DEAE-52纖維素靜態法分離純化樺褐孔菌多糖的工藝優化

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(1.曲阜師范大學生命科學學院,山東濟寧 273100; 2.中國農業大學食品與營養工程學院,北京 100083)

樺褐孔菌(Inonotusobliquus),又稱白樺茸(Chaga),是一種大型藥用真菌,主要寄生在樺樹上。樺褐孔菌中含有多糖、三萜類化合物、木質素、黑色素、葉酸衍生物等多種生物活性成分[1]。從16世紀開始,俄羅斯、波蘭、芬蘭和其他東歐國家的居民就開始食用樺褐孔菌,用于防治多種疑難雜癥,如肝癌、胃癌、各類消化器官的癌癥、糖尿病、心臟病[2]。目前國內外研究表明樺褐孔菌多糖具有抗腫瘤[3-4]、抗氧化[5-6]、抗血脂[7-8]、調節免疫力[9-10]、降血糖[11]等廣泛的藥理作用。但多糖不是一種純粹的化學物質,而是聚合程度不同的物質混合物。多糖在單糖組成、相對分子質量分布、結構等方面具有不均一性,因此對多糖的分級純化是探討其化學結構和生物活性的基礎[12]。

目前常用超濾膜分離法[13]、凝膠色譜法[14]、分布沉淀分離法[15]、陰離子交換色譜法[16]和大孔樹脂柱色譜法[17]等方法分離純化多糖。其中,超濾膜分離法具有能耗低、分離效率高、不損害活性等優點,但膜在分離過程中易被污染,造成膜滲透通量下降,從而給多糖的分離增加難度[18]。凝膠色譜法是利用凝膠的分子篩作用,根據不同分子大小和形狀的多糖在層析柱中移動速度不同而達到分離純化的目的,凝膠色譜分離純化效果好,但上樣量小,不適合作為分離純化的第一步驟進行大量分離,主要用來進行少量樣品的純化。分步沉淀法是利用“相似相溶 ”原理,用不同濃度的低級醇或酮將不同相對分子質量的多糖沉淀出來,適用于溶解度相差較大的多糖的分離,有一定的局限性[19]。陰離子交換色譜以離子交換樹脂作為固定相,通過其表面帶電荷的基團與樣品離子和流動相離子的可逆交換、離子-偶極作用或吸附來實現色譜分離,可用來分離各種酸性、中性多糖和黏多糖,應用廣泛。其中最常用的陰離子交換柱層析填料是DEAE-52纖維素,它既可純化多糖,還可分離各種多糖,已被廣泛應用于食品、醫藥、環保等領域有效成分的分離與純化[20-21]。且本實驗室前期用DEAE-52纖維素柱層析和Sephadex G-100柱層析分離純化樺褐孔菌子實體常溫水提粗多糖(Normal temperature water-extracted polysaccharides,NIOP),通過去離子水、0.2 mol/L NaCl和0.5 mol/L NaCl洗脫,獲得了NIOP1(去離子水洗脫多糖)和NIOP2(0.2 mol/L NaCl洗脫多糖)兩種生物活性較好的分子量分布均一的多糖組分,但是DEAE-52纖維素柱層析分離純化多糖步驟繁瑣,工作量大,不易于短時間內獲得大量單一多糖組分[22]。因此本實驗通過研究DEAE-52纖維素對NIOP靜態吸附和解吸的影響,進而實現DEAE-52纖維素對NIOP靜態分離純化的目的。此方法操作方便,耗時少,為后期研究多糖的結構及其活性研究提供了一定的基礎。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

樺褐孔菌子實體大興安嶺品味食品有限公司;DEAE-52纖維素Pharmacia公司;Sephadex G-100Waters公司;苯酚、硫酸等其余試劑均為國產分析純。

TGL-16C型離心機上海安亭科學儀器廠;TU-1810型紫外分光光度計上海棱光科技有限公司;RE52CS型旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠;TF-FD型冷凍干燥機北京博醫康實驗儀器有限公司;BT-200B型數顯恒流泵、BS-100A型自動部分收集器中國上海滬西分析儀器廠;HCY-DA型全溫度搖床太倉市豪誠實驗儀器制造有限公司;1260 Infinity凝膠滲透色譜儀(Waters 2410示差折光檢測器)美國Agilent公司。

1.2　實驗方法

1.2.1樺褐孔菌子實體多糖的制備準確稱取一定量的樺褐孔菌子實體粉末,放入圓底燒瓶中,按照料液比為1∶30 g/mL加入蒸餾水,混合均勻,在室溫下浸提48 h,4000 r/min離心10 min,收集上清液。向上清液中加入4倍體積無水乙醇,在4 ℃下醇沉過夜。醇沉后,8000 r/min離心10 min,收集沉淀,50 ℃干燥后得NIOP。

