一種細菌紅色素的穩定性及結構的初步研究

邊名鴻，傅彬，左勇，葉碧霞，楊小龍，張晶

(四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000)

近年來，食品安全事件頻發，消費者的食品安全感也越來越低，甚至導致公眾嚴重的心理恐慌[1]。合成色素的違規添加是造成食品安全問題的重要因素之一，而色調自然、安全性高且具有較高生理及藥理作用的天然色素[2-6]，正逐漸受到人們的青睞。在歐洲等發達國家的食用色素中，天然色素已占有85%以上的份額，而我國每年生產的食用色素中90%為天然色素[7]。目前，國際市場上天然色素的銷售額正在以10%的速度增長，市場需求巨大，且需求量逐年上升，各國爭相開發生產，然而目前我國天然食用色素的開發生產遠不能滿足現代化工業發展的需要[8]，研究開發天然色素有著廣闊的市場前景。

一直以來，天然色素主要以植物色素為主，但其原料受季節、氣候、產地等因素的限制，且成本較高、質量不易控制等因素導致植物色素的產量及市場應用受到制約。而微生物色素能很好地克服植物色素的上述缺點，且已有成功先例[9]。微生物色素的生產將是解決植物色素產量低、成本高的有效途徑[10]。

與合成色素相比，大多數天然色素的穩定性較差，容易受到光照、溫度、金屬離子、氧化劑等因素的影響而導致其褪色，這是天然色素的應用受到阻礙的重要原因之一[11,12]。色素結構及官能團的改變是導致其褪色的主要因素，探究色素結構，對闡明色素褪色原理、指導護色研究有著重要意義。

本文對一種細菌紅色素的穩定性及結構進行初步研究，探究pH、溫度、光照、金屬離子、氧化劑、還原劑、常用食品添加劑等對該紅色素穩定性的影響，并對該紅色素官能團及分子量等進行研究，以期為該紅色素的進一步研究提供一定的理論依據。

1 材料及儀器

1.1 菌株

類芽孢桿菌(PaenibacillusagaridevoransXF-105)：保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M2014644。

1.2 主要儀器

PHS-3C酸度計 奧豪斯儀器(上海)有限公司；HLMJ-250恒溫恒濕箱 上海雷韻試驗儀器制造有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計 上海分析儀器總廠；TG-16臺式高速離心機 四川蜀科儀器有限公司；NICOLET 6700傅立葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Scientific公司；LC1100/MSD-VL液相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅色素粗品的制備

1.3.1.1 產紅色素菌株的培養

種子液的制備：從斜面上挑取2環菌體，接種到裝液量為100 mL/250 mL的種子培養基中(12層紗布蓋封口)，28 ℃，150 r/min條件下搖床培養24 h。

發酵液的制備：按照2%(V/V)的接種量將種子液接種到裝液量為100 mL/250 mL的發酵培養基中(12層紗布蓋封口)，調節初始pH為7.0，28 ℃，150 r/min條件下搖床培養48 h。

1.3.1.2 紅色素的提取

移取40 mL發酵液到50 mL離心管中，10000 r/min離心10 min，收集菌體。以固液比為1∶10(W/V)的比例加入95%乙醇，50 ℃水浴2 h，10000 r/min離心，棄沉淀，得到紅色素乙醇溶液。

利用旋轉蒸發儀濃縮紅色素乙醇溶液，自然涼干后即得到紅色素粗品。

1.3.2 紅色素的溶解性測定

各取10 mL乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、石油醚、丙酮、乙醇、甲醇、去離子水、正丁醇，分別加入0.01 g的紅色素粗品。靜置3 h，10000 r/min離心10 min后棄沉淀，觀察紅色素的溶解情況。

1.3.3 紅色素最大吸收波長掃描

取適宜濃度的紅色素乙醇溶液，用紫外-可見分光光度計對其進行光譜掃描，以無水乙醇為空白對照，掃描波長范圍為200～800 nm，確定其最大吸收波長。

1.3.4 溫度對紅色素穩定性的影響

各取10 mL適宜濃度的紅色素乙醇溶液置于試管中，將試管分別置于4，30，40，60，80，100 ℃水浴，每2 h測定1次吸光度。

1.3.5 pH對紅色素穩定性的影響

各取10 mL適宜濃度的紅色素乙醇溶液置于試管中，用2 mol/L的HCl和NaOH溶液調節pH分別為3，4，5，6，7，8，9，10，11，12。避光靜置3 h后，測定其吸光度并觀察顏色變化。

1.3.6 光照對紅色素穩定性的影響

各取10 mL適宜濃度的紅色素乙醇溶液置于試管中，分別置于室內、室外及紫外光照環境下，每隔一段時間測定樣品吸光度。

1.3.7 常用酸對紅色素穩定性的影響

各取10 mL適宜濃度的紅色素乙醇溶液置于試管中，分別按照濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L的量添加蘋果酸和檸檬酸。避光靜置3 h后，測定其吸光度。

