逆流超聲輔助酶解法制備大米ACE抑制肽

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(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013)

米渣是生產淀粉、糖、味精、檸檬酸及釀酒等產品的加工副產物[1],富含優質的蛋白(40%～65%)[1],目前主要用于動物飼料生產,沒有挖掘其潛在價值進行高值化利用,難以實現米渣價值的最大化,因此,急需對米渣進行精深加工。

研究表明,酶解菜籽粕[2]、玉米胚芽粕[3]等植物原料制備的血管緊張素轉換酶(Angiotensin-I Converting Enzyme,ACE)抑制肽能有效地降低血壓,因此,從米渣中提取大米蛋白用于酶解制備ACE抑制肽有望實現對米渣的高值化利用。近年來,非熱物理加工技術發展迅速,已廣泛的應用于食品深加工研究領域[4]。尤其是超聲波技術,已經在促進活性成分的提取[5]、輔助酶解[6]和促進蛋白乳化[7]等方面起到顯著的效果,其中最為顯著的是在超聲輔助酶解方面,能夠有效地解決酶解產物活性不高、酶解不充分[8]等問題,如毛麗琴[9]用超聲波輔助酶解制備ACE抑制肽。但傳統的超聲設備如李敏[10]等人使用的超聲清洗機,張輝[11]使用的超聲探頭發生器均存在超聲頻率固定、超聲不均勻、設備不易放大等缺陷,很難應用于工業化生產。因此,需要研發新型超聲設備解決此類問題。

本文使用自主研發的新型逆流超聲設備,可更換超聲頻率,逆流超聲使超聲更均勻。以大米蛋白為研究對象,首先優化酶解參數,在最優酶解參數基礎上,研究不同超聲參數預處理對大米蛋白酶解物ACE抑制活性的影響。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

米渣(實驗測定蛋白含量56.1%)湖北京源山生物科技股份有限公司;ACE自提[12](200 g豬肺可提取ACE 356.41 U,比活力3.00412×104U/g);馬尿酸(Hippuric acid,Hip)中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司;馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-His-Leu tetrahydrate,HHL)美國Sigma公司;堿性蛋白酶(酶活2.09454×105U/g)河南鑫宏泰生物科技有限公司;甲醇、乙腈上海安普實驗科技股份有限公司。

JY98-IIIDN型超聲細胞粉碎機寧波新芝生物科技股份有限公司;逆流超聲波設備江蘇大學食品與生物工程學院(見圖1);DF-1型集熱式恒溫磁力攪拌器金壇市中大儀器廠;DR-5C型低溫冷凍離心機上海安亭科學儀器廠;PHS-3C型酸度計上海鴻蓋儀器有限公司;Card-Waters型高效液相色譜系統美國Waters公司;ALPHA-2-4 Card-真空冷凍干燥機德國Martin Christ公司。

圖1　超聲設備示意圖Fig.1　Schematic diagram of ultrasonic equipment

1.2　實驗方法

1.2.1大米蛋白的提取參考Yang[13]等所描述的大米蛋白提取方法,將80 g米渣加入1000 mL蒸餾水,用3 mol/L的NaOH溶液調節混合液的pH,熱水浴使溫度穩定在50 ℃,攪拌3 h,穩定pH為7.8。然后在5000 r/min下離心15 min,取上清液用3 mol/L的鹽酸調節pH到4.0,再在5030×g離心力下離心15 min,將沉淀重新懸浮于蒸餾水中,調節pH為7。使用冷凍干燥機將懸浮液干燥,采用凱氏定氮法測定蛋白含量(GB/T 5009.5-2003)。所提取的大米蛋白保存在干燥皿中待用。

1.2.2酶解參數的單因素篩選用堿性蛋白酶對底物蛋白進行酶解,根據Li[14]等的研究略作修改,初始設定酶解參數條件為底物濃度30 g/L、加酶量7.5%、酶解時間60 min、溫度50 ℃、pH8.5,采用單因素逐級優化法,以ACE抑制率為主要指標,篩選底物濃度參數,確定最優底物濃度后同樣的方法依次篩選加酶量、溫度、pH、時間。

1.2.2.1不同底物濃度對ACE抑制率的影響分別將12 g大米蛋白加入600、400、300、240和200 mL蒸餾水中配成濃度分別為20、30、40、50和60 g/L蛋白溶液,實驗條件采用反應溫度50 ℃,加酶量為7.5%(E/S),pH8.5,酶解時間60 min。在酶解過程中不斷滴加1 mol/L NaOH調節pH,記錄消耗的堿量并計算DH,酶解結束后,沸水浴滅酶10 min,然后在5000 r/min離心10 min,取上清液稀釋50倍檢測ACE抑制率。

