高通量質譜法用于小鼠腦部神經肽的鑒定

邵先鋒，馬敏，陳瑞冰，賈辰熙

1天津醫科大學 基礎醫學院，天津 300070

2國家蛋白質科學中心 北京蛋白質組研究中心 蛋白質組學國家重點實驗室 放射與輻射醫學研究所，北京 102206

3天津大學 生命科學學院，天津 300072

神經肽是來源于大腦中的多肽荷爾蒙，長度多為10?30個氨基酸，廣泛存在于腦組織、體液以及多個內臟器官中。在體內經過前體的多步酶切和翻譯后修飾后獲得生物活性。神經肽能調節體內多種信號通路，這些通路影響著不同的生理、行為和內分泌功能，如能量代謝的穩定、疼痛以及精神紊亂等。在血液、腦脊液、尿液等人體體液中，由于各種體液成分較復雜，尤其血液中血漿蛋白的存在導致針對體液的神經肽測定較為困難，內臟器官的神經肽含量又較低，因此針對全腦神經肽的提取和鑒定更具有意義。

近年來高靈敏度和高分辨率的液相串聯質譜技術發展較為迅速，以Orbitrap Fusion為代表的質譜儀器，實現了將三重四極桿、靜電場軌道阱、線性離子阱3種質量分析器融為一體。與免疫共沉淀、Western blotting等傳統方法相比，液相串聯質譜技術在神經肽的深入研究上更為便利和高效[1-3]。目前對神經肽的研究多集中在疾病相關神經肽的定量上[4-6]，但這些研究多局限在單個或者少數神經肽[7-9]。而針對全腦神經肽的非限定性研究，能為相關研究提供對照，更能獲取神經系統相關疾病的信息，如藥物靶點[10]、神經肽間相互作用等。

由于對全腦神經肽的大規模鑒定的報道較少，阻礙了對神經肽及其受體和下游傳導通路的研究。本研究利用酸化甲醇，沉淀和去除樣品中的大分子量蛋白。通過研磨破碎的方式萃取小鼠全腦組織神經肽，利用液相串聯質譜技術對全腦組織的神經肽進行大規模檢測。比較內源性肽段的鑒定數與最大分子量，評估分子超濾管對樣品制備的影響。對不同神經肽數據庫進行優化，并對新神經肽進行預測，從而為神經肽的下游研究提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 小鼠全腦組織標本的采集

8周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠 (30–40 g)，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。所有小鼠均飼養在室溫為 (22±1)℃、濕度為65%?70%的條件下，并使用標準實驗動物飲食進行飼養。為了減少各種操作和生物節律引起的神經肽的變化，所有小鼠穩定飼養1周后，于上午9點使用CO2處死，并在5 min內取出全部腦組織。用冰的PBS沖洗3次后，立即微波加熱使蛋白酶變性失活，微波功率750 W，加熱30 s，加熱后放入液氮中用于臨時保存。全部腦組織取出后放入–80℃保存或者用于樣品的直接制備。

1.2 神經肽的提取

分2組實驗進行神經肽的萃取，每組3個生物學重復 (圖1)。①M(Methanol)組：單個腦組織加入l mL酸化甲醇 (90%甲醇，1%乙酸，體積比)，冰上進行組織研磨破碎，萃取液超聲振蕩2 min后，4℃、20000×g離心10 min，取上清液，室溫蒸干，0.1%體積甲酸水重懸樣品后，4℃、20000×g離心10 min，取1/2體積上清液，經過C18除鹽柱 (Agilent，USA)除鹽，45%乙腈 (45%乙腈，0.1%甲酸，體積比)洗脫，洗脫液蒸干上質譜或者–80℃保存備用；②MF(Methanol&Filter)組：單個腦組織加入l mL酸化甲醇研磨，超聲振蕩，離心取上清液，蒸干。超純水平衡30 kDa超濾離心管 (Millipore，UFC5030BK，USA)，室溫14000×g離心8 min，重復3次。0.1%體積甲酸水重懸樣品后，離心、取上清液，加入平衡好的超濾離心管中，4℃、14000×g離心40 min，樣品全部過濾后，加入200 μL 0.1%甲酸水再次離心30 min，取1/2體積收集液除鹽、洗脫、蒸干后用質譜檢測或者備用。

圖1 小鼠全腦神經肽的提取流程Fig.1 The extraction process of mouse total cerebral neuropeptides.