1.3.8 氧化劑對紅色素穩定性的影響

稱取一定量紅色素粗品，配制成母液，分別移取1 mL母液到10 mL容量瓶中，分別按照濃度為1%，2%，3%，4%，5%的量添加H2O2(濃度為30%)，以95%乙醇定容。避光靜置3 h后，測定其吸光度。

1.3.9 還原劑對紅色素穩定性的影響

各取10 mL適宜濃度的紅色素乙醇溶液置于試管中，分別按照濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L的量添加Na2SO3和抗壞血酸。避光靜置3 h后，測定其吸光度。

1.3.10 常用食品添加劑對紅色素穩定性的影響

各取10 mL適宜濃度的紅色素乙醇溶液置于試管中，分別按照濃度為1，2，3，4，5 g/dL的量添加葡萄糖、蔗糖及苯甲酸鈉，避光靜置24 h后，測定其吸光度。

1.3.11 金屬離子對紅色素穩定性的影響

各取10 mL適宜濃度的紅色素乙醇溶液到試管中，分別加入BaCl2，LiCl，FeSO4，CaCl2，MnCl2，MgSO4，KCl，NaCl，使其濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/L。避光靜置3 h后，測定其吸光度。

1.3.12 紅色素的分離及純化

大孔樹脂的預處理(X-5型)：稱取5 g大孔樹脂(X-5型)，采用2倍體積95%乙醇浸泡24 h，后用去離子水洗滌至流出液不渾濁且無異味。

利用柱層析對紅色素進行分離純化。以X-5型大孔樹脂為固定相，采用乙酸乙酯-乙醇混合溶液洗脫(乙醇∶乙酸乙酯為1∶1)，層析柱口徑與柱長比為1∶40(V/V)，上樣條件參照文獻[13]進行。洗脫液經旋轉蒸發濃縮后，放置在通風櫥自然干燥。

1.3.13 硅膠薄層層析

取2塊硅膠薄層層析板(5 cm×10 cm)，放置在烘箱中105 ℃，活化30 min，取出后放置在干燥皿中自然冷卻后，用2B鉛筆分別在距離兩端1 cm處畫2條直線(中間間隔8 cm)。

將1.3.12分離后的得到的紅色素溶液點樣在活化后的硅膠薄層層析板上(其中一條直線上)，以不同層析液展開，觀察有色條帶情況，分析純化后的紅色素有色組分。

1.3.14 紅外光譜掃描

將上述1.3.12分離后得到的紅色素溶液干燥后，用無水乙醇重新溶解并送至四川理工學院分析測試中心進行紅外光譜掃描，掃描范圍為4000～400 cm-1。

1.3.15 紅色素質譜檢測

將薄層層析(1.3.13中)后的紅色素從層析板上刮下，用甲醇溶液溶解，經0.45 μm微孔濾膜過濾后送至四川理工學院分析測試中心經高效液相色譜進一步純化后進行質譜檢測。

分析柱流動相甲醇∶水為4∶1，流速為1 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為35 ℃。紫外檢測波長為503 nm。質譜條件：質譜采用ESI-MS對紅色素進行檢測，質量數掃描范圍110～1000，離子化模式：負態ES，毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：120 ℃；錐孔電壓：30 V；碰撞能：3 V。

2 結果及分析

2.1 紅色素的溶解性

取0.01 g紅色素粗品，加入10 mL不同溶劑，靜置3 h，觀察紅色素溶解情況，結果見表1。

表1 紅色素溶解情況Table 1 The solubility analysis of the red pigment

注：“+”表示可溶，“-”表示不溶或微溶。

由表1可知，該紅色素能溶解在乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、石油醚、丙酮、甲醇、乙醇中，不溶于水以及正丁醇，說明該紅色素為脂溶性色素。

2.2 紅色素的全波長掃描

利用紫外分光光度計對紅色素乙醇溶液進行全波長掃描，掃描結果見圖1。

圖1 紅色素的全波長掃描Fig.1 The full wavelength scanning map of the red pigment

由圖1可知，該紅色素乙醇溶液在波長為503 nm處有最大吸收峰且沒有其他明顯的吸收峰。說明該紅色素在乙醇溶液中的最大吸收波長為503 nm。

2.3 溫度對紅色素穩定性的影響

將相同濃度的紅色素乙醇溶液置于不同溫度條件下，探究溫度對紅色素穩定性的影響，試驗結果見圖2。

圖2 溫度對紅色素穩定性的影響Fig.2 Effect of the temperature on the stability of the red pigment