1.2.2.2不同加酶量對ACE抑制率的影響實驗條件采用底物濃度30 g/L,反應溫度50 ℃,維持pH為8.5,酶解時間60 min,按照設定的加酶量4.5%(E/S)、6%(E/S)、7.5%(E/S)、9%(E/S)、10.5%(E/S),分別加入5.4、7.2、9.0、10.8和12.6 mL堿性蛋白酶,后續酶解操作同1.2.2.1。

1.2.2.3不同溫度對ACE抑制率的影響實驗條件采用底物濃度30 g/L,加酶量7.5%(E/S),維持 pH為8.5,酶解時間60 min,溫度分別設為40、45、50、55和60 ℃,進行實驗,后續酶解操作同1.2.2.1。

1.2.2.4不同pH對ACE抑制率的影響實驗條件采用底物濃度30 g/L,加酶量7.5%(E/S),反應溫度50 ℃,酶解時間60 min,pH分別維持在7.5、8、8.5、9、9.5進行實驗。后續酶解操作同1.2.2.1。

1.2.2.5不同時間對ACE抑制率的影響實驗條件采用底物濃度30 g/L,加酶量7.5%(E/S),反應溫度50 ℃,維持 pH為8.5,酶解時間分別設為30、45、60、75和90 min進行實驗。后續酶解操作同1.2.2.1。

1.2.3超聲參數的篩選實驗使用自主研發的逆流超聲波設備在大米蛋白酶解前進行超聲預處理,設備示意圖見圖1,以傳統超聲設備(JY98-IIIDN超聲細胞粉碎機)作為對照。初步設定逆流超聲設備和傳統超聲設備超聲參數為頻率20 kHz、功率密度80 W/L、時間10 min,采用單因素逐級優化法,以ACE抑制率為主要指標,篩選最優超聲頻率、功率密度和超聲時間。

1.2.3.1對傳統超聲參數進行篩選因傳統超聲無法調整超聲頻率,故對超聲功率密度及超聲時間進行篩選。分別設定超聲功率密度為80、110、140、170、200 W/L,超聲時間10 min對大米蛋白進行超聲預處理,酶解實驗按上述最優酶解參數進行,酶解結束后操作同1.2.2.1中的后續處理。取200 W/L超聲功率密度,設定超聲時間為5、7.5、10、12.5、15 min進行超聲預處理,酶解實驗按上述最優酶解參數進行,酶解結束后操作同1.2.2.1中的后續處理。

1.2.3.2對逆流式超聲參數進行篩選設定超聲頻率為20、28、35、40、50 kHz,超聲功率密度80 W/L,超聲時間10 min,得到的酶解液后續操作同傳統超聲。采用篩選的20 kHz超聲頻率進行超聲功率密度篩選,設定為80、110、140、170、200 W/L進行超聲預處理,得到的酶解液后續操作同傳統超聲。取篩選的20kHz超聲頻率、170 W/L功率密度,對超聲時間進行篩選,設定為5、7.5、10、12.5、15 min進行超聲預處理,得到的酶解液后續操作同傳統超聲。

1.2.4大米蛋白水解度的測定方法采用pH-Stat法[15]測定蛋白水解度,計算公式如下:

式中:h-被裂解的肽鍵數;htot-為常數,即每個底物中蛋白中含有的肽鍵總數,大米蛋白為7.72 mmol/g;B-消耗的堿液的體積(mL);N-堿液的摩爾濃度(mol/L);α-大米蛋白的平均解離度,此處為0.969;m-底物中蛋白質總含量(g)。

式中,R為酶解液對ACE的抑制率(%);A為空白對照組中馬尿酸的峰面積(mAU·s);B為添加酶解液組中馬尿酸的峰面積(mAU·s)。

1.3　數據分析

2　結果與分析

2.1　蛋白的提取

原料米渣(蛋白含量56.1%)經堿溶酸沉法提取出大米蛋白,經凱氏定氮法測定得到蛋白含量為81.57%。

2.2　不同酶解參數對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響

2.2.1底物濃度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率從圖2可以看出大米蛋白的DH及酶解物ACE抑制率隨底物濃度增加均呈現先增加后下降的趨勢,當底物濃度為30 g/L時,ACE抑制率達到最高,而后酶解物ACE抑制率隨著底物濃度的增加而降低,原因可能類似于楊曉軍[17]酶解斑點叉尾鮰內臟制ACE抑制肽中所述底物濃度過高,導致酶解體系過于黏稠,減小了酶與底物結合的機率,從而導致ACE抑制率降低。結果表明,底物濃度為20 g/L和30 g/L時ACE抑制率無顯著差異(p>0.05),30 g/L的底物濃度DH更高,多肽得率高,選擇底物濃度為30 g/L進行后續實驗。