1.3 LC-MS/MS的設定

液相Thermo EASY-nLC1200(Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)的參數：將萃取的神經肽用20 μL 0.1%體積甲酸水重懸，并測濃度。將700 ng樣品載入到自制C18填料 (直徑3 μm，孔徑120 ?)(SunChrom,USA)填充的反向樹脂捕集柱上。用不同梯度B相 (0.1%甲酸溶于80%乙腈，體積比)洗脫捕集柱，洗脫的肽段經過自制C18填料填充的分析柱后 (內徑75 mm，長度15 cm)，進入質譜檢測。液相梯度：0 min-7%B相，14 min-13%B相，51 min-23%B相，68 min-36%B相，69 min-100%B相，75 min-100%B相，流速均為600 nL/min。

質譜Thermo orbitrapfusion(Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)的參數：一級檢測器類型為軌道阱，分辨率120000，自動增益控制目標5.0 e5，最大注入時間50 ms，掃描范圍300?1400m/z。二級檢測器類型為離子阱，采用三重四級桿的分離模式，碎裂模式為高能碰撞解離，自動增益控制目標2.0 e5，最大注入時間35 ms，分離窗1.6m/z，初始質量120m/z，碎裂能量30%，動態排除時間18 s，電荷排除+1，>+6價。

2 數據的處理

所有質譜原始數據均使用PEAKS Studio軟件 (Version8.5)先進行肽段的從頭測序[11]，再進行依賴數據庫的搜庫。搜庫設置：前體質量最大偏差10 Da，碎片離子偏差在0.2 Da以內，肽段FDR≤1%且–10 logP≥20，無酶切，動態修飾包括：Amidation；Oxidation(M)；Phosphorylation(STY)；Acetylation(K)，每條肽段最多允許存在2個動態修飾。數據庫來源：(1)神經肽鑒定的數據庫 swepep peptides[12](http://www.swepep.org/)；neuropedia[13](http://proteomics.ucsd.edu/Software/NeuroPedia/)；neuropep[14](http://isyslab.info/Neuro Pep/)。(2)神經肽預測的數據庫neuropred[15](http://stagbeetle.animal.uiuc.edu/cgi-bin/neuropred.py)；swepep predicted(http://www.swepep.org/)。(3)前體荷爾蒙數據庫swepep precursors(http://www.swepep.org/)。

3 結果與分析

3.1 數據庫的優化

為了建立更全面的神經肽鑒定數據庫，針對MF的方法，對數據庫 (1)中3個數據庫搜庫的結果進行比較。swepep、neuropedia、neuropep分別鑒定到1392、976、1167條內源性肽段，相同氨基酸序列的肽段可能存在不同修飾和不同電荷情況，當去除不同修飾與電荷影響后，swepep庫鑒定到的內源性肽段序列剩余1269條 (圖2)，在3個神經肽鑒定數據庫中最多，neuropedia庫最少，剩余894條，neuropep庫的鑒定數剩余1070條。對不同數據庫鑒定到的肽段重復率進行統計，swepep庫與neuropedia庫的重復率為67.5%，與neuropep庫的重復率為71.2%，neuropedia庫與swepep庫的重復率為78.7%。每個數據庫都含有其他數據庫所鑒定不到的特異性肽段，這些特異性肽段以swepep庫最多為279條，neuropep庫最少，其12條特異性肽段來源于9個神經肽荷爾蒙前體：生長激素抑制素 (Somatostatin)、腦啡肽B(Proenkephalin-B)、阿黑皮素 (POMC)、速激肽1(PPT)、縮膽囊素 (CCK)、促甲狀腺激素(Pro-TRH)、分泌粒蛋白2(SCG2)、可卡因-苯丙胺調節轉錄蛋白 (Cocaine-and amphetamine-regulated transcript protein)、胃泌素釋放肽 (GRP)。為了鑒定到更多的神經肽，包括每個數據庫所特有的肽段，需要對3個數據庫進行合并，使鑒定結果更為全面。

圖2 不同數據庫鑒定到的內源性肽段數Fig.2 The identification number of endogenous peptides by using different databases.

