副粘病毒膜融合機制的研究進展

遲苗苗 王志玉

250012濟南,山東大學公共衛生學院病毒學研究室

副粘病毒是一科重要的人類致病病毒,為有包膜不分節段的單股負鏈RNA病毒。該科病毒包括[1]麻疹病毒(meals virus,MeV)、腮腺炎病毒(mumps virus,MuV)、副流感病毒(parainfluenza viruses,PIVs)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)、人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)及亨德拉病毒(hendra viruse,HeV)和尼帕病毒(nipah viruse,NiV)等。其中的MeV只感染人類,盡管具備安全可行的疫苗,全球每年仍有超過12萬的兒童受到感染而死亡。NDV可引發家禽烈性傳染病,造成巨大的經濟損失,還可造成人類結膜炎感染。HeV和NiV是一種新發人獸共患病的病原體,其病死率可高達90%。新發傳染病監測在蝙蝠體內新發現了66種副粘病毒[1],雖然目前的致病情況尚不清楚,但具有很大的致病威脅。所以研究其致病機制和防治對策仍是當務之急,以便疫情發生時從容應對。

副粘病毒的病毒包膜與細胞膜融合后,病毒核酸-蛋白復合物釋放進入靶細胞啟動感染。膜融合是病毒完成細胞入侵并進行細胞間傳播的重要機制。除肺病毒亞科(RSV和hMPV)外,大多數副粘病毒的膜融合過程需要融合蛋白(Fusion protein,F)和吸附蛋白的共同參與。吸附蛋白與細胞表面的受體結合后,可以激活F蛋白,后者進行一系列的構象改變來完成病毒包膜與細胞膜及細胞膜之間的融合。但是,吸附蛋白如何將受體信號傳遞給F蛋白,并激活F蛋白,引發細胞融合?其確切機制尚不清楚。副粘病毒膜融合發生的過程及其參與組分提示吸附蛋白、F蛋白及二者之間的相互作用可能造成了副粘病毒膜融合機制的不同,本研究從吸附蛋白及F蛋白的結構功能闡述入手,進而對比不同吸附蛋白參與的膜融合過程的機制差異,以期為該屬病毒的致病研究和疫苗研發策略提供線索。

1 F蛋白

副粘病毒的F蛋白是I型跨膜糖蛋白,由N端胞外段、跨膜區、和胞內C端尾區組成,胞外段含有融合肽和疏水重復區。F蛋白最初合成的是非活化形式的蛋白前體F0,經加工修飾后被宿主細胞蛋白酶裂解為二硫鍵連接的F1和F2。F蛋白以三聚體形式存在,其融合中心由疏水性重復單位HRA與HRB組成,HRA位于F1的N端,HRB位于C端。F蛋白激活后,其N端鄰近HRA的融合肽(fusion peptide,FP)暴露并插入靶細胞膜形成發卡形狀的融合前中間體(Pre-hairpin intermediate conformation,PHI)[2]。緊接著,兩個疏水重復區HR1與HR2相互結合形成6聚疏水螺旋束(Six-helix bundle,6HB),誘導膜融合[3]。雖然蛋白結構和誘導融合時的構象改變較為統一,但是不同副粘病毒的F蛋白誘導膜融合的機制存在差異。Xu等[4]研究發現,NiV的F蛋白融合前構象為F蛋白的六聚體,通過六聚體內的F蛋白間相互激活來誘導膜融合的級聯反應。對于肺病毒亞科(RSV和hMPV)而言,F蛋白可能同時具有受體識別和膜融合功能,其膜融合機制更具特殊性。