1.2.2多糖含量測定以葡萄糖為標準,通過苯酚-硫酸法測定多糖含量[23]。將葡萄糖標準液(2.0 mL,100 μg/mL)與1.0 mL苯酚溶液(6%)和5 mL硫酸混合。冷卻至室溫后,用紫外分光光度計在490 nm下測定吸光度(Abs)。以葡萄糖濃度為橫坐標,吸光度Abs為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程為y=10.56x+0.01,R2=0.9992,式中y為吸光值,x為葡萄糖濃度(mg/mL)。準確吸取2.0 mL樣品溶液,按上述步驟在490 nm波長處測定吸光度,從標準曲線上查得,并計算相應含量。

1.2.3DEAE-52的預處理將DEAE-52離子交換劑干粉浸泡于蒸餾水中約5 h,抽濾,在0.5 mol/L的HCl溶液中浸泡2 h后用去離子水洗至pH中性,抽干,加0.5 mol/L的NaOH溶液浸泡2 h,用去離子水將其洗至中性,并將其在抽濾漏斗中抽干。即得到了處理好的DEAE-52[24]。

1.2.4DEAE-52靜態吸附準確稱取15 g處理后的DEAE-52纖維素,放入錐形瓶中,向其中加入20 mL的NIOP溶液。固定反應條件為吸附轉速120 r/min、樣品濃度為40 mg/mL、吸附時間為90 min,研究不同吸附溫度(20、30、40、50 ℃)處理后的DEAE-52纖維素對多糖的吸附量影響;固定反應條件為吸附溫度30 ℃、樣品濃度為40 mg/mL、吸附時間為90 min,考察不同吸附轉速(50、100、120、150、200、250 r/min)處理后的DEAE-52纖維素對多糖的吸附量影響;固定反應條件為吸附轉速120 r/min、吸附溫度30 ℃、吸附時間為90 min,考察不同NIOP溶液濃度(20、30、35、40、50、60、70 mg/mL)處理后的DEAE-52纖維素對多糖的吸附量影響;固定反應條件為吸附轉速120 r/min、樣品濃度為40 mg/mL、吸附溫度30 ℃,考察不同吸附時間(15、30、45、60、75、90、120、150 min)處理后的DEAE-52纖維素對多糖的吸附量影響。吸附量按下式公式計算。

式中,Q-為吸附量(mg/g);C1-初始濃度(mg/mL);C2-吸附后濃度(mg/mL);V-溶液體積(mL);W-DEAE-52纖維素質量(g)。

1.2.5DEAE-52靜態解吸準確稱取預處理好的DEAE-52纖維素加入錐形瓶內,向其中加入濃度為40 mg/mL NIOP溶液(比例為:15 g纖維素加入20 mL NIOP粗多糖液),在30 ℃和120 r/min的轉速下振蕩90 min。即得飽和吸附纖維,測定多糖吸附量,濾干備用。將吸附多糖后的飽和吸附纖維加入去離子水在30 ℃和120 r/min的轉速下振蕩90 min,研究不同體積倍數(8、9、10、11、12、13、14、15、16)的去離子水對洗脫多糖濃度的影響。向經去離子水處理后的飽和吸附纖維加入的0.2 mol/L NaCl溶液,在上述溫度和轉速下振蕩60 min,研究不同體積倍數(8、9、10、11、12、13、14、15、16)的0.2 mol/L NaCl溶液對洗脫多糖濃度的影響。向吸附多糖后的飽和吸附纖維加入12倍體積的去離子水后,將三角瓶放在在30 ℃和120 r/min后,研究不同洗脫時間(10、20、30、40、50、60、70、80、90、120 min)對洗脫多糖濃度的影響。向經去離子水處理后的飽和吸附纖維,加入11倍體積的0.2 mol/L的NaCl,按上述處理方法,研究不同洗脫時間對洗脫多糖濃度的影響。洗脫率按下式公式計算。

式中,R-為洗脫率(%);P0-為上樣液起始濃度(mg/mL);P1-為吸附后上樣液濃度(mg/mL);P2-為洗脫后濃度(mg/mL);V1-為吸附液體積(mL);V2-為洗脫液用量。