3.2 不同制樣方法的鑒定結果

用合并的數據庫對M、MF組數據進行搜庫，并對搜庫結果進行比較。2組樣本分別鑒定到1486、1453條內源性肽段，去除同一肽段不同修飾和電荷影響后，2組各剩余1361、1326條內源性肽段序列 (表1)。肽段數量是以往報道的2–3倍，包括常見的速激肽：P物質 (SP)、神經激肽B、神經肽K、神經肽Y(NPY)；阿片肽：內啡肽、腦啡肽、強啡肽；血管活性腸肽 (VIP)等神經肽。SP具有擴張血管并參與痛覺信息的傳遞的功能[16-17]。NPY能影響攝食行為，具有促進食欲、增加體重[18]、調節其他神經肽分泌的功能[19-20]。阿片肽具有較強的鎮痛作用。VIP可以使血管舒張，降低血壓。不同組內3個生物重復的皮爾森相關系數均大于0.76(圖3A)，單個樣品的內源性肽段的平均鑒定數M組和MF組分別為993、895條 (圖3B)。2種制樣方法鑒定到的肽段的最大分子量均小于7 kDa，因此超濾管并不能顯著降低鑒定到的內源性肽段的分子量。使用超濾管超濾樣品時，部分樣品會殘留在濾膜上，同時在離心過程中，肽段聚積會出現阻塞濾膜孔現象，導致部分低于30 kDa的肽段也不能超濾下來。對于低豐度肽段的超濾，可能會造成難以避免的樣品損失，因此在制備樣品時不使用分子超濾管能顯著提高單個樣品的鑒定數。

對2組樣品的肽段重復率進行比較，結果顯示M組與MF組重復率為64.1%(圖4A)，每組特異性鑒定到的肽段M組較多有311條，包括血纖維蛋白肽B、生長抑素-14等神經肽，血纖維蛋白肽B能促進中性粒細胞和成纖維細胞的遷移[21]，生長抑素-14具有抑制胰高血糖素分泌的功能[22]。MF組特異性肽段有276條，包括神經肽K(能抑制黃體生成素的釋放[23])和強啡肽A(1-8)(具有鎮痛的作用)。為了增加內源性肽段的鑒定數，將2組數據進行合并搜庫，共得到1830條內源性肽段序列，去除不同修飾和電荷影響后剩余1653條。對1653條肽段進行氨基酸長度的統計，長度在6–30個氨基酸的肽段占總肽段的95.6%(圖4B)，其中11–15個氨基酸的肽段最多，有640條，占總鑒定數的38.7%。鑒定到的最短肽段含有5個氨基酸，最長肽段含有60個氨基酸，兩者來源于相同的荷爾蒙前體SCG1。

表1 兩種樣品制備方法的內源性肽段的鑒定Table 1 The identified endogenous peptides from two different sample preparation methods

圖3 皮爾森系數和內源性肽段的鑒定數Fig.3 The Pearson coefficient and the number of identified endogenous peptides.M1–3:samples from the methanol group;MF1–3:samples from the methanol&filter group.(A)The Pearson coefficient among 6 samples.(B)The number of identified endogenous peptides of different samples.

圖4 內源性肽段的鑒定數及氨基酸的長度Fig.4 The number of identified endogenous peptides and their amino acid length.(A)Recurrence rate of endogenous peptides between the M group and the MF group.(B)The amino acid lengths of peptides identified in 6 samples.

3.3 前體荷爾蒙的鑒定

不同的神經肽可能來源于不同的前體荷爾蒙，根據神經肽不同的斷裂方式，前體可以作為預測新的神經肽的來源，如neuropred數據庫[15]。用建立的荷爾蒙前體數據庫 (3)進行搜庫，得到2176條內源性肽段，去除修飾、電荷、同源序列影響后剩余1941條。對不同荷爾蒙前體鑒定到的內源性肽段數進行統計，其中產生大于100個肽段的前體包括：SCG2、磷脂酰乙醇胺結合蛋白1(PEBP-1)、SCG1、前體蛋白轉化酶Ⅰ型抑制因子(ProSAAS)(圖5)，4個前體的內源性肽段鑒定數占總鑒定數的49.5%，它們在信號傳導、胰島素的分泌、軸突生成、飲食行為、行為恐懼反應、抑制內皮細胞凋亡等方面發揮著重要的生理功能。