2 吸附蛋白

副粘病毒的吸附蛋白根據功能和病毒來源的不同分為3類：血凝素神經氨酸酶(hemagglutininneuraminidase,HN)、麻疹病毒屬的血凝素(hemagglutinin,H)和來自亨尼帕病毒的糖蛋白(glycoprotein,G)。HN/H/G均為Ⅱ型跨膜糖蛋白,胞外域包含靠近胞膜端的N端頸部和C端的球狀受體結合區(receptor binding domain,RBD)。RBD區包含6個片層β折疊結構,可以識別受體,從而進行結構適應和變化。HN/H/G均為四聚體,具有相似的結構。盡管結構相對保守,副粘病毒的吸附蛋白仍有很多不同之處,例如,RSV-G和hMPV-G,比其他副粘病毒的吸附蛋白要小[4]。對多數副粘病毒而言,吸附蛋白是F激活的前提條件,但PIV5-

HN與RSV-G僅起到促進融合作用,hMPV-G對融合過程沒有影響[5]。HN/H/G識別宿主細胞的受體類型不同。HN識別唾液酸,H/G識別蛋白類受體,但是RSV-G和hMPV-G可能并不參與受體識別[4]。受體類型可能決定著HN/H/G-F相互作用及其調節膜融合的過程。

3 膜融合機制

3.1 F蛋白介導的膜融合過程絕大多數的副粘病毒的F蛋白需要吸附蛋白的協同作用來完成病毒包膜與靶細胞膜的融合,進而釋放遺傳物質進入靶細胞,啟始感染。F蛋白介導的膜融合是副粘病毒生命周期中很重要的一個環節,膜融合過程中的幾個關鍵步驟已經被確認[5]。早期步驟包括：HN/H/G結合受體、HN/H/G的構象改變、激活F蛋白進行構象改變引發膜融合。后期步驟有：融合小孔的形成與擴大。膜融合早期,吸附蛋白結合受體激活F蛋白對于融合的起始至關重要。膜融合的后續步驟主要依靠激活后的F蛋白不可逆的構象改變來實現。

3.2 膜融合中F蛋白的構象變化隨著F蛋白融合前和融合后構象的晶體結構的獲取,我們對副粘病毒F蛋白介導的膜融合的過程的了解逐漸清晰。對比目前已知的F蛋白融合前后構象發現,融合前構象更像圓形,而融合后構象球狀頭部呈角狀[5]。融合前的F蛋白,HRA由一系列短的螺旋構成,呈球狀,HRB為C端頸部,通過跨膜區連著胞內尾端。一旦切割和活化,HRA區由一系列的螺旋結構轉化為舒展的長107?的三聚卷曲螺旋。該舒展狀態可能是融合肽插入靶細胞膜的時刻,在電鏡下觀察到此時的F蛋白將兩個細胞膜拉近至210?[6]。隨著融合肽插入靶細胞膜,HRB以反平行方式重新定位于HRA溝槽中,形成穩定的6HB,從而合并相鄰胞膜,并促進融合孔的打開。融合孔的形成可能需要多個F蛋白進行協同構象改變來跨越膜融合的能量障礙[3]。

3.3 F-HN/G/H的相互作用與膜融合免疫共沉淀和實時熒光互補技術[7]均顯示膜融合過程中二者之間存在相互作用。盡管尚未獲得副粘病毒吸附蛋白與F蛋白相互作用的直觀結構學數據,已獲取的功能研究結果均顯示這一相互作用對于副粘病毒屬的融合激活很重要。