圖2　底物濃度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.2　Effect of substrate concentration on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate注:圖中條形柱上的不同大、小寫字母表示不同處理間差異顯著(p<0.05),圖3～圖11同。

2.2.2加酶量對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響從圖3可以看出酶解液的DH和ACE抑制率變化趨勢一致,在加酶量為7.5%時,其酶解液的ACE抑制活性開始趨于平緩,是因為當加酶量為7.5%時,酶相對于底物來說處于飽和狀態。加酶量為7.5%、9%、10.5%時ACE抑制率與DH的差異均不顯著(p>0.05)。為了節約成本,選擇加酶量為7.5%進行后續實驗。

圖3　加酶量對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.3　Effect of enzyme dosage on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.2.3溫度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響由圖4可以看出隨酶解溫度升高,ACE抑制率與DH均呈現先升高后趨于平穩的趨勢,這是因為堿性蛋白酶酶活隨溫度升高而變強[18],達到50 ℃后酶活保持穩定,隨后50、55、60 ℃時ACE抑制率與DH之間沒有顯著差異(p>0.05),為了減少能耗,選擇酶解溫度為50 ℃進行后續實驗。

圖4　溫度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.4　Effect of temperature on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.2.4pH對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響圖5表明,pH的變化使酶解液ACE抑制率呈現先上升后下降的趨勢,這是由于隨pH接近酶的最適pH8.5～9.0時,酶的催化效率變高,當超過最適pH時,酶的分子結構開始改變,催化活性降低,張艷萍等[19]研究的貽貝ACE抑制活性肽也表現出這種趨勢。pH為8.5與9.0時ACE抑制率無明顯差異(p>0.05),為了降低加堿量,選擇pH為8.5進行后續實驗。

圖5　pH對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.5　Effect of pH on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.2.5酶解時間對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響圖6中可以發現,大米蛋白的DH及酶解液ACE抑制率隨著酶解時間的增加先上升后趨于穩定。酶解液的ACE抑制率在60 min時達到最大值。原因可能是隨著酶解時間增加，生成新的具有降血壓活性的多肽，使ACE抑制率升高的同時，部分具有降血壓特性的肽鏈裂解，失去生物活性，使酶解產物的ACE活性降低[20]，兩種同時作用使ACE抑制率趨于平穩，與姚成虎[20]結論不同，可能是因為酶解時間不夠長，仍有底物與酶反應生成新的具有ACE抑制活性的肽鏈。酶解時間為60、75、90 min時的酶解液ACE抑制率無明顯差異(p>0.05),60 min與75 min時的DH無明顯差異(p>0.05),為提高實驗效率,選擇酶解時間為60 min,此時大米蛋白酶解液ACE抑制率為45.59%,水解度為21.49%。

圖6　酶解時間對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.6　Effect of time on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.3　超聲參數篩選

2.3.1傳統超聲功率密度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響在已優化的酶解參數基礎上對傳統聚能探頭式超聲波設備進行參數篩選,由于傳統聚能超聲探頭發生器無法調整超聲頻率,所以對功率密度與超聲時間進行篩選。超聲功率密度的篩選如圖7所示,DH與ACE抑制率隨著功率密度增加而增加,得到傳統超聲最佳參數為功率密度200 W/L。

圖7　傳統超聲功率密度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.7　Effect of traditional ultrasonic power density on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.3.2傳統超聲時間對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響傳統超聲時間的篩選如圖8,在15 min時ACE抑制率達到最大,選取最優超聲時間為15 min。在此參數下酶解液DH為20.32%,ACE抑制率為64.87%。