1.2.6Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析分離純化多糖將經預處理后的Sephadex G-100葡聚糖凝膠采用濕法裝柱,分別取NIOP1、NIOP2溶液上Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱(2.6 cm×70 cm),以蒸餾水洗脫,流速20 mL/h,每6 min收集一管,每管約2 mL。使用苯酚硫酸法測定每管多糖濃度。以管數為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線。

1.2.7凝膠滲透色譜測定多糖純度[25]色譜條件:色譜柱,Waters UllrallydrogelTM Linear(規格為7.8 mm×300 mm);流動相,0.1 mol/L NaNO3溶液;流速,0.9 mL/min;柱溫,45 ℃。

1.2.8數據處理實驗中每個處理重復三次,采用Student’s test進行數據分析,采用origin 8.0軟件作圖。

2　結果與分析

2.1　DEAE-52靜態吸附實驗

2.1.1吸附溫度對DEAE-52纖維素靜態多糖吸附量的影響由圖1可知,溫度影響DEAE-52纖維素對吸附NIOP量隨溫度的升高呈現增大后減小的趨勢,在20～30 ℃時,DEAE-52纖維素對NIOP的吸附量隨著吸附溫度的升高而增大,但30 ℃之后,隨著溫度的升高,DEAE-52纖維素對NIOP的吸附量變小。這是由于吸附和解析均需活化能,且吸附的活化能小于解析的活化能,因此在低溫范圍內,吸附量隨溫度的升高而增大,高溫范圍內,吸附量隨溫度升高卻減小,這與文獻報道一致[26]。因此選擇在30 ℃下吸附。

圖1　吸附溫度對DEAE多糖吸附量的影響Fig.1　Effect of adsorption temperature on the adsorbance of DEAE-52

2.1.2吸附轉速對DEAE-52纖維素靜態多糖吸附量的影響DEAE-52纖維素對NIOP的吸附量隨著吸附轉速的增大呈現先增大后減小趨勢。從圖2可知,DEAE-52在120 r/min時吸附量最大。當轉速高于120 r/min時,多糖的吸附量逐漸減小。這可能是因為轉速增加了多糖液與DEAE-52纖維素接觸面積,吸附量增多,但是當轉速過高時吸附的多糖可能被解吸到溶液中,導致吸附量減小[27]。因此選擇的吸附轉速為120 r/min時,此時吸附效果最好。

圖2　旋轉轉速對DEAE-52多糖吸附量的影響Fig.2　Effect of rotate speed on the adsorbance of DEAE-52

2.1.3NIOP溶液濃度對DEAE-52纖維素靜態多糖吸附量的影響由圖3可知,DEAE-52纖維素對多糖的吸附量隨著樣品濃度的增大而提高。其中,當NIOP溶液濃度達到40 mg/mL(多糖含量為6.3 mg/mL)時,DEAE-52纖維素對多糖的吸附量為2.87 mg/g,但當樣品濃度再增大時,多糖的吸附量增加不明顯。這可能因為DEAE-52纖維素對多糖的吸附逐漸達到了飽和狀態,對多糖的吸附量隨著NIOP溶液濃度的增大而增加不明顯,因此選擇40 mg/mL為NIOP溶液最適濃度。

圖3　樣品液多糖濃度對DEAE-52多糖吸附量的影響Fig.3　Effect of sample concentration of polysaccharides on the adsorbance of DEAE-52

2.1.4吸附時間對DEAE-52靜態多糖吸附量的影響由圖4可知,DEAE-52纖維素對多糖的吸附量隨著吸附時間的增長而提高。當吸附時間為90 min時,DEAE-52纖維素對多糖的吸收量為2.51 mg/g,但當吸附時間再增長時,多糖的吸附量增加不明顯。為了能高效的分離多糖,選擇吸附時間為90 min最為合適。

圖4　吸附時間對DEAE-52多糖吸附量的影響Fig.4　Effect of adsorption time on the adsorbance of DEAE-52

2.2　DEAE靜態解吸實驗

2.2.1洗脫體積倍數對飽和吸附纖維NIOP洗脫多糖濃度的影響不同溶液洗脫體積倍數對飽和吸附纖維NIOP洗脫多糖濃度的影響結果見圖5和圖6。如圖所示,隨著洗脫體積倍數的增加,洗出的多糖的濃度呈現先增加后減少的趨勢。其中NIOP1的最適洗脫體積為12倍體積,此時洗脫的多糖濃度為0.56 mg/mL(多糖質量為11.17 mg),洗脫率為28.20%。而NIOP2的最適洗脫體積為11倍體積,此時洗脫的多糖的濃度為0.38 mg/mL(多糖質量為7.55 mg),洗脫率為19.06%。在采用DEAE-52纖維素柱層析分離純化多糖時,NIOP1的洗脫率約為28%,NIOP2的洗脫率約為20%,洗脫率相差不大[22]。