3.3.1 相互作用的區別：F-HN/G/H相互作用的細胞內發生位置、持續時間、強度等區別很大(見表1)。病毒顆粒負染電鏡觀察和低溫電子顯微鏡斷層成像技術結果顯示,hPIV3[8]在結合受體前,細胞膜表面存在HN-F短暫的相互作用,但不足以激活F,受體結合傳遞信號才啟動了F蛋白激活。H/G-F在受體結合前乃至合成轉運過程中[9]已形成復合物,直到H/G結合受體后發生構象改變并暴露頸部的關鍵氨基酸,F才被激活并與H/G解離,然后F介導膜融合發生。相互作用的強度與融合活性之間的關聯在不同病毒之間存在一定差異。某些HN/H/G突變體,其融合功能喪失,同時相互作用被阻斷[10-13]。對于NiV和MeV,突變分析顯示F-G/H相互作用強度與融合程度成負相關關系[14-15]。NDV HN頸部的第69和第77位點引入糖基化使得融合減弱也使F-HN相互作用減弱,hPIV3的H552Q突變體增強融合并伴隨HN-F相互作用的增加,表明融合程度與F-HN的相互作用呈正相關[16]。但這種相關關系存在一些例外。NDV HN的頸部點突變體L97 A雖然減弱了融合程度,但是未影響F-HN的相互作用[17]；MeV H的I118C減弱了相互作用,但并未影響膜融合[12],NiV G的頸部第159位糖基化位點移除,雖然廢除了融合但是未明顯減弱G-F相互作用[18]。這說明相互作用的確切機制,相互作用如何與HN/G/H識別的受體信號及F誘導的膜融合相關聯仍有待進一步揭示。

3.3.2 相互作用的模型：根據F-HN/G/H相互作用的區別,目前有兩種解釋模型[5]：夾鉗模型(“dissociation” or “clamp” model)和破壞模型(“association” or“provocateur” model)。 夾鉗模型認為,F蛋白同吸附蛋白在胞內相互作用,以復合物形式轉運至細胞表面,當吸附蛋白結合受體后,F蛋白被釋放,啟動膜融合。破壞模型認為,吸附蛋白結合受體后主動引發亞穩態的融合前構象的F蛋白去穩態。去穩態和F激活均可以被加熱替代,因此F-HN/H/G相互作用克服了F激活的能量障礙。兩種模型最大的不同是前者認為吸附蛋白可以穩定F的融合前構象,而在破壞模型中吸附蛋白則激發融合前F蛋白的構象改變。目前的研究認為F-G/H的相互作用通過夾鉗模式穩定F蛋白,而F-HN相互作用則使得F蛋白去穩態并激活引發融合。

但是當前有許多與模型假設不符的證據出現。F蛋白可以以融合前構象單獨表達而不需要吸附蛋白來穩定[19-20],說明參與F-H/G/HN相互作用的融合前構象的F蛋白不需要吸附蛋白的“夾鉗作用”來穩定。而且加熱又可以作為外來能量激活F蛋白誘導膜融合[21],這與破壞模型中的加熱可以克服亞穩態F的能量障礙的說法相一致。這些都表明識別受體前的F-HN/H/G相互作用對于穩定融合前構象并非如夾鉗模型認為的那樣是必須的。相反,這種識別受體前的相互作用可能對蛋白的正確折疊,胞內運輸或增加可激活復合物濃度是必須的[9]。

表1 HN/H/G-F的相互作用比較Tab.1 Comparison of HN/H/G-F interaction

3.4 F蛋白的激活機制模型有人針對F激活過程總結了5種模型[5],值得注意的是這些模型并非相互獨立。兩個或多個模型可能適用于同一種副粘病毒。更多的結構和功能數據尤其是HN/G/H-F相互作用方面,將有助于進一步描述和證實這些模型。

3.4.1 頸部暴露模型：目前較為認可的觀點是頸部暴露模型(stalk exposure model),即吸附蛋白結合受體后會暴露出頸部激活F蛋白的區域[22],這一點在多項有關截短頭部的頸部吸附蛋白可以激活其同源F蛋白的研究中被證實。目前發現,F蛋白誘導的膜融合可以同樣被不含頭部區域的MeV H蛋白[23]、NiV G蛋白[24]、MuV HN蛋白和NDV HN蛋白誘導[22]。因此頸部激活是HN/H/G的一個共性。目前的研究已經初步定位了HN-F相互作用的區域[22],但是為什么只有特定長度的頸部可以激活F仍然不清楚[22]為什么MeV H的單獨頸部引入穩定基團后才能引發融合[23]?為什么NDV HN引入二硫鍵穩定頸部后卻抑制了融合發生[22]?都需要進一步深入研究。

