不同劑量FTY720對顱腦損傷大鼠神經功能的保護作用

林群 蔡建勇 吳艷 巴華君 陸川 陳獻東 陳茂華 戴君俠 孫軍

藥物是治療創傷性腦損傷的重要手段[1]，而抑制神經系統免疫反應是創傷性腦損傷藥物治療的重要機制[2]。FTY720是一種由冬蟲夏草抽提物中具有免疫作用的物質改造而成的新型免疫抑制劑[3]。它對免疫抑制具有雙向調節作用，在體內抑制免疫反應發生的同時不削弱機體對病毒的免疫應答及免疫記憶能力，進而不增加機體感染的發生率[4]。臨床試驗已經證實，FTY720可明顯改善多發性硬化癥的病情，且顯著抑制腎移植排斥反應[5]。筆者既往研究發現，FTY720可有效抑制顱腦損傷大鼠神經細胞凋亡和腦炎癥反應，進而改善腦損傷大鼠運動功能和認知功能[6-8]。然而，對FTY720的劑量療效關系尚未作進一步研究。故本研究采用不同劑量FTY720治療大鼠顱腦損傷，觀察其對大鼠腦炎癥反應、神經細胞凋亡和神經功能的影響，從而揭示其劑量療效關系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組及造模方法 80只健康雄性Wistar大鼠［南京大學模式動物研究所，雄性，清潔級，體重250～300g，實驗動物生產許可證 SCXK（蘇）2005-0003，使用許可證SYXK（蘇）2005-0004］。隨機分成假手術組、模型組、小劑量組和大劑量組，每組20只。大鼠予50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，采用Feeney自由落體損傷裝置制作大鼠顱腦損傷模型。假手術組大鼠切開頭皮，顱骨鉆孔后縫合頭皮，不作外力打擊。假手術組和模型組大鼠手術操作完成前0.5h腹腔注射1ml 0.9%氯化鈉注射液，小劑量組和大劑量組大鼠手術操作完成前0.5h分別按1、5mg/kg劑量腹腔注射FTY720（規格：25mg，批號：SML0700，美國Sigma公司）。在手術操作完成后24h，取每組大鼠10只，以80mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，斷頭處死，分離損傷皮層周邊腦組織。每組剩余10只大鼠留作神經功能評價。大鼠受外力打擊后有一過性的呼吸抑制，0.5h內基本恢復正常。各組大鼠手術操作后有少量死亡，大鼠死亡后補充成活大鼠，保證每組20只大鼠。

1.2 指標檢測 采用TUNEL法（TUNEL試劑盒購于中國武漢博士德生物工程有限公司，批號：MK1024）檢測大鼠損傷皮層凋亡神經細胞，細胞核染色呈棕黃色或棕紅色定義為細胞染色陽性，在Olympus-CH光學顯微鏡下計算10個高倍鏡視野，每個視野計數100個細胞，總計1 000個細胞，計算平均陽性率（%），即凋亡神經細胞比例。采用四肽熒光底物法檢測大鼠損傷皮層Caspase-3蛋白活性（Caspase-3蛋白活性檢測試劑盒購于美國Livemore公司，批號：T9281），以未加腦組織時的熒光強度為參照值，計算熒光強度，最終比較相對熒光強度。采用ELISA法測定大鼠腦組織TNF-α（試劑盒購于美國R&D公司，批號：MTA00B）、IL-1β（試劑盒購于美國R&D公司，批號：M6000B）和IL-6（試劑盒購于美國R&D公司，批號：MLB00C）水平，結果表示為pg/mg腦組織。

1.3 大鼠神經功能評價 參照Vorhees等[9]的方法，采用Morris水迷宮定位航行實驗在腦損傷后第8、9、10、11、12天記錄大鼠逃避潛伏期，逃避潛伏期越長表示大鼠認知功能越差。參考Chen等[10]的方法，在腦損傷后第 14、15、16、17、18 天測定大鼠改良神經功能缺損程度評分，評分范圍為0～18分，分值越高表示神經功能損傷越嚴重。

1.4 統計學處理 應用SPSS 19.0統計軟件。計量資料用表示，采用單變量方差分析比較4組大鼠逃避潛伏期、改良神經功能缺損程度評分，TNF-α、IL-1β和IL-6水平，神經細胞凋亡比例、Caspase-3蛋白活性；采用重復測量方差分析比較各組大鼠不同時點逃避潛伏期、改良神經功能缺損程度評分；組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FTY720對顱腦損傷大鼠逃避潛伏期的影響 在顱腦損傷后第 8、9、10、11、12 天，4 組大鼠逃避潛伏期比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；組間兩兩比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。各組大鼠不同時點逃避潛伏期比較，差異亦均有統計學意義（均P＜0.01）；且隨著藥物劑量升高，大鼠逃避潛伏期明顯縮短，藥效呈劑量依賴性（P＜0.01），見表1。