由圖2可知，在設定溫度下4 h內該紅色素都表現出較好的穩定性；80，100 ℃溫度下，超過4 h后，OD值下降較為明顯，但顏色變化較小。說明該紅色素在較高的溫度環境下，短時間內其穩定性較好，隨著時間的延長，紅色素穩定性也逐漸降低。

2.4 pH對紅色素穩定性的影響

將不同pH的紅色素乙醇溶液避光靜置3 h后測定其OD503并觀察其顏色變化情況，探究pH對紅色素穩定性的影響，結果見表2。

表2 pH對紅色素穩定性的影響Table 2 Effect of the pH on the stability of the red pigment

由表2可知，當pH在3～12范圍內紅色素乙醇溶液的OD503均差異不大，且肉眼觀察紅色素顏色也無明顯變化。說明pH對該紅色素穩定性的影響較小，該紅色素在酸性、中性及堿性環境下均保持良好的穩定性。

2.5 光照對紅色素穩定性的影響

將濃度相同的紅色素乙醇溶液放置在室內、室外自然光及紫外光照射環境下處理，以探究不同光照對紅色素穩定性的影響，結果見圖3。

圖3 日光及紫外照射對紅色素穩定性的影響Fig.3 Effect of sunshine and UV irradiation on the stabilityof the red pigment

由圖3可知，在室外強光照射下紅色素的穩定性最差，照射2 h紅色素幾乎完全褪色。紫外光照射8 h，紅色素的損失率達到了62.18%，在室內散射光照射下，該紅色素的OD503變化不大。說明該紅色素對自然散射光照穩定性較好，而對強自然光及紫外光照穩定性較差，可能是因為短波長光對紅色素結構的破壞作用較大，該紅色素不適宜在強光環境下使用。

2.6 常用酸對紅色素穩定性的影響

將含有不同濃度的蘋果酸和檸檬酸的紅色素乙醇溶液，避光靜置3 h后測定OD503，以探究常用酸對紅色素穩定性的影響，試驗結果見圖4。

圖4 常用酸對紅色素穩定性的影響Fig.4 Effect of the acid on the stability of the red pigment

由圖4可知，隨著蘋果酸濃度的增加，紅色素的OD503逐漸降低，檸檬酸濃度越高，紅色素的OD503反而越大，但紅色素的OD503變化均不大。說明該紅色素對上述2種酸的穩定性較好，且蘋果酸對紅色素有一定的破壞作用，檸檬酸對該紅色素有一定的護色作用。

2.7 氧化劑對紅色素穩定性的影響

以H2O2為氧化劑，調節紅色素乙醇溶液H2O2濃度，避光靜置3 h，測定紅色素乙醇溶液的OD503，以研究氧化劑對紅色素穩定性的影響，試驗結果見圖5。

圖5 氧化劑對紅色素穩定性的影響Fig.5 Effect of the oxidant on the stability of the red pigment

由圖5可知，隨著H2O2濃度的增加，紅色素乙醇溶液的OD503緩慢降低，且肉眼觀察紅色素溶液顏色差異不大，說明H2O2對紅色素穩定性的影響較小，該紅色素對氧化劑較穩定。

2.8 還原劑對紅色素穩定性的影響

將含有不同濃度抗壞血酸和亞硫酸鈉的紅色素乙醇溶液避光靜置3 h后測定OD503，以探究還原劑對紅色素穩定性的影響，試驗結果見圖6。

圖6 還原劑對紅色素穩定性的影響Fig.6 Effect of the reducing agent on the stability of the red pigment

由圖6可知，與空白比較，還原劑的添加對紅色素的穩定性有一定影響，且隨著還原劑濃度的增加，紅色素的OD503有小幅度的下降，但肉眼觀察紅色素乙醇溶液的顏色沒有明顯變化。說明該紅色素對抗壞血酸和亞硫酸鈉均較穩定。

2.9 常用食品添加劑對紅色素穩定性的影響

將含有不同濃度葡萄糖、蔗糖、苯甲酸鈉的紅色素乙醇溶液避光靜置24 h后測定OD503，以探究常有食品添加劑對紅色素穩定性的影響，試驗結果見圖7。

圖7 常用食品添加劑對紅色素穩定性的影響Fig.7 Effect of the food additives on the stability of the red pigment

由圖7可知，隨著食品添加劑濃度的增加，紅色素OD503均有小幅度的下降趨勢，肉眼觀察紅色素乙醇溶液顏色無明顯變化，當苯甲酸鈉濃度高于0.4 g/dL時，紅色素的OD503變化較明顯。說明該紅色素對蔗糖、葡萄糖以及苯甲酸鈉的穩定性均較好，能夠與上述食品添加劑混合使用。

