh DH,Jung E S,Park H M,et al. Comparison of metabolites variation and antiobesity effects of fermented versus nonfermented mixtures ofCudraniatricuspidata,Loniceracaerulea,and soybean according to fermentationinvitroandinvivo[J]. Plos One,2016,11(2):e0149022.

[25]SoRa Choi. Antioxidant activity of methanol extracts fromCudraniatricuspidatabureau according to harvesting parts and time[J]. Korean Journal of Medicinal Crop Science,2009,17(2):115120.

[26]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會. GB/T 5009.1242003,食品中氨基酸的測定[S]. 北京:中國標準出版社,2015.

[27]FAO/WHO.Report of a joint FAO/WHO ad hoc expert committee:Rom energy and protein requirements[C].World Health Organization:Switzerland,1983:3638.

[28]魯敏,安華明,趙小紅. 無籽刺梨與刺梨果實中氨基酸分析[J]. 食品科學,2015(14):118121.

[29]嚴冬,楊鑫嵎. 西藏不同產地冬蟲夏草中氨基酸成分分析及其營養價值評價[J]. 中國農學通報,2014,30(3):281284.

[30]Re R,Pellegrini N,Proteggente A,et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Free Radical Biological and Medicine,1999,26(910):12311237.

[31]Blois M S. Antioxidant determination by the use of a stable free radical[J]. Nature,1958,181:11991200.

[32]Liu Wei. Preparation of a hydroxypropyl Ganoderma lucidum polysaccharide and its physicochemical properties[J]. Food Chemistry,2010,122(4):965971.

[33]Yildirim A,Mavi A,Kara A A. Determination of antioxidant and antimicrobial activities ofRumescrispusL. extracts[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2001,49(8):40834089.

[34]C Sophie,B Catherine,P Stephan,et al. A comparison study between antioxidant and mutagenic properties of cysteine glucosederived Maillard reaction products and neoformed products from heated cysteine and hydroxymethylfurfural[J]. Food Chemistry,2009,114:132138.

[35]羅海英,周艷暉,白燕,等. 納米硒氨基酸溶膠的抗氧化作用[J]. 食品科技,2011,36(4):202206,210.

[36]胡文琴,王恬,霍永久,等. 酪蛋白酶解物體外抗氧化作用的研究[J]. 食品科學,2004(4):158162.

[37]張曉溪,曾艷,張澤生,等. 果糖與氨基酸美拉德反應產物的抗氧化性研究[J]. 食品工業科技,2011,32(6):175-178,240.

[38]Farvin K H S,Baron C P,Nielsen N S,et al. Antioxidant activity of yoghurt peptides:Part 2Characterisation of peptide fractions.[J]. Food Chemistry,2010,123(4):10901097.

[39]Martineztome MartinezTome. Comparison of the antioxidant and prooxidant activiteis of broccoli amino acid with those of common food additives[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2001,81(10):10191026.

[40]Terpinc P. Studies of the correlation between antioxidant properties and the total phenolic content of different oil cake extracts[J]. Industrial Crops and Products,2012,39(1):210217.

[41]Terpinc Petra. A kinetic approach for evaluation of the antioxidant activity of selected phenolic acids[J]. Food Chemistry,2010,121(2):366371.

[42]Huang Deijian,Ou Boxin,Prior Ronald L. The chemistry behind antioxidant capacity assays[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(6):18411856.

[43]Neo YunPing,Ariffin A,Tan C P,et al. Phenolic acid analysis and antioxidant activity assessment of oil palm(E.guineensis)fruit extracts[J]. Food Chemistry,2010,122(1):353359.