表1 FTY720對顱腦損傷大鼠逃避潛伏期的影響

2.2 FTY720對顱腦損傷大鼠改良神經功能缺損程度評分的影響 假手術組大鼠改良神經功能缺損程度評分均為最低分，即為0分。在顱腦損傷后第14、15、16、17、18天，3組大鼠改良神經功能缺損程度評分比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；組間兩兩比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。各組大鼠不同時點改良神經功能缺損程度評分比較，差異亦均有統計學意義（均P＜0.01）；且隨著藥物劑量升高，大鼠改良神經功能缺損程度評分明顯下降，藥效呈劑量依賴性（P＜0.01），見表 2。

表2 FTY720對顱腦損傷大鼠改良神經功能缺損程度評分的影響

2.3 FTY720對顱腦損傷大鼠損傷皮層炎性因子水平及凋亡相關指標的影響 假手術組、模型組、小劑量組和大劑量組大鼠損傷皮層IL-1β、TNF-α和IL-6水平以及Caspase-3蛋白活性、凋亡神經細胞比例比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；組間兩兩比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01），隨著藥物劑量升高，上述指標均明顯下降，藥效呈劑量依賴性，見表3和圖1。

表3 FTY720對顱腦損傷大鼠損傷皮層炎性因子水平及凋亡相關指標的影響

圖1 FTY720對顱腦損傷大鼠損傷皮層神經細胞凋亡的影響（TUNEL法，×100）

3 討論

創傷性腦損傷是一種嚴重的外傷形式，死亡率和致殘率均較高，預后往往不理想。外力觸發的繼發性腦損傷呈現瀑布式反應，涉及炎癥反應和細胞凋亡。腦外傷后，腦膠質細胞被激活，從而釋放包括TNF-α、IL-1β和IL-6在內的大量炎癥介質，進而激活凋亡蛋白Caspase-3。激活的Caspase-3能使許多與細胞結構、細胞周期及DNA修復等相關蛋白或激酶失活，從而使細胞凋亡[11-14]。因此，抑制炎癥反應、降低神經細胞凋亡可降低創傷性腦損傷，從而改善顱腦損傷的預后。

FTY720是最近幾年新開發的一種免疫抑制劑，屬于鞘氨醇-1-磷酸鹽受體阻滯劑[3]。FTY720誘導淋巴細胞凋亡，加速外周循環的成熟淋巴細胞歸巢和抑制T細胞從胸腺向外周血循環的轉移，從而選擇性減少外周循環淋巴細胞數，但并不損害對病毒的免疫應答及免疫記憶功能，毒副反應小[4]。目前，FTY720在臨床上的應用得到了推廣，已用于肝腎器官移植后的排斥反應及皮炎、重癥肌無力等免疫紊亂/障礙疾病的治療[5]。由于FTY720具有免疫抑制和調節作用，FTY720在其他炎癥性疾病中的作用也得到了重視。FTY20治療出血性、外傷性及缺血性腦損傷動物具有顯著效果，可抑制腦炎癥反應，減低神經細胞凋亡，改善神經功能[15-18]。筆者既往研究也證實了該藥對治療顱腦損傷大鼠具有顯著效果，可抑制神經炎癥反應，降低神經細胞凋亡，改善大鼠運動功能和認知功能[6-8]?？上У氖?，目前少有研究揭示FTY720用于治療實驗性腦損傷的劑量療效關系。既往研究常規選擇1mg/kg劑量治療動物腦損傷[6-8,15-18]，本研究設置1、5 mg/kg兩個劑量 FTY720腹腔注射治療大鼠創傷性腦損傷。研究結果顯示，兩個劑量的FTY20腹腔注射均顯著抑制大鼠損傷皮層神經細胞凋亡和Caspase-3活性，降低腦組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平，改善大鼠運動功能和認知功能。FTY720對抑制體外培養的膠質細胞分泌炎性因子具有顯著作用[19]，也可阻止大鼠創傷性腦損傷后炎性細胞在皮層的聚集[18]，同時抑制大鼠腦出血后腦內淋巴細胞浸潤[15]，從而表現出有效的中樞神經系統抗炎作用。FTY720在抑制大鼠短暫性腦缺血后神經細胞死亡和腦出血后腦水腫方面具有顯著效果，最終明顯改善了大鼠腦功能[16-17]。

以上數據結合本研究結果，筆者推測FTY720改善大鼠顱腦損傷后神經功能效果顯著，且存有療效-劑量依賴關系，而它的作用機制可能與FYT720抑制中樞神經系統炎癥反應從而降低神經細胞凋亡有關。

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