圖8　傳統超聲時間對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.8　Effect of traditional ultrasound time on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.3.3逆流超聲頻率對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響同樣的,在已優化的酶解參數基礎上,用不同頻率超聲預處理后大米蛋白酶解液的DH與ACE抑制率如圖9所示,在20 kHz超聲頻率下ACE抑制率最高為64.02%,與未超聲的空白組ACE抑制率相比提高了39.51%。35 kHz時水解度較大,其余超聲頻率DH差異不明顯,與其他組ACE抑制率有較大的區別,可能是因為超聲作用,使得蛋白酶優先酶解暴露蛋白表面的疏水性基團,使含有疏水氨基酸的肽增多[20],而含有疏水氨基酸的肽通常具有較高的ACE抑制率[21],在超聲頻率為20 kHz時這種現象最明顯,選取20 kHz作為最優超聲頻率。

圖9　逆流超聲頻率對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.9　Effect of countercurrent ultrasonic frequency on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.3.4逆流超聲功率密度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響如圖10所示,隨超聲功率密度升高,酶解液ACE抑制率與DH均呈先上升后下降趨勢,在170 W/L進行預處理后ACE抑制率到達70.39%,可能是因為隨超聲功率密度升高,超聲形成的空化泡破裂時釋放的能量更強,擊破蛋白顆粒,使蛋白酶切位點更多的暴露出來,DH增加,形成了更多的ACE抑制肽,ACE抑制率上升,這與金建[22]等的研究具有一致性。隨后ACE抑制率與DH下降,原因可能是過高的功率密度產生過高的能量,暴露的疏水基團相互作用,使蛋白分子重新自組裝聚集[22]。以最高ACE抑制率為指標選取最佳超聲功率密度為170 W/L。

圖10　逆流超聲功率密度對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.10　Effect of countercurrent ultrasound power density on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

2.3.5逆流超聲時間對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響從圖11中可以看出隨超聲時間的增加,ACE抑制率呈現先上升后下降狀態,DH呈現一直上升狀態,可能是因為超聲時間延長,蛋白分子更多的展開,酶切位點暴露出來,水解度也隨之增大,產生的具有ACE抑制的肽也增多,超聲時間繼續增加后ACE抑制率下降,這可能與超聲功率密度過大導致的情況類似,是因為超聲時間過長,已展開的蛋白分子發生折疊聚集[23],這與耿靜靜[24]所得結果相似。根據ACE抑制率的大小選取12.5 min為最優超聲時間。

圖11　逆流超聲時間對大米蛋白水解度及酶解液ACE抑制率的影響Fig.11　Effect of countercurrent ultrasound time on the DH and the ACE inhibitory rate of rice protein hydrolysate

使用自主研發的逆流式超聲波儀器篩選出的超聲最優參數為:超聲頻率為20 kHz,功率密度為170 W/L,處理時間為12.5 min,在此參數下大米蛋白酶解液ACE抑制率為72.24%,相較于未超聲提高了57.42%。相較于傳統超聲設備固定的超聲頻率,本實驗所用逆流超聲設備擁有20、28、35、40、50 kHz可供篩選,需要超聲功率密為170 W/L低于傳統超聲設備所需的200 W/L,超聲時間為12.5 min低于傳統超聲所需的15 min,設備效率高,能耗低,產物ACE抑制率相較于傳統超聲設備提高了11.36%?？赡苁且驗槟媪餮h系統,使整體待處理液充分受到超聲波作用,能夠克服超聲不均勻的問題,為其工業化生產打下基礎。

3　結論

通過單因素逐級優化法確定了大米蛋白的最佳酶解參數為底物濃度30 g/L、加酶量7.5%(E/S)、溫度50 ℃、pH8.5、酶解時間60 min。在此條件下,大米蛋白酶解液ACE抑制率為45.59%，DH為21.49%。

在最優酶解參數的基礎上,篩選出傳統超聲設備最佳參數為:功率密度200 W/L,超聲時間15 min,在此參數下超聲波預處理酶解液的ACE抑制率為64.87%。篩選出自主研發逆流式超聲設備參數為:超聲頻率20 kHz,功率密度170 W/L,處理時間12.5 min。在此參數下超聲預處理得到大米蛋白酶解液ACE抑制率為72.24%,DH為21.64%相較于未超聲時提高了57.42%,相較于傳統超聲設備ACE抑制率提高了11.36%。

本研究所用逆流超聲波設備預處理與傳統超聲設備相比需要的超聲功率密更小,時間更短,酶解液ACE抑制率更高,說明逆流超聲設備在輔助酶解制備大米ACE抑制肽的研究中能有效提高酶解效率,減少能耗,提高酶解制備的ACE抑制肽的活性。

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