圖5　去離子水洗脫體積對DEAE-52解吸附多糖濃度的影響Fig.5　Effect of elution volume of deionized water on the release quantity of polysaccharide concentration of DEAE-52

圖6　0.2 mol/L NaCl 溶液洗脫體積對DEAE-52解吸附多糖濃度的影響Fig.6　Effect of elution volume of 0.2 mol/L NaCl solution on the release quantity of polysaccharide concentration of DEAE-52

2.2.2洗脫時間對飽和吸附纖維NIOP洗脫多糖濃度的影響洗脫時間對DEAE-52纖維素樹脂洗脫多糖濃度的影響結果見圖7和圖8。如圖所示,隨著洗脫時間的不斷增加,洗出的多糖濃度不斷增加,但洗脫時間達到一定數值后,隨時間的增加,洗脫的多糖濃度增加不明顯。為節約成本和時間,選擇的NIOP1和NIOP2的最適洗脫時間分別為90 min和60 min,此時洗脫的多糖濃度分別為0.55 mg/mL(多糖質量為11.07 mg)、0.36 mg/mL(多糖質量為7.18 mg),洗脫率分別為24.6%、15.6%。與之前DEAE-52纖維素柱層析分離多糖相比[22],洗脫率稍微有所下降,這是因為隨著時間的不斷增加,仍能有少量多糖被洗出。

圖7　去離子水的洗脫時間對DEAE-52解吸附多糖濃度的影響Fig.7　Effect of elution time of deionized water on the release quantity of polysaccharide concentration of DEAE-52

圖8　0.2 mol/L NaCl 溶液洗脫時間對DEAE-52解吸附多糖濃度的影響Fig.8　Effect of elution time of 0.2 mol/L NaCl solutionon the release quantity of polysaccharide concentration of DEAE-52

2.3　Sephadex G-100 葡聚糖凝膠柱層析

如圖9和圖10中所示,NIOP1和NIOP2經Sephadex G-100 葡聚糖凝膠柱層析均為單一洗脫峰,且各峰面積所示多糖分別占總多糖的63.65%、71.24%,其中多糖的回收率分別為:79.98%、81.45%,可以初步判斷洗脫所得多糖NIOP1和NIOP2均為分子量分布均一的多糖組分,但為進一步檢驗NIOP1和NIOP2的均一性,采用GPC對其均一性進行進一步鑒定。

圖9　NIOP1的Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析峰圖Fig.9　Sephadex G-100 column chromatography for NIOP1

圖10　NIOP2的Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析峰圖Fig.10　Sephadex G-100 column chromatography for NIOP2

圖11　葡聚糖凝膠色譜圖Fig.11　The GPC gel chromatography spectrum注:A:NIOP1;B:NIOP2。

2.4　NIOP1和NIOP2純度鑒定

由圖11可以看出NIOP1、NIOP2組分在GPC上呈現一單峰,保留時間分別為8.47 min和8.41 min平均相對分子量分別是24574、27901 Da。凝膠柱色譜圖與其相應的SephadexG-100凝膠柱層析洗脫結果相一致,進一步說明NIOP1和NIOP2具有較強的均一性分布。

3　結論

本實驗的靜態研究得出了最佳靜態吸附和解吸條件,實驗表明,DEAE-52纖維素在NIOP濃度為40 mg/mL,溫度30 ℃,120 r/min轉速下處理90 min時對NIOP的吸附效果最佳。而飽和吸附纖維最佳解吸條件是:NIOP1洗脫劑用量為12倍體積,洗脫時間為90 min;NIOP2洗脫劑用量為11倍體積,洗脫時間為60 min。且DEAE-52纖維素靜態洗脫出的多糖NIOP1和NIOP2均為分子量均一分布的多糖,與前期動態洗脫多糖結果一致。與動態洗脫相比,DEAE-52纖維素靜態吸附耗時少,操作簡單,而且對NIOP具有良好的分離純化效果,為后期大量制備多糖提供了一定的理論基礎。

[1]Shin YS,Tamai Y,Terazawa M. Chemical constituents ofInonotusobliquusI,A triterpene,3β-hydroxy-8,24-dime lanosta 21,23 lacton of romscretium[J].Eurasian Journal of Forest Research,2000(1):43-50.

[2]劉迎秋,包海鷹. 樺褐孔菌Inonotusnobliquus化學成分及藥理作用[J]. 中國食用菌,2008,27(4):34-39.