2.10 金屬離子對紅色素穩定性的影響

將含有不同濃度各金屬鹽的紅色素乙醇溶液避光靜置3 h，然后測定其OD503以探究金屬離子對紅色素穩定性的影響，試驗結果見圖8。

圖8 金屬離子對紅色素穩定性的影響Fig.8 Effect of the metal ions on the stability of the red pigment

由圖8可知，隨著金屬離子濃度的增加，色素吸光值都有不同程度的下降，其中Mg2+，K+，Na+對紅色素吸光值基本沒有影響，Mn2+，Ca2+，Ba2+，Fe2+等重金屬離子對紅色素都有不同程度的消色作用。其中Fe2+離子濃度低于0.3 g/L時，對紅色素穩定性的影響不大，但當其濃度高于0.3 g/L時，紅色素的OD503下降較快，且肉眼觀察紅色素乙醇溶液顏色變淺?？赡苁且驗镕e2+有較強的還原性，導致紅色素的部分結構被還原，從而導致紅色素褪色。

2.11 TLC結果

將紅色素乙醇溶液點樣在硅膠薄層層析板上，以不同層析液展開，試驗結果見表3和圖9。

表3 薄層層析部分展開結果Table 3 TLC partially expanded results

圖9 紅色素的成分分離圖Fig.9 Composition separation diagram of red pigment

以二氯甲烷∶乙酸乙酯∶乙醇為1∶1∶1為層析液，展開距離7.6 cm(總距離為8 cm)，Rf約為0.95，展開距離較大。以二氯甲烷∶乙酸乙酯為1∶1為層析液，展開距離為5.7 cm，Rf約為0.71，展開距離合適。由圖9可知，采用不同的層析液紅色素均有一條紅色條帶，說明經純化后的紅色素成分較單一。

2.12 紅外光譜掃描

將純化后的紅色素，用乙醇溶解后，利用紅外光譜進行掃描，試驗結果見圖10。

圖10 紅色素的紅外光譜圖Fig.10 Infrared spectrogram of red pigment

2.13 紅色素質譜分析

純化后的紅色素甲醇溶液，經高效液相色譜進一步純化后，采用質譜檢測其分子量，試驗結果見圖11。

圖11 紅色素的質譜圖Fig.11 Mass spectrum of red pigment

細菌紅色素的負離子模式質譜圖顯示[M-H]=339.1的準分子離子峰，確定其相對分子質量為340.1。

3 結論

參考文獻：

[1]王靜,孫寶國.食品添加劑與食品安全[J].科學通報，2013，58(26)：2619-2625.

[2]Chen Deming,Han Yonbin,Gu Zhenxin,et al.Application of statistical methodology to the optimization of fermentative medium for carotenoids production byRhodobactersphaeroides[J].Process Biochemistry,2006,41:1773-1778.

[3]Chih-Hsiang Changa,Chi-Kang Tsaia,Tzu-Tai Leeb,et al.Targeted delivery of biosynthetic lycopene by the bacterial carrier[J].Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers，2016,59:91-97.

[4]Giovannucci E.Tomatoes,tomato-based products,lycopene,and cancer: review of the epidemiologic literature[J].J Natl Cancer Inst,1999,91:317.

[5]張銳.紅曲霉液態發酵生產紅曲色素的工藝優化[J].生物技術通報,2015,31(2):187-195.

[6]Rodrigues A L,Trachtmann N,Becker J,et a1.Systems metabolic engineering ofEscherichiacolifor production of the antitumor drugs violacein and deoxyviolacein[J].Metabolic Engineering,2013,20(5):493-498.

[7]苗璇.食用天然色素研究應用現狀及其發展前景展望[J].化工管理,2013(5):5-9.

[8]呂幫玉,楊新河,毛清黎,等.我國天然食用色素的開發現狀與前景[J].江西農業學報,2007,19(10):108-110.

[9]Feng Yanli，Shao Yanchun，Chen Fusheng,et al.Monascuspigments[J].Appl Microbiol Biotechnol,2012,96:1421-1440.

[10]Dufossé L.Microbial production of food grade pigments[J].Food Technology and Biotechnology,2006,44:313-321.

[11]Onur Güneser.Pigment and color stability of beetroot betalains in cow milk during thermal treatment[J].Food Chemistry,2016,196:220-227.

[12]牛世全,韓彩虹,胡蛟龍,等.一株產藍色素放線菌的分離、鑒定及其色素穩定性初步研究[J].食品工業科技,2016,37(1):134-137.

[13]范碧琴,杜靜君,趙桃,等.大孔樹脂分離純化洛神花花色苷的研究[J].食品工業科技,2015(1)：220-225.

[14]王昌祿,鄭傳寶,陳勉華,等.產粉紅色素紅曲霉M4菌株發酵培養基的優化[J].氨基酸和生物資源,2010,32(2):26-29.