3.4 對新神經肽的探索

利用數據庫 (2)對2組數據進行搜庫，為了減少假陽性，只保留與數據庫 (2)中氨基酸序列全部匹配的肽段，共鑒定到99條預測神經肽。最長預測神經肽含有42個氨基酸，來源于前體荷爾蒙SCG2；最短預測肽段含有6個氨基酸，來源于前體腦啡肽A。來源于荷爾蒙前體的預測神經肽 (表2)，可能在功能上與前體蛋白較相似，如來源于VIP peptides的ISSSISEDPVPI序列，可能在mRNA的穩定、蛋白質分解、催乳素分泌與信號轉導的調節等方面發揮著生理功能。但來源于同一前體的預測神經肽，如來源于腦啡肽A的YGGFMR序列和YGGFMRSL序列，也可能具有不同的生物功能。對于預測神經肽可以通過人工合成后的體內和體外實驗驗證其真實性。

圖5 前體荷爾蒙的分布Fig.5 The distribution of precursor hormones.SCG2:Secretogranin-2;PEBP1:phosphatidylethanolaminebinding protein 1;PCSK1:prohormone convertase 1;PENK:proenkephalin-A;TYB4:thymosin beta-4;POMC:Pro-opiomelanocortin;7B2:neuroendocrine protein 7B2;CCKN:cholecystokinin.

表2 部分預測肽段的信息Table 2 The information of several predictive peptides

4 討論

本研究通過利用高靈敏度、高分辨率的液相串聯質譜技術，對全腦神經肽進行了大規模的定性報道。采用差別制樣的方法，比較分子濾過膜在樣品鑒定數、常見的翻譯后修飾、肽段最大分子量上的差異，并對神經肽數據庫進行了優化，主要目的是為了鑒定到更多的全腦神經肽，并對新的神經肽候選物進行了預測，為后續神經肽相關的功能性研究提供參考，例如與焦慮抑郁相關的神經肽CRF、ACTH、UCN、AVP、VIP、CCK等的研究[24-26]。本研究中M組單個樣品的平均鑒定數為993條，比MF組多98條，M組制樣方法更適合于肽段的定性研究。不同的檢測儀器同樣能影響鑒定數，如文獻中報道使用LTQ Orbitrap Discovery檢測儀器時，單個樣品內源性肽段鑒定數僅為500多條[27]。不同的神經肽數據庫能鑒定到不同的特異性肽段[28]，swepep、neuropedia、neuropep數據庫鑒定到內源性肽段重復率低于80%，尤其swepep庫與neuropedia庫的重復率更低，因此對數據庫進行合并也能提高樣品的鑒定數。

對神經肽的翻譯后修飾我們也做了相關統計，共鑒定到37種翻譯后修飾，翻譯后修飾的內源性肽段有612條。37種翻譯后修飾中以酪氨酸、絲/蘇氨酸的磷酸化最為常見，共125條占總修飾肽段的20.4%，其次是酰胺化作用，共110條占總修飾肽段的18.0%。磷酸化作用可能與神經肽的激活有關[29]，從而影響自身或者其他神經肽的表達，酰胺化作用可能參與神經肽合成過程中的限速反應[30]，也能影響神經肽的表達。

在全腦荷爾蒙前體的鑒定中，內源性肽段鑒定數最多的是SCG2，SCG2具有促進血管再生、抑制內皮細胞凋亡、正性趨化嗜酸性粒細胞的作用。同一前體在不同腦區的鑒定數可能差異較大，如相關報道中[28]，SCG2、PENK在下丘腦中鑒定數分別為215、88條，與本研究中SCG2和PENK在全腦的鑒定數較接近，而在紋狀體中SCG2、PENK的鑒定數分別為41、102條，這種差異可能與不同腦區的不同功能有關。利用預測庫對全腦神經肽進行氨基酸序列的預測，有助于發現未注釋的神經肽，如果能對預測神經肽進行功能研究，將會更具有意義。

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