[3]陳義勇,黃友如,劉晶晶,等. 樺褐孔菌多糖IOP3a體內抗腫瘤活性及其機制[J]. 食品與生物技術學報,2013,32(9):983-988.

[4]Zhao F,Mai Q,Ma J,et al. Triterpenoids fromInonotusobliquusand their antitumor activities[J]. Fitoterapia,2015,101:34-40.

[5]張麗霞,張偉娜,李凌智,等. 不同提取方法對樺褐孔菌多糖抗氧化活性的影響[J]. 安徽農業科學,2012,40(10):5870-5872.

[6]Hu Y,Sheng Y,Yu M,et al. Antioxidant activity ofInonotusobliquuspolysaccharide and its amelioration for chronic pancreatitis in mice.[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2016,87:348.

[7]崔鶴松,金光. 樺褐孔菌多糖對實驗性高脂血癥模型大鼠血脂的影響[J]. 延邊大學醫學學報,2007,30(3):173-174.

[8]Chen G,Luo Y C,Li B P,et al. Effect of polysaccharide from Auricularia auricula on blood lipid metabolism and lipoprotein lipase activity of ICR mice fed a cholesterol-enriched diet[J]. Journal of Food Science,2010,73(6):H103-H108.

[9]張澤生,楊超慧,史砷,等. 樺褐孔菌多糖對小鼠免疫調節作用的影響[J]. 食品研究與開發,2008,29(7):35-37.

[10]Fan L,Ding S,Ai L,et al. Antitumor and immunomodulatory activity of water-soluble polysaccharide fromInonotusobliquus[J]. Carbohydrate Polymers,2012,90(2):870-4.

[11]Hu T. Isolation,purification and effects of hypoglycemic functional polysaccharides fromInonotusobliquus[J]. African Journal of Biotechnology,2012,11(30):7738-7743.

[12]李翠麗,王煒,張英,等. 中藥多糖提取、分離純化方法的研究進展[J]. 中國藥房,2016,27(19):2700-2703.

[13]王博,斯聰聰,程國才. 響應面優化超濾膜分離靈芝多糖工藝[J]. 食品工業,2015(12):1-4.

[14]江新鳳,高其璋,楊普香,等. 乙醇沉淀法提取茶花多糖

的研究[J]. 蠶桑茶葉通訊,2013(5):31-33.

[15]戚躍明,陳濤. 紫芝胞外多糖分離純化及抗氧化性的研究[J]. 食品工業科技,2013,34(4):105-108.

[16]任海偉,陳海秀,唐學慧,等. 大孔樹脂純化薏苡多糖的研究[J]. 食品工業科技,2012,33(3):249-251.

[17]景永帥,張丹參,吳蘭芳,等. 荔枝低分子量多糖的分離純化及抗氧化吸濕保濕性能分析[J]. 農業工程學報,2016,32(9):277-283.

[18]張巖,馬麗娜,陶遵威. 中藥多糖的分離純化方法研究進展[J]. 天津藥學,2011,23(3):72-74.

[19]李翠麗,王煒,張英,等. 中藥多糖提取、分離純化方法的研究進展[J]. 中國藥房,2016,27(19):2700-2703.

[20]姜紹通,汪洪普,潘麗軍. 芋頭多糖的分離純化及對細胞免疫的調節作用[J]. 食品科學,2013,34(19):287-292.

[21]Meng M,Cheng D,Han L,et al. Isolation,purification,structural analysis and immunostimulatory activity of water-soluble polysaccharides fromGrifolaFrondosafruiting body[J]. Carbohydrate Polymers,2016,157:1134.

[22]王麗.樺褐孔菌降血糖多糖的分離純化與α-葡萄糖苷酶抑制活性研究[D].北京：中國農業大學,2016.

[23]劉璐,喬宇,汪蘭,等. 山藥多糖的抗氧化作用研究[J]. 食品科技,2014(12):212-216.

[24]李敏晶,毛婕昕,付榮香. DEAE-纖維素分離提純海帶硫酸多糖的研究[J]. 廣東化工,2010,37(9):30-31.

[25]金鑫,賴鳳英. 仙人掌多糖的提取、分離純化及GPC法測定其分子量[J]. 現代食品科技,2006,22(2):138-140.

[26]許素新,劉廷岳. 離子交換纖維對桑葉多糖靜態吸附和解吸的研究[J]. 時珍國醫國藥,2011,22(8):1943-1945.

[27]任愛農. 野菊花多糖的提取分離、免疫活性研究及分子量測定[D]. 鎮江：江蘇大學,2012.