與功能研究結果一致,HN的晶體學結構研究可以合理解釋頸部暴露激活模型。在識別受體之前,HN/H/G的頭部可以抑制F蛋白靠近其頸部的F激活區。吸附蛋白可能通過其頭部相對于其頸部4HB的空間排列方式來實現這一抑制效果,類似于NDV HN蛋白頭部的四聚體下垂模型(4 headsdown)的排列方式[25]。識別受體后,吸附蛋白頭部結構重排,構象變得接近于PIV5 HN蛋白頭部的四聚體抬舉模型(4-heads up)的排列方式或PIV5 HN蛋白的二聚體抬舉二聚體下垂的中間態模型(2 heads up-2 heads down)的排列方式[26]。這些構象變化使得吸附蛋白頸部的F激活區暴露,進而激活F蛋白進行構象改變并誘導膜融合。值得注意的是,在沒有結合受體時,hPIV3[8]就存在“頭部抬舉”的HN和F的相互聯系,這說明吸附蛋白的構象變化可能存在不依賴受體結合的途徑,需要進一步的研究。

3.4.2 頸部暴露模型中的相互作用調節機制：深入的研究發現不同的副粘病毒的吸附蛋白HN/H/G通過不同的機制來調節頸部暴露之前F蛋白與吸附蛋白的相互靠近。與F-HN初次相互作用發生在細胞表面不同,F-G/H復合物在受體結合前甚至是轉運至細胞表面過程中[9]已經存在。受體結合前出現的F-G/H復合物可以增加F-G/H相互作用的效率,同時也增加了不恰當的F蛋白激活的危險。因此其調節相對復雜。

3.4.2.1 頭部抑制：最近的研究顯示HN/H/G蛋白的頭部可以主動抑制其頸部對F蛋白的激活。識別受體后,HN/H/G蛋白球狀頭部進行構象改變,暴露F激活區并解除對頸部的抑制作用,接下來,頸部進行構象改變進而引發F激活。在結合受體前的4 heads-down構象時,F-H/G存在初始相互作用可能是因為其單體在頭部下垂時暴露出的頸部區域與NDV HN及PIV5 HN不同,即4 heads-down構象時,F蛋白與H/G蛋白頸部的接觸程度不同于HN[24,27-28]。

該模型可以很好地解釋為什么HN/G/H蛋白通過不同的位點識別不同的信號卻導致一致的效應,即激活F蛋白誘導膜融合。

3.4.2.2 頸部C端近頭部的連接區域：除了頸部暴露外,HN/G/H蛋白頸部近C端參與了F蛋白的激活調節[9,24,28-29]。研究顯示,F-G/H的作用區相對于F-HN更為寬泛[24,30-32],但是又與HN存在線性重疊部分。H/G頸部C端近頭部的連接區域含有某種結構穩定區參與調節F蛋白的激活[15,24]。結合受體前的F-G/H相互作用可能通過該區實現[28]。這一寬泛的F-H/G接觸區可能為F-H/G相互作用如何被調控及F蛋白的不恰當激活如何被阻止提供研究線索。但具體的F-H/G復合物如何阻止不恰當的F-H/G相互作用發生尚需進一步探討。

4 結語與展望

當前有關副粘病毒的膜融合機制僅限于在實驗突變分析數據基礎上結合吸附蛋白與F蛋白的晶體結構進行推測擬合出模型,但具體的膜融合過程尚不能被清楚地展示出來。探索不同副粘病毒膜融合的共性與差異,有賴于使用高分辨率的冷凍電鏡成像技術,在病毒水平直觀捕獲并描述HN/G/H-F復合物的共結晶結構來闡述二者在副粘病毒感染引發的膜融合過程中發揮的具體作用。膜融合機制的深入研究將為藥物靶點設計和疫苗研究奠定基礎。

利益沖突無